基于针对VP6保守表位的单克隆抗体的新型阻断ELISA方法的开发，用于检测猪A型轮状病毒

《International Journal of Biological Macromolecules》：Development of novel blocking ELISA based on a monoclonal antibody targeting conserved epitopes on VP6 for evaluating porcine rotavirus A

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摘要

轮状病毒（RV）是导致婴儿和多种幼小动物病毒性腹泻的主要病原体，其中A组轮状病毒（RVA）最为常见。猪轮状病毒A型（PoRVA）会引起仔猪严重的胃肠炎。VP6是PoRVA中一种具有免疫原性的保守蛋白，是开发诊断试剂和疫苗的理想靶标。目前用于检测PoRVA抗体的间接ELISA方法容易出现假阳性结果，而阻断ELISA（bELISA）则具有更高的特异性，因此开发针对VP6的阻断抗体至关重要。在本研究中，构建了一种高表达VP6的CHO-K1细胞系，获得了具有良好免疫原性的VP6蛋白。随后利用杂交瘤技术制备出了一种具有阻断活性的单克隆抗体mAb-3B3。分子对接和分子动力学模拟结果表明，mAb-3B3与VP6之间的结合可靠且稳定，并确定了关键的相互作用氨基酸Tyr159、Thr367和Val236，这些信息为新型疫苗的设计提供了结构基础。基于mAb-3B3，首次开发出了一种bELISA方法。通过ROC曲线分析（50份阴性样本和50份阳性样本），确定了临界值为23.23%，其AUC为0.9973，敏感性和特异性分别达到98.04%。该bELISA能够明确区分阳性与阴性血清。此外，该检测方法与针对六种常见猪病原体的抗血清无交叉反应。在186份临床样本中，该检测方法与间接荧光抗体检测的结果一致性达到95.65%，证明了其实际应用价值。凭借高特异性、高敏感性和良好的重复性，该bELISA适用于PoRVA的临床诊断以及疫苗诱导免疫力的评估，有助于有效控制RVA的传播。