ASPDH通过调节乳酸代谢以及NF-κB/PD-L1信号通路，抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

《Clinics》：ASPDH inhibits the proliferation, migration, and invasion of liver cancer cells by regulating lactate metabolism and the NF-κB/PD-L1 pathway

丁丽 | 李木子 | 闫梦凡 | 熊圆圆
湖南医科大学附属人民医院（湖南省人民医院）介入放射学与血管外科部门，中国湖南省长沙市

**摘要**

**背景**
乳酸已被证明是参与肿瘤发生、进展和肿瘤微环境的重要代谢物，影响着患者的预后。乳酸代谢相关基因在肝癌中的作用尚不明确。

**方法**
作者从五个关键途径中识别出乳酸代谢相关基因，并对其相关性进行了评分。通过分析TCGA-LIHC及验证队列（GSE54236、ICGC和GSE116174）的遗传和临床数据来确认生存关联。在ASPDH过表达细胞上进行了乳酸钠拯救实验，以研究乳酸的作用。体内异种移植模型验证了ASPDH对肿瘤生长和NF-κB/PD-L1信号通路的影响。

**结果**
在320个乳酸代谢相关基因中，确定了四个核心基因：LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2。低ASPDH表达与多个数据集中的较差生存率相关。PD-L1的ROC分析显示其具有较高的诊断效能（AUC = 0.8）。ASPDH敲低增强了细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，而过表达则产生了相反的效果。乳酸钠拯救实验进一步表明，外源性乳酸部分恢复了ASPDH过表达抑制的细胞增殖、迁移和侵袭能力，并增加了核p65和PD-L1的表达，从而证实了乳酸在调节ASPDH调控的NF-κB通路活性和PD-L1表达中的作用。GSEA将ASPDH与PD-L1表达和检查点通路联系起来。体内实验显示，ASPDH过表达抑制了肿瘤生长，降低了核p65和PD-L1的水平，同时增加了胞质p65的水平，并减少了乳酸的分泌和NF-κB/PD-L1的调节。

**结论**
ASPDH通过下调乳酸分泌和抑制NF-κB/PD-L1信号通路来抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

**引言**
肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因。肝癌患者对常规放疗和化疗不敏感，许多患者也无法从索拉非尼治疗中获益。因此，需要寻找新的治疗策略以延长患者的生存时间。然而，鉴于肝癌患者的高度异质性，新的预后标志物十分重要。

20世纪20年代首次发现，即使在有氧条件下，肿瘤细胞也会消耗大量葡萄糖并分泌乳酸，这一现象被称为“瓦尔堡效应”，是癌症的标志之一。乳酸与免疫系统之间存在密切关系。在高糖酵解的肿瘤微环境中，乳酸会促进调节性T细胞中程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的表达，导致对PD-1阻断治疗的部分抵抗。生物信息学分析在许多领域取得了显著进展，但乳酸相关基因在肝癌生物信息学分析中的作用仍有待进一步研究。

天冬氨酸脱氢酶（ASPDH）是一种关键酶，可催化L-天冬氨酸的氧化脱氢，生成草酰乙酸和NAD(P)H。研究表明，ASPDH依赖NAD/NADP催化L-Asp的氧化，并通过调节与PHA合成相关的基因簇参与Poly-3-羟基丁酸（PHB）前体的生物合成。来自Achromobacter denitrificans的ASPDH已被用于与葡萄糖脱氢酶（GDH）耦合的生物催化系统中，高效合成L-2-氨基丁酸（转化率为97.2%）。另外，天冬氨酸β-半醛脱氢酶（ASADH）作为一种类似酶，由于其在校菌中合成必需氨基酸过程中的关键作用，被认为是抗菌和除草剂药物设计的潜在靶点。目前，关于ASPDH在不同物种中的调控机制、构象功能关系及其与肝癌的相关作用仍缺乏系统性研究。作为关键的代谢酶，ASPDH的多功能性生物学特征值得进一步深入研究。

在本研究中，通过5个乳酸代谢途径获得了与乳酸代谢相关的基因。基于TCGA LIHC数据，使用ssGSEA方法获得了LM（富集评分）。随后通过WGCNA分析、生存随机森林和LASSO分析筛选出核心基因。作者旨在探索乳酸代谢相关基因在肝癌中的作用。

**材料与方法**
**数据收集**
从癌症基因组图谱（TCGA）数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载了365个肝癌（LIHC）样本的Fragments Per Kilobase Million（FPKM）数据。验证数据集GSE54236和GSE116174来自GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），ICGC数据来自ICGC数据门户（https://dcc.icgc.org/）。此外，还从TCGA数据门户获取了LIHC的体细胞突变谱和相关临床信息。

**乳酸相关基因的筛选**
在Molecular Signatures Database v7.4（MSigDB；https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）中搜索“lactate”关键词，发现了五个与乳酸相关的通路：GOBP_LACTATE_metABOLIC_PROCESS、HP_INCREASED_SERUM_LACTATE、HP_LACTIC_acIDOSIS、HP_LACTIC_ACIDURIA和HP_SEVERE_LACTIC_ACIDOSIS。从这些通路中提取了320个乳酸代谢相关基因，并使用R语言的limma包分析了它们的表达谱。

**核心基因的筛选和预后特征的分析**
从最初的320个乳酸相关基因中，进一步筛选出预后标记物。单变量Cox回归分析确定了105个与预后显著相关的乳酸相关基因（p < 0.05）。然后对这些基因进行单样本基因集富集分析（ssGSEA），得到乳酸代谢富集（LM）评分。接下来在TCGA数据集上进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），以识别与LM富集评分相关的基因模块。得分最高的黑模块包含148个基因，进一步通过单变量Cox回归分析（p < 0.05）精炼出77个预后基因。Kaplan-Meier分析中的患者分层采用R包survminer实现的“最佳截断”方法。此外，还在多个验证数据集（GSE54236、ICGC和GSE116174）中对ASPDH进行了生存分析。

**随机生存森林（RSF）**
为了进一步优化这77个乳酸相关基因中的预后标记物，进行了RSF分析。RSF将随机森林扩展到带 censor信息的生存数据，同时处理高维基因组数据集，并考虑基因之间的非线性关系和相互作用。根据基因对患者生存结果的预测重要性（VIMP）对这些基因进行排名，逐步淘汰掉预测重要性较低的基因，最终将候选基因池从77个减少到27个，保留了最具生物学和预后相关性的基因。

**最小绝对值收缩和选择算法（LASSO）**
在获得27个候选基因后，应用LASSO回归进行最终标记物筛选。LASSO作为一种惩罚回归方法，通过施加L1惩罚约束同时进行变量选择和模型正则化。使用10折交叉验证确定最佳惩罚参数（λ），在预测准确性和模型复杂性之间达到平衡。最终确定的四个核心预后标志物为：LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2。分析了这些基因与免疫检查点、临床分期和乳酸相关基因ASPDH之间的相关性。使用严格的标准识别共表达模块内的枢纽基因：模块成员度（MM）> 0.8（绝对值），基因显著性（GS）> 0.6（针对主要临床特征），模块内的top 10%连通性（kWithin），并在适用情况下进行差异表达（adj.p < 0.05）的额外过滤。

**ROC分析**
为了评估ASPDH表达在区分PD-L1免疫治疗响应者和非响应者方面的预测性能，作者使用了接收者操作特征（ROC）曲线分析方法：从免疫治疗队列中提取基因表达数据（ASPDH水平）和相应的临床反应标签。通过绘制一系列ASPDH表达截断值下的敏感性与特异性曲线，计算ROC曲线下面积（AUC）以量化诊断准确性。统计分析包括使用DeLong方法估计AUC的95%置信区间，所有计算均在R（v4.3.0）中使用pROC包完成。

**药物敏感性分析**
使用oncoPredict软件分析药物敏感性。药物敏感性预测参考了Genomics of Drug Sensitivity in Cancer（v2022）数据库。准备了与药物敏感性和药物敏感性相关的ASPDH表达数据，对ASPDH表达数据进行了预处理和标准化，并整合和清洗了药物敏感性数据。选择与药物敏感性相关的基因特征，并使用特征选择算法进行筛选。建立了机器学习模型或其他预测模型，使用选定的基因特征作为输入来预测药物敏感性。通过对模型进行交叉验证或其他验证方法评估其稳健性和可靠性，然后用该模型预测新样本的药物敏感性。

**ASPDH相关的突变和功能富集分析**
使用maftools包比较了高表达组和高表达组之间的体细胞突变谱。利用GSEA和KEGG通路富集分析了与ASPDH相关的基因，并使用clusterProfiler工具获得了结果。

**细胞培养**
Hep3B（AW-CCH035）、MHCC-97H（AW-CCH088）、HepG2（AW-CCH604）和HCC-LM3（AW-CCH210）细胞在含有10% FBS和1%双抗的MEM培养基（iCell-0012, Icell, China）中培养。LX2细胞（AW-CCH088）在含有10% FBS和1%双抗的DMEM培养基（iCell-0001, Icell, China）中培养。HepG2是一种低转移性的肝癌细胞系，代表早期/低侵袭性的肝癌表型，用于评估基因在肿瘤恶性转化中的作用。Hep3B是一种中等到高转移性的肝癌细胞系，具有较高的侵袭性。HCC-LM3和MHCC-97H是高转移性的肝癌细胞系，具有很强的侵袭性和转移潜力。所有细胞均购自Abiowell Biology LTD。

**细胞分组**
将对数生长的细胞分为六组：对照组、oe-NC、oe-ASPDH、si-NC、si-ASPDH#1和si-ASPDH#2。
- 对照组：未进行任何转染处理的Hep3B和MHCC-97H细胞。
- oe-NC组：转染空载体pcDNA3.1。
- oe-ASPDH组：转染过表达ASPDH的质粒以诱导ASPDH上调。
- si-NC组：转染无同源性的siRNA作为siRNA干扰的阴性对照。
- si-ASPDH#1和si-ASPDH#2组：分别转染两种不同的针对ASPDH mRNA不同区域的siRNA。所有质粒均购自HonorGene。

**细胞转染程序**
取四个无菌离心管中的两个，每个管中加入95 μL无血清MEM/DMEM培养基。然后分别向每个管中加入3 μg oe-ASPDH、si-ASPDH#1、si-ASPDH#2和5 μL Lip2000（11,668,019, invitrogen, UK）。在指定组中进行ASPDH过表达后，添加10 mM的乳酸钠（Lac）干预（24小时），以研究ASPDH与乳酸之间的功能相互作用。oe-ASPDH + Lac组：转染过表达ASPDH的质粒后，用10 mM的乳酸钠处理细胞24小时。oe-NC和si-NC组也用相同方法处理。轻轻混合，室温下静置5分钟，然后混合两个管中的溶液。最后将混合液均匀加入转导孔中，并在37°C培养箱中培养6小时后更换新鲜完全培养基。

**qRT-PCR**
使用Tritizol（15,596,026, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）提取细胞总RNA。反应条件为：95°C变性10分钟，94°C变性15秒，60°C保温30秒，共40个循环。内参引物为β-actin。引物序列见表1。以2 μg cDNA为模板，使用相对定量方法（2-△△Ct方法）计算目标基因的相对转录水平：△△Ct = △实验组 - △对照组，△Ct = Ct（目标基因）- Ct（β-actin）。

**Western blot**
细胞收集和预处理后，使用Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit（P1201, Applygen, China）分离核蛋白和胞质蛋白，使用RIPA Kit（r0010, Solarbio, China）提取总蛋白。然后用以下一级抗体进行免疫印迹：兔抗p65（1:1000, 66,535-1-Ig, Proteintech）、兔抗PD-L1（1:1000, AWA58022, Abiowell）、兔抗PCNA（1:5000, 10,205-2-AP, Proteintech）和小鼠抗β-actin（1:5000, ab8226, Abcam）作为加载对照。膜在每次孵育间用PBS-Tween（0.1%）洗涤三次。

**细胞计数（CCK-8）**
从每组细胞中提取细胞并进行计数，然后在48孔板中以每孔1 × 10^4细胞的密度接种。细胞贴壁后，按照上述方法处理相应的时间。然后，向每个孔中加入30 μL的CCK-8（NU679，日本通润公司），通过将CCK-8溶液稀释在完全培养基中来制备，并在加入含有CCK-8的300 μL培养基之前移除原来的含有药物的培养基。在37°C和5% CO2的条件下继续培养4小时后，使用微孔板读数仪分析450 nm处的吸光度（OD），并将平均值绘制在条形图中。将5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）（C10310，中国瑞博公司）以1000:1的比例稀释到细胞培养基中，以制备50 μM的EdU培养基。随后，向每个孔中加入50 μL的4%甲醛（N1012，NCM公司）。接着，向每个孔中加入50 μL的2 mg/mL甘氨酸，并丢弃甘氨酸溶液。移除甘氨酸溶液后，立即对细胞进行荧光染色和显微镜观察。

Transwell
所有无菌消耗品（移液器吸头、EP管）和细胞外基质成分（Matrigel，康宁公司）在实验前都在4°C下平衡过夜。向下腔室加入500 μL的10%胎牛血清完全培养基。然后去除膜。使用0.1%结晶紫（G1062，中国索拉比奥公司）进行染色5分钟，随后用清水冲洗5次。将膜放置在水玻片上进行成像。

克隆实验
将单细胞悬浮液以每孔200个活跃细胞的密度接种到6孔培养板中，每孔使用2 mL的完全培养基。轻轻摇动培养板以确保细胞均匀分布，然后在37°C和5% CO2的湿润环境中培养14-21天，每3天补充一次培养基。用1 mL的染色工作液对细胞进行染色，然后用流水缓慢冲洗并风干。计数克隆细胞。

乳酸测定
按照乳酸检测试剂盒（A019–2，南京建城生物工程有限公司）的步骤进行乳酸测定。将样品与试剂混合后，在37°C下反应10分钟。然后加入2 mL的终止溶液并混合，使用1 cm光程在530 nm波长处测量每个试管的吸光度。最后，使用标准曲线和计算公式计算乳酸浓度。

裸鼠异种移植肿瘤模型
采用BALB/c裸鼠的皮下异种移植模型来评估ASPDH过表达对肝癌生长的抑制作用。将携带oe-NC或oe-ASPDH的稳定转染Hep3B细胞（1 × 10^6细胞/小鼠）悬浮在Matrigel中，然后皮下注射到裸鼠的右侧腹侧。通过每3天测量肿瘤的长度（L）和宽度（W）来监测肿瘤生长，肿瘤体积使用公式V = W^2 × L/2计算。观察35天后，对小鼠实施安乐死，并收集肿瘤进行进一步分析。本研究已获得湖南省人民医院医学伦理委员会的批准（编号[2024]?69）。

统计分析
使用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析。使用Tukey事后检验的单因素ANOVA来比较多个组之间的差异。使用双向方差分析（ANOVA）进行多个时间点之间的组间统计比较，随后使用Bonferroni事后检验进行多重比较。显著性水平p < 0.05表示具有统计学意义。

结果
肝癌中的乳酸代谢和预后相关基因筛选
从5个乳酸相关通路中收集了共320个乳酸相关基因，Cox分析确定了105个与肝癌患者预后相关的乳酸相关基因。使用ssGSEA生成这些基因的富集评分。生存分析显示，高LM富集评分和低LM富集评分的肝癌患者的生存时间存在统计学差异（p = 0.004）（图1A）。WGCNA分析揭示了如Module eigene（Me）pink、Meblack、Mebrown等模块与LM富集评分之间的相关性。在Meblack模块中，基因显著性与模块成员身份之间存在高度相关性（图1B和1C）。通过对Meblack模块中的178个乳酸相关基因进行单变量Cox分析，进一步筛选出77个与肝癌患者预后相关的乳酸代谢相关基因（p < 0.05）（图1D）。RSF分析将基因数量减少到27个（图1E）。LASSO分析进一步确定了4个核心基因：LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2（图1F）。总之，乳酸代谢相关基因与肝癌患者的预后密切相关。

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图1. 与肝癌预后相关的乳酸代谢相关基因的筛选。(A) 基于LM富集评分的生存分析。(B) WGCNA分析：模块与LM富集评分之间的相关性。(C) Black模块成员与LM富集评分相关的基因显著性之间的相关性。(D) 单变量Cox分析。(E) RSF图。(F) LASSO分析。

乳酸代谢相关核心基因的生存分析
上述结果确定了4个乳酸代谢相关基因（LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2）。生存分析显示，LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2的表达水平与肝癌患者的生存时间存在统计学上的显著关联。TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2的较低表达水平与肝癌患者较低的10年生存率相关，而LPCAT1的较低表达水平与较高的10年生存率相关（图2A）。为了研究肝癌与这些基因在体外表达之间的关系，作者检测了LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2在LX-2、HepG2、Hep3B、HCC-LM3和MHCC-97H细胞系中的表达水平。与其他细胞系相比，LPCAT1在Hep3B和MHCC-97H细胞中的表达显著增加（图2B）。在验证集（GSE54236、ICGC和GSE116174）中进行的ASPDH生存分析显示，较低的ASPDH表达与较差的生存率相关（图2C）。这表明这4个基因在肝癌细胞中的表达确实异常。

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图2. 乳酸代谢相关核心基因的预后分析。(A) 四个乳酸代谢核心基因（LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2）在肝癌中的生存分析。(B) 五个细胞系中LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2的表达。(C) ASPDH的生存分析。*表示与LX2组相比p < 0.05。

ASPDH抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移
已经研究了LPCAT1、TMEM220-AS1和LECT2在肝癌中的作用，因此选择了ASPDH进行进一步分析。基于5种细胞系中ASPDH的表达情况，选择了低表达的Hep3B和MHCC-97H细胞进行分析。作者首先使用Hep3B和MHCC-97H肝细胞癌细胞建立了稳定的ASPDH过表达细胞系。定量分析显示，转染细胞的ASPDH表达显著上调，证实了过表达模型的成功构建（图3A）。与oe-NC组相比，oe-ASPDH组中Hep3B和MHCC-97H细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力受到显著抑制。这表明调节ASPDH会影响肝癌细胞的功能（图3B-E）。为了研究ASPDH在Hep3B和MHCC-97H细胞中的功能，作者通过siRNA转染下调了Hep3B和MHCC-97H细胞中的ASPDH表达。qRT-PCR结果显示，si-ASPDH#1和si-ASPDH#2组的ASPDH mRNA表达水平显著低于si-NC组（图S1A），表明转染效果良好且ASPDH被有效沉默。在细胞增殖测定中，CCK-8分析显示，si-ASPDH#1和si-ASPDH#2组的细胞增殖能力在12小时、24小时和48小时时显著高于si-NC组（图S1B）。EdU测定进一步确认，ASPDH敲低后细胞活力显著增加（图S1C）。关于迁移和侵袭能力，Transwell测定结果显示，si-ASPDH#1和si-ASPDH#2组的迁移和侵袭细胞数量显著高于si-NC组（图S1D）。总之，ASPDH敲低显著增强了Hep3B和MHCC-97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

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图3. ASPDH过表达可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。(A) ASPDH的表达。(B) 细胞增殖。(C) 使用EdU分析细胞增殖。(D) 使用克隆测定分析细胞增殖。(E) 使用Transwell测定测量细胞迁移和侵袭。*表示与oe-NC组相比p < 0.05。

ASPDH可以负调节乳酸水平及PD-L1表达
上述结果表明，乳酸相关基因ASPDH可以干预肝癌细胞的功能。有必要进一步研究其对乳酸分泌的影响。乳酸检测试剂盒检测显示，过表达ASPDH的Hep3B和MHCC-97H细胞中的乳酸分泌显著减少。因此，ASPDH可以抑制乳酸分泌（图4A）。ASPDH与免疫检查点CD274（PD-L1）呈负相关（图4C）。GSEA分析结果显示，ASPDH抑制了癌症中的PD-L1表达和PD-1检查点通路（NES = ?1.7051，p = 0.0001）（图4B）。研究表明，激活p65可以促进PD-L1的表达。因此，对PD-L1免疫检查点信号通路相关指标p65和PD-L1进行了定量分析。在细胞核中，ASPDH过表达后p65的表达减少，而在细胞质中则增加。在Hep3B和MHCC-97H细胞中，si-ASPDH#1和si-ASPDH#2组的细胞质中p65的表达增加。实验结果表明，在Hep3B和MHCC-97H细胞中，ASPDH敲低显著上调了核p65和PD-L1的表达，而这种上调在联合使用NF-κB抑制剂三萜类化合物（50 nM）处理后被部分逆转。具体来说，与si-NC组相比，si-ASPDH组显示出明显的核p65和PD-L1表达增加。相比之下，si-ASPDH + 三萜类化合物组的这两种蛋白质表达水平均低于si-NC组。这些发现证实，ASPDH通过调节p65的核转位来正向调节PD-L1的表达，提示NF-κB通路在ASPDH介导的PD-L1调节中起关键作用（图4E）。PD-L1的ROC曲线分析显示AUC值为0.8，表明ASPDH表达可能与患者对PD-L1免疫治疗的反应相关（图4F）。ASPDH过表达后，Hep3B和MHCC-97H细胞中的乳酸水平和PD-L1表达均降低。

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图4. ASPDH可以抑制乳酸水平和PD-L1表达。(A) 乳酸水平的检测。(B) PD-L1表达的GSEA可视化。(C) 映射图显示免疫检查点与ASPDH之间的关系。(D) 使用Western blot分析p65（核）、p65（细胞质）和PD-L1的表达。(E) 使用Western blot分析p65（核）和PD-L1的表达。(F) ROC曲线。(G) CCK-8分析细胞增殖。(H和I) 细胞迁移和侵袭的分析。(J) 使用Western blot检测癌症信号通路相关指标（p65（核）、p65（细胞质）、PD-L1）的PD-L1表达。(J) *表示与oe-NC组相比p < 0.05。

为了进一步研究乳酸在ASPDH介导的生物效应中的作用，作者在过表达ASPDH的细胞中进行了乳酸钠挽救实验。CCK-8细胞增殖分析显示，与oe-ASPDH组相比，oe-ASPDH+Lac组的细胞增殖能力显著增加，尽管其增殖水平仍低于对照组和oe-NC组（图4G）。类似地，细胞迁移和侵袭实验表明，外源性乳酸钠处理部分逆转了ASPDH过表达对肝细胞癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用（图4H和4I）。此外，西方印迹分析表明，经过乳酸钠处理后，核p65和PD-L1的表达水平与oe-ASPDH组相比有所增加，但仍低于对照组和oe-NC组；相反，胞质p65的表达呈现相应的下降趋势（图4J）。这些结果共同表明，乳酸参与了ASPDH对NF-κB激活、PD-L1表达以及增殖和迁移能力的调节过程。

关于乳酸相关基因ASPDH的表达是否与药物敏感性有关，值得进一步研究。oncoPredict预测显示，高ASPDH表达的患者对12种药物表现出更高的敏感性，包括索拉菲尼（Sorafenib）、阿糖胞苷（Cytarabine）、CDK9、GNE-317、多西他赛（Docetaxel）、Pevonedistat、Trametinib、表柔比星（Epirubicin）、放线菌素D（Dactinomycin）、PD0325901、Buparlisib和Dactolisib（图5）。总之，乳酸相关基因ASPDH的过表达可以提高肝癌患者的药物敏感性。

上述结果表明，高ASPDH表达的肝癌患者对药物更敏感。因此，作者希望进一步在基因水平上分析差异。结果显示，在高ASPDH表达下，这些基因的突变率较高，例如CTNNB1（34%）、TP53（24%）、MUC16（15%）等。主要突变类型包括错义突变（Missense Mutation）、移码突变（Frame_Shift_Del）和帧内缺失突变（In_Frame_Del）。然而，在低ASPDH的情况下，这些基因不仅出现错义突变，还出现无义突变。这项分析揭示了与肝癌中ASPDH表达水平差异相关的多个基因突变，包括TP53、TTN和MUC16。在突变负担方面，高ASPDH表达的患者中有144个样本（90%）检测到基因组改变，而低ASPDH表达的患者中有178个样本（93.19%）（图6）。总之，ASPDH可能与肝癌患者的体细胞突变有关。

为了研究ASPDH过表达对Hep3B细胞体内生长的影响，体内实验结果显示，与oe-NC组相比，oe-ASPDH组的肿瘤生长趋势明显较慢（图7A）。此外，肿瘤照片和重量测量显示oe-ASPDH组的肿瘤体积和质量均显著减少（图7B）。西方印迹分析进一步证实，oe-ASPDH组的ASPDH蛋白表达显著上调，同时胞质p65水平升高，而核p65和PD-L1表达显著下调（图7C）。这些发现表明，ASPDH过表达可能通过抑制p65向核内的转移及其下游PD-L1表达来抑制肝癌的发展。结果与初步假设一致，表明ASPDH具有治疗肝癌的潜力。

在这项研究中，作者基于320个与乳酸代谢相关的基因建立了一个预后风险模型，确定了四个具有临床意义的核心基因（LPCAT1、TMEM220-AS1、ASPDH和LECT2）。值得注意的是，ASPDH表达较低的肝癌患者的生存结果显著更差。机制上，ASPDH与免疫检查点PD-L1表现出强烈的负相关，并具有肿瘤抑制作用；其过表达不仅抑制了Hep3B和MHCC-97H细胞的增殖，还同时减少了乳酸的产生和PD-L1的表达。乳酸还通过抑制CD8+细胞的功能来调节先天性和适应性免疫细胞的代谢，包括T细胞、自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤T（NKT）细胞和树突状细胞。乳酸富集评分较高的肝癌患者预后较差。进一步筛选与乳酸代谢相关的基因簇后，确定了四个基因：TMEM220-AS1、LECT2和ASPDH。尽管这些基因在肝癌中的具体机制尚未完全明了，但其中三个（LPCAT1、TMEM220-AS1和LECT2）已被报道会影响患者的生存。在肝癌异种移植模型中，LECT2通过抑制血管生成来抑制肿瘤生长。lncRNA TMEM220-AS1通过调节TMEM220/β-连环蛋白轴来抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。生存分析显示，低ASPDH表达与不良预后相关。PD-L1表现出 strong 诊断价值（AUC = 0.8），支持其作为生物标志物的潜力。目前的生存分析也与这些发现一致：LPCAT1的高表达与肝癌患者的不良预后相关，而TMEM220-AS1、LECT2和ASPDH的低表达也与不良结果相关。

目前的功能研究表明，ASPDH过表达足以显著降低Hep3B和MHCC-97H细胞的乳酸分泌，表明ASPDH作为乳酸产生的强效负调节因子。作为天冬氨酸代谢的关键酶，ASPDH过表达可能改变细胞内天冬氨酸的代谢流。这可以分为两个方面：糖酵解的最终产物丙酮酸是乳酸脱氢酶（LDH）生成乳酸的直接底物。ASPDH过表达可能促进天冬氨酸向其他代谢途径（如草酰乙酸）的转化，这一过程可能间接消耗丙酮酸或竞争细胞内的还原 equivalents（NADH），从而减少可用于乳酸生成的丙酮酸量。ASPDH可能通过再氧化途径促进乳酸的再利用，从而增强TCA循环。天冬氨酸代谢与TCA循环密切相关。ASPDH活性的增加可能提高TCA循环中间体的水平，这不仅提升了线粒体氧化磷酸化能力——将细胞从依赖糖酵解的Warburg效应转变为更高效的能量生产模式——还可能增强细胞通过单羧酸转运蛋白（MCTs）重新摄取现有乳酸的能力。观察到的乳酸分泌减少可能是“抑制糖酵解流”和“促进乳酸再利用”共同作用的结果，而不仅仅是其中任何一个机制单独作用的结果。本研究的实验结果更倾向于支持“促进乳酸循环”起关键作用的观点。最直接的证据来自功能挽救实验：外源性乳酸补充可以部分逆转ASPDH过表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和p65/PD-L1信号通路的抑制作用。如果ASPDH的作用仅仅是单向抑制糖酵解流和减少乳酸生成，那么补充乳酸作为最终产物不应有效恢复这些细胞功能。相反，乳酸的“挽救”作用强烈表明，ASPDH过表达可能创造了一种代谢环境，在这种环境中，细胞对乳酸的利用或乳酸介导的信号传导变得至关重要。这与“ASPDH作为再氧化底物促进乳酸进入TCA循环”的假设相符。当ASPDH上调时，细胞可能更依赖乳酸作为碳源，导致内源性乳酸的隔离和消耗，从而减少其分泌。一旦补充外源性乳酸，细胞代谢和功能部分恢复。此外，ASPDH过表达抑制NF-κB的核内转移，NF-κB是一种关键的促炎和促生存转录因子。鉴于NF-κB信号已被广泛报道可上调与糖酵解相关的基因并促进类似Warburg效应的代谢重编程，本研究中观察到的NF-κB活性抑制与乳酸分泌减少在表型上是一致的。

在最近的研究中，发现来自肿瘤的乳酸可以通过NF-κB/COX-2途径诱导PD-L1的表达。此外，乳酸-H+可以延长中性粒细胞的寿命，部分促进PD-L1的表达。机制上，它增加了核p65和PD-L1的水平，同时减少了胞质p65。NF-κB的抑制（triptolide）逆转了这些效应，证实ASPDH通过p65的核内转移来调节PD-L1。体内异种移植模型显示，ASPDH过表达减弱了肿瘤生长，这与核p65和PD-L1水平的降低一致。这支持了体外数据，将ASPDH定位为NF-κB/PD-L1轴的负调节因子。胞质p65积累与PD-L1下调的一致性进一步表明，ASPDH将p65隔离在胞质中，限制了其转录活性。GPR81受体途径是一个重要的潜在机制。乳酸是GPR81的天然激动剂。在肿瘤微环境中，乳酸与肿瘤细胞或免疫细胞表面的GPR81结合可以触发G蛋白偶联的信号级联，最终导致p65亚单位的释放和核内转移。最近发现的组蛋白乳酸化修饰提供了另一种直接的表观遗传调控机制。乳酸可以作为组蛋白（如H3K9la）共价修饰的前体。这种修饰通常发生在基因启动子区域，与基因激活相关。因此，乳酸可能通过增加细胞内的乳酸浓度直接增强NF-κB靶基因（如PD-L1）启动子处的组蛋白乳酸化水平，从而上调其转录。这一过程甚至可以独立于传统的NF-κB核内转移发生。在本研究中，作者将观察到的效应归因于NF-κB/p65的核内转移。然而，这可能是上述上游事件（如GPR81信号或乳酸驱动的转录活性增加）的下游表现。在核内观察到的p65积累可能是GPR81通路激活的直接结果，或者是由于乳酸化导致PD-L1等基因转录增加后的反馈反应。作者承认，将这一现象主要归因于NF-κB激活而未完全阐明具体的上游机制是本研究的局限性。外源性乳酸部分挽救表型可能是由于补充的浓度未能完全恢复内源性乳酸微环境，或者因为GPR81信号和乳酸化修饰在调节NF-κB中起协同或不同的作用。为了澄清ASPDH调节p65核定位的上游机制，未来的研究应重点区分GPR81受体信号和组蛋白乙酰化的各自作用。一个关键的实验方向是在分别或同时阻断GPR81信号、乳酸代谢和组蛋白乳酸化的情况下调节ASPDH，然后系统分析p65核内转移的变化。这一策略将有效确定ASPDH是通过影响乳酸-GPR81轴还是通过改变表观遗传景观来调节NF-κB活性的。

尽管本研究表明ASPDH显著影响乳酸代谢和癌症进展，但作者承认其更广泛的代谢作用和潜在的补偿机制仍有待充分阐明。先前的研究表明，当糖酵解或乳酸相关途径受到干扰时，癌细胞可以激活替代代谢途径，如谷氨酰胺代谢、脂肪酸氧化和丝氨酸/甘氨酸代谢。虽然这些发现主要集中在乳酸代谢上，但ASPDH也可能与其他代谢网络相互作用，包括戊糖磷酸途径、脂质生物合成和线粒体氧化还原平衡，这可能会影响治疗效果。此外，随着时间的推移，补偿性适应可能会缓解ASPDH抑制的效果，正如其他代谢干预所观察到的那样。最后，由于缺乏商业检测方法，未能直接测量ASPDH的酶活性，这也是一个局限性。未来的研究将致力于建立一种可靠的方法来确认其生化功能。未来的研究将使用系统水平的代谢组学和长期扰动实验来揭示这些潜在的适应，并确定ASPDH的作用是否因癌症类型的不同而异。在药物方面，基于ASPDH的表达水平，预测了12种药物的敏感性：索拉菲尼、阿糖胞苷、CDK9、GNE-317、多西他赛、Pevonedistat、Trametinib、表柔比星、放线菌素D、PD0325901、Bupalicib和Dactolisib。其中，索拉菲尼、阿糖胞苷、CDK9、多西他赛、Trametinib、表柔比星和PD0325901已被报道可用于治疗肝癌。GNE-317 被用于治疗胶质母细胞瘤。40 达卡替霉素（Dactinomycin）适用于复发性或持续性子宫内膜癌的治疗。41 然而，需要注意的是，达卡替霉素具有已知的肝毒性风险，这对其在肝癌患者中的潜在应用提出了严重的安全性问题。42 布帕利西布（Bupalicib）已被用于乳腺癌的治疗。43 达科利西布（Dactolisib）显示出对抗前列腺癌的潜在疗效。44 鉴于这些预测仍处于探索阶段，药物列表应被视为需要经过充分实验验证的候选药物，而非直接的治疗选择。值得注意的是，五种药物——GNE-317、达卡替霉素、帕博西替布（Palbociclib）、达科利西布和培沃尼司他（Pevonedistat）——在肝癌中的治疗机制尚不明确，未来的研究必须通过体外、体内和机制研究系统地评估它们的疗效和毒性，以评估其临床转化潜力。

**结论**
总之，通过生物信息学筛选鉴定出的与乳酸代谢相关的基因 ASPDH 能有效抑制 PD-L1 的表达。在 ASPDH 过表达后，Hep3B 和 MHCC-97H 细胞中的乳酸分泌减少，其增殖、克隆形成能力、迁移能力和侵袭性也减弱。ASPDH 通过调节乳酸代谢和 NF-κB/PD-L1 信号通路来抑制肝癌进展。这些发现有助于进一步了解某些与乳酸代谢相关的基因在肝癌中的作用。

**数据可用性**
支持本研究的数据包含在文章中。

**伦理审批**
本研究已获得湖南省人民医院医学伦理委员会的批准（批准编号 [2024]?69）。动物实验程序符合 ARRIVE 指南及相关法规。

**参与同意**
不适用。

**发表同意**
不适用。

**资金**
作者声明在准备本手稿过程中未收到任何资金、资助或其他支持。

**作者贡献声明**
丁莉（Ding Li）：数据整理、正式分析、数据可视化、方法学、初稿撰写。
李慕兹（Muzi Li）：数据整理、正式分析、数据可视化。
严梦凡（Mengfan Yan）：数据整理、正式分析。
熊圆圆（Yuanyuan Xiong）：数据整理、验证、正式分析、审稿与编辑。