肌萎缩侧索硬化（ALS）单细胞与空间转录组联合分析揭示外周至中枢免疫浸润与重编程

《Nature Neuroscience》：Integrated single-cell and spatial transcriptomic profiling in ALS uncovers peripheral-to-central immune infiltration and reprogramming

　　

肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致命的神经退行性疾病，以大脑和脊髓中的运动神经元（motor neuron, MN）进行性退变为特征。尽管神经炎症日益被认为是ALS的标志，但连接免疫反应与MN病理的精确分子程序仍不清楚。研究人员采用结合单细胞（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、批量RNA测序（bulk RNA-seq）与空间蛋白质基因组学（spatial proteogenomics）的综合方法，对散发性ALS（sporadic ALS, sALS）和携带C9orf72重复扩增（C9orf72 repeat expansions）患者的外周血和脊髓组织中的共享及独特免疫动态进行了表征。分析揭示了C9orf72 ALS中广泛的免疫重塑、单核细胞激活中的ALS亚型特异性及进展相关差异，以及具有抗原驱动反应克隆特征的抗原经验性CD8+效应记忆T细胞（antigen-experienced CD8+effector memory T cells）。空间定位揭示了补体激活和脂质编程的髓系状态汇聚于MN丢失和TDP-43病理部位。这些发现将外周和中枢免疫改变与ALS异质性联系起来，并强调了分层免疫调节（stratified immunomodulation）作为潜在治疗策略的重要性。

研究背景与问题

肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致命的神经退行性疾病，主要病理特征为脊髓、脑干和运动皮层中运动神经元（motor neuron, MN）的进行性丧失，导致肌肉无力、痉挛、瘫痪，最终因呼吸衰竭致死。尽管研究广泛，其发病机制仍未完全阐明。目前，神经炎症被认为是ALS病理生理学的核心特征，表现为小胶质细胞激活、星形胶质细胞功能障碍以及外周免疫细胞（如T细胞、单核细胞）浸润中枢神经系统（CNS）。然而，免疫激活与MN病理之间的空间关系，特别是在散发性ALS（sALS）与家族性ALS（fALS，尤其是C9orf72突变型）之间的差异，尚未得到清晰解析。此外，外周免疫系统如何参与CNS内的病变过程，以及不同ALS亚型（如快进展与慢进展）的免疫特征有何不同，均是亟待解决的问题。

研究概况与方法概述

为填补上述空白，研究团队在《Nature Neuroscience》上发表了题为“Integrated single-cell and spatial transcriptomic profiling in ALS uncovers peripheral-to-central immune infiltration and reprogramming”的研究。该研究整合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、批量RNA测序（bulk RNA-seq）以及空间蛋白质基因组学（Spatial Proteogenomics, SP）技术，对sALS和C9orf72-ALS（C9-ALS）患者的外周血单核细胞（PBMCs）及CNS组织（脊髓）进行了多组学分析。研究旨在系统描绘ALS的免疫景观，揭示不同亚型间的分子差异，并探索免疫细胞在病变组织中的空间定位。

关键技术方法概述：

研究队列包括22例ALS患者（18例sALS，4例C9-ALS）及18例健康对照（HCs），其中sALS进一步按疾病进展速度分为快进展（sALS-fast）与慢进展（sALS-slow）亚组。技术层面，研究采用CRISPR技术增强scRNA-seq中高价值转录本的检测，利用Harmony算法整合细胞聚类，并通过空间蛋白质基因组学对脊髓组织进行高分辨率成像，以定位免疫细胞与病理蛋白（如TDP-43）的空间关系。

研究结果详解

外周免疫失调在sALS与C9-ALS中的表现

研究人员首先对PBMCs进行scRNA-seq分析，发现尽管免疫细胞群体比例在ALS与HC间无显著变化，但转录组水平存在显著差异。C9-ALS患者表现出最广泛的转录改变，且C9orf72基因在CD16⁺单核细胞、记忆B细胞等群体中表达下调，提示单倍体不足（haploinsufficiency）影响外周免疫。

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  单核细胞是关键失调群体：先天免疫细胞（尤其是单核细胞）是差异表达基因（DEGs）最富集的群体。CD16⁺单核细胞在sALS中转录失调更明显，而CD14⁺单核细胞在C9-ALS中改变更显著。
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  sALS进展相关的补体激活：在sALS-fast患者的CD16⁺单核细胞中，补体基因C1QA、C1QB以及MSR1、IFITM3等促炎基因显著上调，提示补体系统激活与疾病快速进展相关。
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  C9-ALS的特有签名：C9-ALS患者的CD14⁺单核细胞高表达CLEC7A、TRIB1及EGR1/EGR3等基因，而sALS则高表达CCL3/CCL3L1等趋化因子，表明两者具有不同的先天免疫激活通路。
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  通路富集特征：ALS患者先天免疫细胞整体表现为氧化磷酸化（OXPHOS）增强、干扰素-γ（IFN-γ）信号减弱；sALS的CD14⁺单核细胞还富集了活性氧（ROS）与缺氧通路。

T细胞克隆扩增与抗原经历特征

除了髓系细胞，研究还发现ALS患者外周血中存在抗原经验性CD8⁺效应记忆T细胞（T_EM）的扩增，这些细胞高表达细胞毒性分子（如GZMB、PRF1）和归巢受体（如CX3CR1、CXCR6），并表现出克隆性扩增特征，提示其可能识别特定抗原并参与CNS浸润。在C9-ALS中，T细胞受体（TCR）克隆型更集中，且与脊髓中的T细胞克隆重叠，支持外周T细胞向CNS迁移的假说。

脊髓免疫景观与空间定位

通过对sALS和C9-ALS患者脊髓组织的scRNA-seq分析，研究人员鉴定出多种免疫细胞类型，包括小胶质细胞、巨噬细胞、T细胞等，并发现C9-ALS脊髓中脂质相关巨噬细胞（lipid-associated macrophages）比例更高。空间蛋白质基因组学分析进一步揭示：

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  补体与髓系细胞共定位：补体成分C1q、C3以及脂质编程的髓系细胞（表达APOE、TREM2）在MN丢失区域和TDP-43病理斑块周围富集。
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  T细胞浸润：CD8⁺T细胞在病变脊髓中聚集，并与MN和突触区域相邻，提示其直接参与细胞毒性损伤。

外周与中枢的免疫关联

通过整合外周血与脊髓的数据，研究发现外周单核细胞中上调的基因（如C1Q、APOE）在脊髓髓系细胞中同样高表达，且外周T细胞克隆与脊髓T细胞克隆存在重叠，证实了外周免疫与CNS病理的联动。这一发现为ALS的免疫病理机制提供了直接证据，并提示外周免疫标志物可能反映CNS内的疾病活动。

讨论与结论

本研究通过多组学整合分析，系统揭示了ALS中从外周免疫失调到中枢免疫浸润的完整链条。主要结论包括：

1. 1.
   亚型特异性免疫特征：sALS-fast与补体激活相关，C9-ALS与干扰素信号及脂质代谢重编程相关。
2. 2.
   T细胞介导的免疫攻击：抗原驱动的CD8⁺T_EM细胞克隆扩增并浸润CNS，可能直接参与MN损伤。
3. 3.
   空间病理学的突破：补体和脂质相关髓系细胞在MN丢失区域的空间汇聚，为理解神经炎症的局部效应提供了新视角。

这些发现不仅深化了对ALS异质性的认识，也为开发分层免疫疗法（如针对补体、T细胞或脂质代谢的靶向治疗）提供了理论依据。研究建立的综合转录组资源为未来ALS的免疫学研究和治疗策略设计提供了重要基础。