Bu-Fei Yi-Shen配方可缓解氧化应激，改善慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的气道上皮屏障功能障碍

《International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease》：Bu-Fei Yi-Shen Formula Alleviates Oxidative Stress and Improves Airway Epithelial Barrier Dysfunction in COPD

　　**摘要**
**目的** 本研究旨在探讨 Bufei Yishen 方剂（BYF）在改善慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者气道上皮屏障功能障碍方面的潜力，并阐明其作用机制。
**方法** 通过建立 COPD 的体内和体外模型，本研究检测了肺功能、肺组织病理学变化、炎症细胞因子水平、细胞凋亡率、氧化应激强度以及气道上皮通透性（TEER）。同时，还量化了与顶端连接、细胞凋亡和 Nrf2 信号通路相关的蛋白质表达水平。这些详尽的分析旨在揭示 BYF 如何改善 COPD 中气道上皮屏障完整性的破坏机制。
**结果** BYF 显著改善了肺功能，减轻了肺组织病理损伤，降低了炎症细胞因子水平，抑制了细胞凋亡，增强了顶端连接蛋白的表达，并减轻了氧化应激损伤。在体外实验中，BYF 恢复了 CSE 诱导的 BEAS-2B 细胞 TEER 值和顶端连接蛋白表达的下降，同时减少了气道上皮细胞的凋亡和氧化应激损伤。此外，BYF 缓解了 CSE 对 Nrf2 的抑制作用，促进了 Nrf2 下游蛋白 HO-1 的表达。ML385 的添加加剧了 CSE 诱导的细胞凋亡、氧化应激和屏障功能障碍；然而，ML385 与 BYF 的联合使用逆转了 ML385 的抑制效应。
**结论** 这些发现表明，BYF 通过激活 Nrf2/HO-1 信号通路来改善 COPD 中的气道上皮屏障功能障碍。

**图形摘要**
- 左图：BYF 促进 Nrf2 从 Keap1 中释放，使其进入细胞核并激活抗氧化基因，这些基因抑制氧化应激。
- 中间上部：香烟烟雾引发氧化应激，增加活性氧（ROS）并触发细胞凋亡，导致屏障损伤；抗氧化基因的红色抑制线表示氧化应激的抑制作用。
- 右图：框内插图显示了受屏障损伤影响的细胞连接组分，紧密连接包括 Occludin 和 ZO-1，粘附连接包括 E-Cadherin；损伤破坏了这些连接，削弱了上皮屏障；带箭头的部分表示激活途径，红色钝端线表示抑制作用。

**关键词**：慢性阻塞性肺疾病；氧化应激；上皮屏障；Bufei Yishen 方剂

**引言**
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续性、不可逆的气流受限为特征的呼吸系统疾病，与吸入有害气体物质引起的气道炎症反应密切相关。
- COPD 具有高发病率、死亡率和发病率，目前是全球三大死亡原因之一。
- 预计到 2060 年，COPD 及其相关疾病的年死亡率将超过 540 万例，成为严重的全球公共卫生挑战。
- 吸烟被认为是 COPD 的主要病因，香烟烟雾（CS）引起的氧化应激会损害呼吸道上皮，破坏上皮屏障的完整性，从而增加细菌和病毒感染的易感性。
- 当前 COPD 的治疗方案主要包括使用支气管扩张剂、长效 β2-激动剂和抗炎药物，但这些方法均存在一定副作用。
- 上述情况凸显了开发和实施安全有效的 COPD 治疗方法的迫切需求。
- 呼吸道上皮是肺部先天免疫的重要组成部分，对抵御有害颗粒物和病原体至关重要，对于调节先天屏障免疫和维持体内平衡具有关键作用。
- 顶端连接复合体维持气道上皮屏障功能，其包括紧密连接（TJ）和粘附连接（AJ）；TJ（如 Zonula occludens-1、Occludin）和 AJ（如 E-Cadherin）蛋白对上皮屏障的形成至关重要。
- 研究表明，CS 可改变呼吸道上皮的通透性，降低 COPD 患者支气管上皮和肺组织中 Zonula occludens-1（ZO-1）、Occludin（OCC）和 E-Cadherin（E-Cad）的表达，导致上皮屏障结构受损。
- 屏障结构的异常会导致呼吸道炎症感染、纤毛清除能力下降、黏液分泌增多和肺组织破坏，这些都是 COPD 进展中的重要病理变化。
- 因此，增强呼吸道上皮屏障的功能对 COPD 的治疗具有重要意义。
- 氧化应激是 COPD 的主要病理机制之一；CS 暴露会导致呼吸道上皮细胞内氧化应激增加，过量氧化剂不仅直接损伤上皮细胞，还会诱发细胞凋亡，进一步加剧凋亡过程。
- 核因子红系 2 相关因子 2（Nrf2）作为转录因子，在抑制氧化损伤方面起着关键作用；研究发现 CS 可抑制 Nrf2 的活性，间接加剧 COPD 中的氧化应激，从而加重肺组织损伤并加速疾病进展。
- 中医在稳定期 COPD 的管理方面具有独特优势，能有效缓解症状、减少急性加重频率并改善生活质量。
- BYF 包含十二种中药成分，对 COPD 患者表现出良好的疗效：人参皂苷 Rh1、芍药酚、黄芪素、淫羊藿素和诺比利汀可减轻肺组织损伤，调节 Nrf2 通路以缓解氧化应激，并保护 COPD 患者的肺血屏障。
- Loganin、Peimine 和紫苏提取物可减轻氧化应激和炎症因子表达；枸杞多糖 3 和五味子素 A 可激活 Nrf2，降低 ROS 和 MDA 水平，恢复 SOD 活性。
- 蚯蚓和穿心莲提取物通过激活 Nrf2 通路发挥抗炎和抗氧化作用，减轻氧化应激相关的肾损伤。
- 临床研究表明，BYF 可改善肺功能和运动能力，减少急性加重的频率和持续时间。
- 动物实验表明，BYF 可减轻 COPD 患者的肺部和全身炎症，缓解氧化应激和气道黏液过度分泌，纠正蛋白酶-抗蛋白酶失衡及胶原蛋白沉积。

**材料与方法**
- BYF（专利号：ZL201110117578.1）由河南中医药大学药学院提供，成分包括人参根、黄芪根、亚洲柯尔尼利樱桃果、红花芍根、穿心莲草、陈皮、枸杞果、淫羊藿叶、浙贝母鳞茎、紫苏果和蚯蚓。烟草由河南烟草工业有限公司提供（Hongqi Canal? 过滤香烟；焦油含量：10 mg；尼古丁含量：1.0 mg；一氧化碳含量：12 mg）。
- 支原体肺炎菌（Kp）由国家医学菌种资源中心提供（菌株编号：46114）。

**COPD 大鼠模型的建立**
- 共 60 只 8 周大的雄性 Sprague-Dawley 大鼠（180–200 克）由 SPF Biotechnology Co., Ltd. 提供。适应喂养 7 天后，将大鼠随机分为五组：对照组、COPD 组、低剂量 Bufei Yishen 方剂（BYFL）组、高剂量 Bufei Yishen 方剂（BYFH）组和羧胱氨酸（S-CMC）组。COPD 大鼠模型通过烟雾暴露和重复 Kp 感染联合建立；除对照组外，其他组每天暴露于烟雾（3000 ± 500 ppm）两次，每次暴露 30 分钟，两次暴露间隔超过 3 小时。细菌悬液用生理盐水稀释至 6×10^8 CFU/mL，通过鼻腔滴注给药，交替使用左右鼻腔。每只大鼠每 5 天接受 0.1 mL 溶液。
- 对照组大鼠置于清洁空气中，通过鼻腔滴注等体积生理盐水。

**药物与治疗**
- 从第 9 周开始，BYFL 组大鼠每日口服 5.8 g/kg 的 BYF 溶液；BYFH 组大鼠每日口服 11.6 g/kg 的 BYF 溶液；S-CMC 组每日口服 0.14 g/kg 的羧胱氨酸片剂（白云山产）。对照组和 COPD 组每日口服 2 mL 生理盐水。药物剂量的换算公式为：D = 剂量（mg/kg）× HI（体型系数）× W（体重）。第 16 周结束时，大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）处死。

**肺功能检测**
- 在实验的第 0、4、8、12 和 16 周，使用全身 plethysmography 系统测量潮气量（TV）和每分钟通气量（MV）。药物干预结束后（第 16 周），对大鼠进行麻醉，暴露气管并连接肺功能检测系统，测定用力肺活量（FVC）和 0.1 秒内用力呼气容积（FEV0.1）。

**染色与分析**
- 收集大鼠左侧肺组织，固定、包埋、切片后进行 HE 染色。显微镜观察肺组织结构的完整性、气管壁收缩和增厚情况，以及各组大鼠的炎症细胞浸润或肺泡壁破裂情况。使用 ImageJ 1.43u 软件计算肺泡平均数和平均肺泡数量，评估肺泡破裂的程度。

**炎症细胞因子的检测**
- 采用酶联免疫吸附测定法检测血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的 IL-6、TNF-α、IL-1β 和 TGF-β1 水平。

**TUNEL 检测**
- 石蜡切片脱蜡和重新水化后，用蛋白酶 K 进行抗原提取，膜通透化处理并在室温下平衡。然后加入 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase 酶反应液，37°C 存育 1 小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤后，用 4’,6-二氨基-2-苯基吲哚进行染色 10 分钟。最后用抗褪色封片介质封片，荧光显微镜观察凋亡细胞。

**药物血清的制备**
- 8 周大的雄性 Sprague-Dawley 大鼠（180–200 克）由 SPF Biotechnology Co., Ltd. 提供，随机分为两组（每组 15 只）。对照组口服 2 mL 生理盐水，BYF 组每天口服 BYF（18 g/kg），连续 7 天。最后一次给药后 1 小时收集腹主动脉血，离心 15 分钟，通过 0.22 μm 过滤膜过滤，分装后置于 -80°C 保存。

**CS 提取物的制备**
- 点燃无过滤嘴的 Hongqi Canal 香烟，将烟雾吸入无血清 DMEM 培养基中，然后用 20 mL 注射器过滤，通过 0.22 μm 过滤膜。测量 320 nm 处的吸光度，确保不同批次 CSE 溶液的吸光度值（A 值）约为 2.0，定义为 100% CSE 溶液。

**细胞培养**
- BEAS-2B 细胞系来自中国科学院上海细胞库，培养于添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基中（北京 Solarbio Science & Technology Co., Ltd. 提供），37°C、5% CO2 接触环境下培养。细胞密度达到 80%-90% 时以 1:3 比率传代，选择对数生长阶段的第三代细胞进行后续实验。BEAS-2B 细胞分为对照组、CS 组、BYF 组（5%、10% 和 20% 浓度组）以及 ML385 组和 ML385+BYF（10%）组。除了对照组外，所有实验组都接受了10%的CSE处理，以建立COPD模型。ML385组在CSE处理前2小时接受了ML385给药，而BYF处理组则在CSE处理后2小时接受了BYF处理。

**细胞活力测定**
BEAS-2B细胞以每孔5,000个细胞的密度接种在96孔板中，并在处理前培养24小时。处理过程中使用了不同浓度的CSE、BYF和ML385（1 mmol/L溶液，含二甲基亚砜，MedChemExpress，24429，美国），同时设置了一个对照组，每组重复六次实验。处理24小时后，加入10 μL的CCK-8溶液并孵育适当时间，然后使用分光光度计（SpectraMax i3x，Molecular Devices，美国）在450 nm处测量光密度。

**氧化应激标志物检测**
根据制造商的说明书，使用检测试剂盒检测肺组织匀浆液和细胞裂解物中的GSH（Beyotime，S0057S，中国）、SOD（Beyotime，S0101S，中国）和MDA（Beyotime，S0131S，中国）的水平。

**活性氧（ROS）的检测**
BEAS-2B细胞在6孔板中培养后，用0.25%胰蛋白酶消化。收集细胞悬液并在1000 rpm下离心5分钟。然后将细胞重新悬浮在PBS中计数，并调整至1×10^6个细胞。接下来，将细胞在37°C下与10 μmol/L的DCFH-DA（Elabscience，E-BC-K138-F，中国）孵育20分钟。清洗三次后，将细胞重新悬浮在200 μL的PBS中，并使用流式细胞仪（Powclin，SFLO，中国）在488/525 nm处进行检测。利用FlowJo软件分析细胞内的ROS水平。

**Western Blotting**
检测与Nrf2通路、凋亡和顶浆连接复合体相关的蛋白质，包括Bcl-2（1:1000，CST，2764S，美国）、Caspase-3（1:1000，CST，9662S，美国）、Nrf2（1:1000，Affinity，BF8017，中国）、HO-1（1:1000，Affinity，AF5393，中国）、E-Cadherin（1:20000，Proteintech，20874-1-AP，中国）、Occludin（1:5000，Proteintech，27260-1-AP，中国）、ZO-1（1:5000，Proteintech，21773-1-AP，中国）、Bax（1:20000，Proteintech，50599-2-Ig，中国）和β-Tubulin（1:5000，Proteintech，80713-1-RR，中国）。蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶上分离后转移到PVDF膜上。封闭后，将膜在4°C下与一级抗体孵育过夜，随后与二级抗体孵育1小时（山羊抗小鼠IgG (H+L) HRP（1:20,000，HA1001，HA1006，中国）和山羊抗兔IgG (H+L) HRP（1:50000，Huaan，HA1001，中国））。使用ChemiDoc MP成像系统（BioRad，美国）可视化蛋白质条带，并使用ImageJ软件量化光密度值。

**免疫荧光**
BEAS-2B细胞以每孔2 × 10^4个细胞的密度接种在6孔板的盖玻片上，4小时后加入1 mL培养基，并在37°C、5% CO2培养箱中孵育过夜。处理24小时后，用PFA固定细胞15分钟，用PBS清洗，然后在室温下用3% BSA封闭盖玻片30分钟。施加一级抗体并在4°C下孵育过夜（E-Cadherin（1:200，Proteintech，20874-1-AP，中国）、Occludin（1:500，Proteintech，27260-1-AP，中国）和ZO-1（1:100，Proteintech，21773-1-AP，中国））。然后在室温下施加二级抗体50分钟；加入DAPI在黑暗中染色10分钟；最后使用倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse C1，Nikon，日本）进行观察。

**凋亡率评估**
处理24小时后，从每个组收集2 × 10^5个BEAS-2B细胞放入离心管中，重新悬浮在500 μL的Annexin V结合缓冲液中，然后加入5 μL的Annexin V和5 μL的PE-Cy5.5染色剂，混合后孵育15分钟。孵育后，再加入400 μL的Annexin V结合缓冲液，使用流式细胞仪（BD FACSCelesta，BD Biosciences，美国）在30分钟内测量凋亡率。

**跨上皮层电电阻（TEER）**
将细胞以每孔7 × 10^5个细胞的密度接种在Transwell插片的顶部，并培养至少72小时以建立功能性的上皮单层。在相应的药物处理后，将ESR计（Millicell-ERS，Millipore，美国）的长电极插入基底室，短电极插入顶部室。每个孔的TEER测量三次，并计算平均值。TEER（Ω/cm2）=（细胞电阻值 - 基线电阻值）× Transwell上室过滤器的底面积（cm2）。

**统计分析**
使用SPSS软件（版本21.0）进行统计分析。两组之间的比较使用t检验。对于多组之间的比较，使用单向方差分析（ANOVA）；如果方差相等，则应用最小显著差异（LSD）检验；如果方差不等，则使用Dunnett’s T3方法。使用GraphPad Prism 7.0软件生成图表。P值< 0.05被视为统计学上显著。定量数据以平均值±标准差（SD）表示。

**结果**
**BYF改善COPD大鼠的肺功能并减轻肺组织病理损伤**
肺部病理形态和肺功能是反映COPD严重程度的核心指标。为了明确BYF对COPD大鼠疾病进展的干预效果，本研究系统地评估了每组大鼠的肺部病理特征和肺功能参数。HE染色结果显示，与COPD组相比，BYF干预显著减轻了COPD大鼠的典型肺组织病理损伤。具体表现为肺泡结构破坏减少，支气管壁增厚和收缩变形减轻，局部炎症细胞浸润明显改善（图1A–D）。COPD不仅表现为气道和肺组织的局部慢性炎症，还是一种系统性炎症疾病。基于此，本研究检测了每组大鼠血清中的炎症细胞因子水平。结果显示，BYF干预显著降低了血清中的IL-6、TGF-β1和TNF-α水平，以及支气管肺泡灌洗液（BALF）中的IL-6、TGF-β1和IL-1β水平（P<0.01，图1E–J）。此外，BYF组的大鼠体重显著增加（P<0.01，图2A和B）。肺功能测试结果进一步证实，BYF可以有效改善COPD大鼠的呼吸功能，并显著增加关键肺功能指标，如潮气量（TV）、分钟通气量（MV）、 Forced Expiratory Volume in 1 second（FEV0.1）和FEV0.1/FVC比值（P<0.05或P<0.01，图2C–I）。总之，BYF通过减轻COPD大鼠的肺组织损伤和系统性炎症反应来改善肺功能，从而有效降低疾病严重程度。

**BYF减轻COPD大鼠的肺功能并改善肺组织病理损伤**
（图1）BYF对COPD大鼠肺组织病理损伤的影响。(A) 大鼠肺气道组织病理学照片（HE，×300，n=6），刻度尺，50 μm。(B) 平均肺泡数（MAN）。(C) 平均线性截距（MLI）。(D) 炎症评分。(E–G) 血清中的IL-6、TNF-α和TGF-β1水平（n=6）。(H–J) 支气管肺泡灌洗液中的IL-6、IL-1β和TGF-β1水平（n=6）。**P<0.01，与对照组相比。##P<0.01，与COPD组相比。ΔP<0.05，与S-CMC组相比。**

**BYF减轻COPD大鼠的气道上皮细胞凋亡和屏障功能损伤**
细胞凋亡是COPD的重要病理机制之一。当气道上皮细胞发生凋亡时，会导致上皮结构完整性破坏、上皮通透性增加以及炎症细胞积累，进而损害呼吸上皮屏障功能并加速COPD的发病和进展。
**引用36** 为了研究BYF对COPD大鼠气道上皮细胞凋亡的影响，使用Western blot分析检测肺组织中凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，COPD模型组大鼠肺组织中促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下调。BYF干预显著逆转了这种异常表达趋势（P<0.01，图3A–D）。TUNEL测定结果进一步证实，BYF显著减少了COPD大鼠的气道上皮细胞凋亡数量（P<0.01，图3E和F）。

**BYF改善COPD大鼠的肺功能并减轻氧化损伤**
氧化应激是COPD发生和发展的重要驱动因素之一。它不仅可以直接损伤组织，还会加剧细胞器和DNA的破坏，并诱导程序性细胞死亡过程，如凋亡。
**引用38** 为了明确BYF在COPD大鼠中的抗氧化活性，检测了肺组织匀浆液中的氧化应激相关指标水平。结果显示，BYF可以增加GSH和SOD的活性，同时降低MDA的表达（P<0.01，图4A–C）。鉴于氧化应激在COPD进展中的核心作用，并考虑到血红素加氧酶-1（HO-1）的表达受Nrf2信号通路的调节——这是一个对多种实验动物模型中的炎症性疾病（如心血管疾病、肺部疾病、肾脏疾病和代谢紊乱）的病理过程具有核心调节作用的多器官保护通路——本研究进一步通过Western blot分析检测了Nrf2/HO-1通路相关蛋白的表达水平。
**引用39** 结果显示，BYF干预显著上调了COPD大鼠肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01，图4D–F）。因此推测，BYF可能通过激活氧化还原敏感的Nrf2/HO-1信号通路来发挥其对COPD大鼠肺组织的抗氧化保护作用。

**BYF减轻CSE诱导的BEAS-2B细胞上皮屏障功能损伤**
为了进一步明确BYF在调节气道上皮屏障功能中的具体作用和分子机制，本研究使用人支气管上皮细胞系BEAS-2B成功建立了模拟COPD相关上皮细胞损伤的体外细胞模型。使用CCK-8测定评估不同浓度CSE和BYF药物血清对BEAS-2B细胞增殖活性的影响。经过24小时的CSE和BYF处理后，结果表明，与对照组相比，2.5%、5%和10%的CSE和BYF浓度对BEAS-2B细胞的活力没有显著影响；然而，20%和40%浓度下的细胞活力显著低于对照组（P<0.01，图5A和B）。因此，10%的浓度被认为是最佳的干预浓度。CSE组。显示全大小

呼吸道上皮不仅作为物理屏障，利用纤毛运动清除被黏液捕获的颗粒，还动员免疫系统来保护呼吸道。

引用：40项Western blot结果显示，与对照组相比，CSE组中E-cad、OCC和ZO-1的表达水平降低，表明细胞屏障的完整性受损。相比之下，BYF组中E-cad、OCC和ZO-1的表达呈浓度依赖性增加（P<0.01，图5C–F）。免疫荧光检测结果与Western blot结果一致，显示BYF能够逆转CSE引起的E-cad、OCC和ZO-1表达的下降（P<0.01，图6A–F）。TEER是一种定量方法，用于评估细胞培养模型中紧密连接结构的完整性，是上皮屏障功能的关键指标。

引用：41 TEER结果显示，与对照组相比，CSE组的TEER随着时间的推移逐渐下降，在干预后24小时降幅最为显著；与CSE组相比，BYF组在不同时间点均提高了BEAS-2B细胞的TEER（P<0.01，图7A）。图6 BEAS-2B细胞中E-cad、ZO-1和OCC的表达情况（A–F）。通过免疫荧光染色检测BEAS-2B细胞中的E-cad、ZO-1和OCC表达（n=6）。刻度尺，200 μm。**P<0.01，与对照组相比。##P<0.01，与CSE组相比。

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图7 BYF对BEAS-2B细胞TEER和凋亡的影响。（A）干预后24小时测得的TEER变化。（n=3）。（B–E）通过Western blot检测Bax、caspase-3和Bcl-2的表达（n=3）。（F和G）通过流式细胞术检测BEAS-2B细胞的凋亡情况（n=3）。Q3：早期凋亡率，Q2：晚期凋亡率，Q2+Q3：总凋亡率 *P<0.05，**P<0.01，与对照组相比。#P<0.05，##P<0.01，与CSE组相比。

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BYF减弱CSE诱导的BEAS-2B细胞凋亡

为了研究BYF对BEAS-2B细胞凋亡的影响，我们通过Western blot检测了与凋亡相关的蛋白表达。结果显示，与对照组相比，CSE组中Bax和caspase-3蛋白表达显著升高，而Bcl-2表达降低。相比之下，BYF组中Bax和caspase-3表达呈浓度依赖性降低，10%和20%的BYF浓度显著增加了Bcl-2表达（P<0.01，图7B–E）。此外，流式细胞术测定了早期、晚期和总凋亡率；与对照组相比，CSE组的凋亡率显著升高；BYF显著降低了细胞的早期和总凋亡率（P<0.05或P<0.01，图7F和G）。

BYF减弱CSE诱导的BEAS-2B细胞氧化损伤

为了探讨BYF在CSE诱导的氧化应激中的抗氧化活性，我们评估了细胞裂解液中GSH、SOD和MDA的活性：与对照组相比，CSE组中GSH和SOD表达显著降低，MDA表达升高；与CSE组相比，BYF组以浓度依赖性方式增加了这些蛋白的表达，并同时降低了MDA表达（P<0.01，图8A–C）。ROS是氧化应激的关键介质。流式细胞术结果显示，BYF以剂量依赖性方式降低了ROS的荧光强度（P<0.01，图8D和E）。接下来，为了研究BYF对气道上皮屏障功能改善的作用，我们通过Western blot检测了Nrf2蛋白的表达水平。与对照组相比，CSE组中Nrf2表达显著降低；相比之下，10%和20%的BYF浓度显著增加了这些蛋白的表达水平。本研究还分析了由Nrf2调节的HO-1蛋白的表达，发现与CSE组相比，BYF组中HO-1蛋白表达显著升高（P<0.01，图8F–H）。这表明BYF对气道上皮屏障功能的改善可能与Nrf2/HO-1途径介导的抗氧化机制有关。

图8 BYF对BEAS-2B细胞中氧化应激和Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响。（A–C）检测了BEAS-2B细胞中的GSH、SOD和MDA水平（n=6）。（D和E）通过流式细胞术测定ROS水平。（F–H）通过Western blot检测Nrf2和HO-1的表达（n=3）。**P<0.01，与对照组相比。##P<0.01，与CSE组相比。

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BYF在Nrf2抑制剂ML385干预下对CSE引起的BEAS-2B细胞屏障损伤的影响

干预24小时后，结果显示，2.5 mM和5 mM的ML385浓度对BEAS-2B细胞活力没有显著影响；然而，10 mM、20 mM和40 mM的ML385组细胞活力显著降低（P<0.01，图9A）。因此，5 mM的ML385被认为是最佳干预浓度。

图9 BYF在Nrf2抑制剂ML385干预下对BEAS-2B细胞凋亡和Nrf2信号通路相关蛋白的影响。（A）使用CCK-8检测细胞活力（n=6）。（B–G）通过Western blot检测Nrf2、HO-1、Bax、caspase-3和Bcl-2的表达（n=3）。（H）干预后24小时测得的TEER变化（n=3）。**P<0.01，与对照组相比。##P<0.01，与CSE组相比。▲P<0.05，▲▲P<0.01，与BYF组相比。

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为了进一步证实Nrf2在BYF改善呼吸道上皮屏障功能中的作用，我们使用ML385抑制BEAS-2B细胞中Nrf2的表达。Western blot结果显示，与BYF组相比，ML385+BYF组中Nrf2和HO-1表达降低，证实BYF通过Nrf2/HO-1信号通路发挥药理作用。然后，我们研究了ML385处理后BYF对CS干预下的BEAS-2B细胞氧化应激、细胞凋亡和TEER的影响。Western blot结果显示，与BYF组相比，ML385+BYF组中Bax和caspase-3蛋白表达显著升高，Bcl-2表达降低（P<0.05或P<0.01，图9B–G）。TEER结果显示，与BYF组相比，ML385+BYF组细胞的TEER显著降低（P<0.01，图9H）。氧化应激结果显示，与BYF组相比，ML385+BYF组中MDA表达显著升高，GSH和SOD表达显著降低（P<0.01，图10A–C）。同样，流式细胞术结果显示，ML385+BYF处理也增加了ROS的荧光强度（P<0.05或P<0.01，图10D和E）。上述结果进一步证实，BYF通过激活Nrf2/HO-1信号通路改善了CSE诱导的BEAS-2B细胞屏障功能障碍。

图10 BYF在Nrf2抑制剂ML385干预下对氧化应激的影响。（A–C）检测了BEAS-2B细胞中的GSH、SOD和MDA水平（n=6）。（D和E）通过流式细胞术测定ROS水平。**P<0.01，与对照组相比。##P<0.01，与CSE组相比。▲P<0.05，▲▲P<0.01，与BYF组相比。

讨论

COPD是一种常见、可预防和可治疗的疾病，已成为主要的全球公共卫生挑战。

引用：42 吸烟是慢性阻塞性肺疾病（COPD）最常见的诱因。长期暴露于香烟烟雾会导致气道上皮屏障功能受损和炎症反应，从而加重临床症状。

引用：43 气道上皮屏障的损伤与COPD的进行性加重和生活质量下降密切相关。因此，迫切需要有效的策略来改善气道上皮屏障损伤。中药具有多成分和多靶点的特性，具有显著的治疗效果，这一点已得到广泛认可。通过整合转录组学、蛋白质组学、代谢组学和系统药理学，我们发现BYF通过调节脂质代谢、炎症、氧化应激和细胞连接途径在系统水平上对COPD发挥治疗作用。此外，我们使用UPLC-QE-Orbitrap-MS鉴定了该药物在血液中的吸收成分，并最终确认了10种与COPD治疗显著相关的血液吸收成分：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、黄芪苷IV、Peimine、Schisandrin B、Icariin、Hesperidin、Nobiletin和Paeoniflorin。

引用：44 初始研究显示，BYF能够稳定肺泡结构，减轻肺组织病理变化，降低COPD大鼠肺动脉壁厚度，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖，增强骨骼肌结构和功能，并调节免疫功能。

引用：45–47 吸烟会导致大量有毒颗粒沉积在肺部，引发炎症细胞的大量聚集。

引用：48 这些炎症细胞进一步释放促炎细胞因子，如IL-6、TNF-α和TGF-β1，不仅加重肺部的炎症反应并损害肺组织上皮细胞，还刺激成纤维细胞的激活及其参与气道结构重塑。这最终导致气道腔径减小，从而限制气流。

引用：49 此外，炎症细胞数量的增加促进了大量蛋白酶的释放，加速了肺泡壁的降解，从而诱发肺气肿。

引用：50 肺功能测试对于明确COPD的类型、病变位置和气流受限程度以及评估COPD的治疗效果和预后具有重要的参考价值。因此，它们被视为COPD临床诊断的“金标准”。

引用：51 在这些参数中，TV和MV是评估气道通畅性的关键指标，反映了肺组织的弹性和呼吸肌力量。

引用：52、53 FEV0.1、FVC和FEV0.1/FVC比值是最常用的临床参数，用于评估通气功能。它们可以有效反映大呼吸道阻力，是诊断COPD和评估气流受限程度的核心指标。

引用：54、55 与这些临床相关性一致，本研究结果表明，BYF可以显著缓解COPD大鼠的肺功能下降程度，改善气流受限状况，减轻肺组织的病理损伤，并对局部肺组织炎症和全身炎症反应产生显著抑制作用。

呼吸道上皮是一个复杂的系统，包含多种类型的细胞，与免疫系统协同作用，维持呼吸道环境的稳态，并构成完整的呼吸道屏障，防止外来颗粒和病原体侵入黏膜下间隙。

引用：14 呼吸道屏障完整性的破坏会导致吸入外来物质对深部气道的刺激，引发呼吸道感染和免疫反应，表明呼吸道上皮屏障功能障碍与呼吸道疾病之间存在密切关系。

引用：40 研究表明，八周的CS暴露会显著降低小鼠中屏障连接蛋白的水平。

引用：56 CSE暴露会降低培养的人类肺腺癌细胞在气液界面的TEER，并抑制claudin、OCC、E-cad和ZO-1的基因表达水平。

引用：57 同样，我们的实验结果表明，体内CS暴露会导致COPD大鼠肺组织中ZO-1、OCC和E-cad表达降低。体外实验中，CS暴露会导致BEAS-2B细胞间ZO-1、OCC和E-cad的降解，随后细胞TEER下降，最终导致呼吸道上皮屏障损伤。

细胞凋亡对于呼吸道上皮细胞的动态平衡至关重要。在正常情况下，凋亡机制调节上皮细胞的增殖并清除受损细胞，而不会引起慢性炎症反应。

引用：58 然而，在COPD中，CS引起的持续细胞损伤会导致凋亡反应，这是COPD发病机制的关键因素。长期CS暴露导致细胞间连接完整性降低，增加促炎细胞因子和免疫细胞，从而诱发凋亡。

引用：16、18 随着疾病严重程度的增加，上皮细胞的凋亡率上升，进一步破坏上皮结构，导致COPD患者中上皮屏障结构和功能障碍的恶性循环。B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白家族在调节与细胞凋亡相关的基因蛋白中起着重要作用，其中Bcl-2相关X蛋白（Bax）和Bcl-2蛋白分别促进和抑制细胞凋亡。引用59

半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（caspase-3）是Caspases家族中的核心蛋白酶，它在细胞凋亡过程中发挥决定性的调节作用。引用60

在暴露于CS的小鼠肺组织中，促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少。引用61

流式细胞术结果显示CS可以增加HBEC细胞中的凋亡比例。引用62

我们的实验结果表明，通过Western blot、TUNEL染色和流式细胞术检测，CSE能够显著增加BEAS-2B细胞的凋亡率。在COPD模型大鼠中，也观察到了气道上皮细胞的凋亡。这些结果与先前的研究报告一致。

吸烟会向肺基质中引入大量ROS（活性氧），引发氧化应激并直接损伤肺组织，这表现为氧化应激标志物谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）的减少，以及脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）的增加。引用57, 引用63

GSH是一种主要的抗氧化剂，通过酶促途径直接或间接清除自由基和活性氮物种。引用64

SOD可将超氧阴离子氧化为氢过氧化物和氧气，从而防止有毒羟基自由基的产生。引用65

MDA的定量通常反映了组织内的脂质过氧化程度，间接反映了细胞的损伤情况。引用66

在COPD背景下，CS暴露会导致氧化/抗氧化失衡，加速上皮细胞的过早衰老，破坏屏障连接的完整性，进而影响上皮屏障的功能。引用16

因此，阐明COPD中的氧化应激机制对于临床干预至关重要。我们的研究发现表明，BYF不仅可以上调GSH和SOD的表达水平，同时降低MDA的表达水平，还可以以剂量依赖的方式减少ROS的表达，表明BYF能够减轻氧化应激损伤。总之，BYF能够在COPD模型中逆转TEER、E-cad和ZO-1表达的下降，并同时抑制氧化应激反应和细胞凋亡过程。然而，其发挥这些作用的潜在分子机制仍不明确。尽管如此，支持这些观察结果的机制仍有待进一步阐明。

Nrf2是一种在呼吸道上皮细胞中表达显著的转录因子，已被证明通过调节炎症、巨噬细胞功能和凋亡自噬等方式参与COPD的发病机制和进展。引用67

Nrf2通常会被靶向泛素化并随后通过蛋白酶体降解，但它在与Keap1的复合物中保持隔离状态。当受到氧化应激时，Nrf2的降解途径被阻断，Nrf2从Keap1复合物中释放出来并转移到细胞核，激活下游的抗氧化反应元件，从而调控对抗氧化防御和细胞保护至关重要的基因表达，从而保护呼吸道上皮。引用17, 引用68

当ROS等氧化产物超过身体的清除能力时，会导致Nrf2介导的氧化/抗氧化平衡失调，使下游抗氧化酶的表达失调，从而在体内引发氧化应激。引用69

血红素加氧酶-1（HO-1）是一种细胞保护酶，也是Nrf2的下游效应器，它参与细胞对凋亡和氧化应激的防御，通过催化血红素的降解产生一氧化碳、胆绿素和亚铁离子，这些物质可以调节细胞凋亡、炎症和氧化应激，在细胞内对抗氧化应激的过程中起着重要作用。引用70, 引用71

Nrf2/HO-1轴是一个保护性信号级联，可以增强肺组织对整个COPD进程中的氧化损伤的抵抗力。Nrf2的减弱会导致细胞氧化还原平衡的破坏，减缓修复过程，加速衰老，并增加死亡率，从而增加COPD的易感性。引用68, 引用72

确认性研究表明，COPD患者的肺组织中Nrf2的表达下调。多项研究强调了在COPD治疗中调节Nrf2轴的重要性。例如，烯丙基异硫氰酸酯同样可以通过Nrf2途径减轻CS诱导的BEAS-2B细胞的凋亡和氧化现象。引用73

同样，我们的动物实验表明，CS在COPD模型中降低了Nrf2的表达，而BYF则提升了Nrf2和HO-1的表达，从而减轻了COPD大鼠肺组织的病理损伤和氧化应激。

为了进一步研究BYF的抗氧化机制与Nrf2之间的关联，我们使用CSE刺激BEAS-2B细胞并建立了体外模型。我们的数据证实，CSE暴露会导致BEAS-2B细胞的屏障功能障碍，表现为连接蛋白表达减弱、TEER降低以及凋亡和氧化应激标志物升高。BYF以浓度依赖的方式逆转了CSE引起的异常。这些发现表明BYF对受损的BEAS-2B细胞屏障功能具有恢复作用。此外，使用Nrf2抑制剂ML385验证了Nrf2的作用，我们发现ML385显著抑制了BYF的抗氧化效果，提示Nrf2的激活是BYF效应的关键抗氧化途径。

结论

我们的研究通过在体内和体外建立COPD模型，阐明了BYF改善COPD中气道上皮屏障损伤的机制。实验数据显示，在体内，BYF显著逆转了COPD大鼠肺功能的下降和肺组织的病理损伤。它还有效抑制了炎症细胞因子的释放、气道上皮细胞的凋亡和氧化应激引起的损伤。同时，体外实验表明，BYF缓解了CSE诱导的人类支气管上皮细胞的氧化应激损伤和凋亡，同时降低了上皮细胞的通透性。这些效应共同促进了气道上皮屏障功能的保护。此外，本研究还发现激活Nrf2信号通路可以逆转CSE引起的上述异常变化。

缩写：
AJ：黏附连接；Bcl-2：B细胞淋巴瘤-2；Bax：Bcl-2相关X蛋白；BEAS-2B：支气管上皮细胞；BYF：布肺益神方；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3；CCK-8：细胞计数试剂盒-8；COPD：慢性阻塞性肺疾病；CS：吸烟；CSE：吸烟提取物；E-cad：E-钙黏附蛋白；FEV0.1：0.1秒 forced expiratory volume；FVC： Forced vital capacity；GSH：谷胱甘肽；HO-1：血红素加氧酶-1；Kp：肺炎克雷伯菌；MDA：丙二醛；MV：每分钟通气量；Nrf2：核因子红细胞2相关因子2；OCC：闭锁蛋白；ROS：活性氧；SOD：超氧化物歧化酶；TEER：跨上皮电阻；TJ：紧密连接；TV：潮气量；ZO-1：闭合蛋白-1。

伦理批准

本研究严格遵循《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）进行。动物实验获得了河南中医药大学第一附属医院动物护理委员会的批准（批准编号：YFYDW2024018）。

作者贡献

所有作者对所报告的工作都做出了重要贡献，无论是概念制定、研究设计、数据采集、分析解释还是其他方面；都参与了文章的起草、撰写、修订或审阅；就文章的投稿期刊达成了一致意见；接受了最终发表的文章版本；并同意对文章内容负责。

利益冲突声明

作者声明研究过程中不存在可能被视为利益冲突的商业或财务关系。

数据共享声明

数据随手稿一并提供。