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在过去的十年中，重组蛋白疗法已经从传统的生物制剂向高度工程化、多功能版本发展。得益于合成生物学、宿主细胞工程和生物工艺优化方面的创新，蛋白质不仅越来越多地被视为替代疗法的药物，更被视为旨在实现功能重编程的创新疗法中完全通用的平台。从优化的微生物菌株到哺乳动物和
在过去的十年中，重组蛋白疗法已经从传统的生物制剂向高度工程化、多功能版本发展。得益于合成生物学、宿主细胞工程和生物工艺优化方面的创新，蛋白质不仅越来越多地被视为替代疗法的药物，更被视为旨在实现功能重编程的创新疗法中完全通用的平台。从优化的微生物菌株到哺乳动物和植物平台等宿主系统的进步，已经扩展了能够以高保真度、可扩展性和安全性生产的蛋白质范围。与此同时，模块化蛋白质工程已经催生了下一代形式，包括双特异性抗体、纳米抗体、融合蛋白和自组装生物材料，拓宽了在肿瘤学、炎症、代谢疾病及其他领域的治疗应用。同时，监管框架正在进行调整，以支持个性化和复杂生物制剂的加速批准，而分散化和灵活的生产模式也开始出现。本综述提供了重组蛋白药物领域的2025年更新，整合了生产平台、蛋白质工程和监管科学方面的进展，并概述了这些技术如何塑造下一代生物制剂。
1 引言
许多人类疾病，如糖尿病、生长障碍和凝血异常，源于关键内源蛋白的缺乏或功能障碍，这些小分子药物无法治愈。基因疗法在原位纠正方面具有前景，但其临床转化仍受限于递送、安全性和可扩展性方面的挑战。因此，此类缺失蛋白质的体外生产重组版本仍然是主要的干预模式。历史上，治疗性蛋白质是通过从动物或人类组织中提取获得的，这种方法存在安全性、免疫原性、供应和伦理问题。化学合成对于小肽有效，但随着近期合成和连接策略的进步，对于更大或结构更复杂的多肽也变得越来越可行。然而，它在复杂性、可扩展性和成本方面仍然存在重大挑战，特别是对于长肽和大蛋白质。二十世纪末出现的重组DNA技术提供了一种安全、可扩展和模块化的替代方案，能够在异源宿主（细胞工厂）中控制生产治疗性蛋白质，而不受蛋白质长度和结构复杂性的影响。这一突破不仅为野生型多肽打开了大门，也为具有新功能或改进功能的工程化或嵌合蛋白打开了大门。然而，重组生产仍面临与蛋白质溶解度和构象质量相关的顽固挑战，这需要对宿主系统和生产方案进行仔细选择，以确保最终产品的活性和稳定性。
近几十年来，蛋白质生物制造平台已急剧多样化。大肠杆菌(Escherichia coli)开启了高通量蛋白质合成的时代，但其无法进行翻译后修饰，导致开发了更复杂的宿主，如酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物系统。最近，非常规宿主细胞如苔藓和藻类也已出现。无细胞系统代表了一种规模不大但不断增长的替代方案，克服了细胞应激和污染问题。每个平台在产量、折叠保真度、糖基化潜力和可扩展性方面提供特定的平衡；尽管哺乳动物细胞仍然是复杂糖蛋白的金标准，但昆虫和无细胞系统对于快速原型设计和定制应用越来越有价值。
截至2024年中，已有894种治疗性肽和蛋白质获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，大多数已上市的治疗性蛋白质是重组的，主要在哺乳动物细胞中生产。这一扩张反映了该领域的成熟和下一代蛋白质的兴起，下一代蛋白质通常指与天然对应物相比具有改进的稳定性、特异性、半衰期和多功能性的工程化蛋白质版本。这一演进的一个基石是融合蛋白的发展，即将来自不同来源的功能域（例如，靶向部分、效应区、半衰期延长剂）组合到单一链中的混合构建体。Fc融合和自蛋白融合等策略利用FcRn再循环或自蛋白持久性来延长半衰期。融合策略不仅简化了多域功能，还实现了新的模式，如双特异性抗体和抗原清除构建体。另一方面，作为进一步的操作工具，合理设计和定向进化方法被广泛用于增强蛋白质稳定性、优化折叠和减少蛋白质药物的聚集。有针对性的突变也可以优化效应功能，包括受体结合和免疫激活，从而提高治疗效果和特异性。这些以蛋白质为重点的策略与生物工艺创新相辅相成，为开发性能更好的治疗性蛋白质做出了重大贡献。
尽管如此，长期的瓶颈仍然挑战着该领域。可扩展性常常受到限制，因为复杂或易聚集蛋白质的大规模生产会诱导宿主细胞应激反应并使下游步骤复杂化。制剂和储存期间的蛋白质稳定性需要量身定制的赋形剂、缓冲系统或序列修饰。生产后聚集尤其令人担忧，因为它会降低生物活性并增加免疫原性。高通量热分析、深度突变稳定性工程和AI引导设计等新兴技术提供了有前景的解决方案，尽管它们在生物制造中的广泛采用仍有待时日。
2 生物制造
2.1 常规细胞工厂
治疗性重组蛋白质的生产历史上依赖于一组有限的细胞工厂，每种都在产量、翻译后修饰(PTMs)、可扩展性和监管接受度方面提供权衡。然而，越来越多的非常规系统也被纳入生产流程，提供了克服现有局限性的新机会。宿主系统的选择至关重要，因为它不仅决定了生产效率，还决定了最终产品的安全性、有效性和监管批准前景。
没有一个细胞工厂是普遍最优的，选择在很大程度上取决于治疗性蛋白质的复杂性和所需的PTMs。大肠杆菌仍然是胰岛素和生长激素等简单蛋白质的主力，这得益于其快速生长和低成本。它也被探索用于生产复杂的药理学实体，包括基于蛋白质的纳米颗粒、微粒和动态药物库。然而，缺乏糖基化、存在内毒素以及经常需要蛋白质重折叠仍然是主要缺点。酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)提供了简单、快速和可扩展的培养，但它们的高甘露糖基化模式可能会影响产品的药代动力学并促进免疫原性。在哺乳动物细胞中，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞主导了生物制药市场，生产了超过70%的已批准重组蛋白，因为它们具有类人糖基化和既定的监管接受度，尽管成本更高、倍增时间更慢。此外，哺乳动物细胞允许生产复杂组装蛋白质材料和药物。由杆状病毒载体驱动的昆虫细胞提供了快速的可扩展性，对于病毒样颗粒(VLPs)和疫苗生产特别有效，尽管它们不同的糖基化谱限制了其在治疗性糖蛋白中的使用。比较分析可以突出表现出色的点，这通常取决于具体的产品。
总而言之，当前的格局说明了成本、速度和分子保真度之间的权衡。虽然微生物宿主在结构简单的小蛋白方面占主导地位，但哺乳动物系统对于复杂糖蛋白如单克隆抗体和一些融合蛋白仍然是不可或缺的。用于蛋白质生产的新型或工程化细胞工厂的研究正在不断推进。新兴宿主，如苔藓(Physcomitrella patens)、藻类、乳酸菌(LAB)和原生动物系统，正在小众应用中受到关注，能够实现工程化的人源化糖基化和更低的免疫原性，尽管它们尚未实现大规模的工业渗透。
尽管在宿主工程和糖工程方面取得了进展，但几个瓶颈仍然存在。实现均质和类人糖基化谱仍然具有挑战性，特别是在非哺乳动物宿主中。超越N-和O-糖基化的复杂翻译后修饰难以精确控制。此外，对糖基化网络的不完全理解以及工程化糖型的潜在免疫原性继续限制了工艺优化和监管批准。解决这些问题对于充分利用新兴宿主系统并以工业规模生产具有精确结构和功能属性的重组蛋白至关重要。
2.2 替代蛋白质生产平台
在过去十年中，出现了一系列多样化的替代宿主，以补充或克服主流微生物和哺乳动物系统的局限性。这些平台受到对更安全、更高效和更具成本效益的生产策略需求的推动，同时也解决了内毒素污染或非人糖基化等挑战。总的来说，它们正在拓宽重组蛋白质生产的格局，特别是对于需要量身定制修饰和更高安全标准的下一代疗法。
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莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii): 这种单细胞绿藻作为一种低成本、可扩展且无致病性的宿主受到关注，不产生内毒素。转化可以靶向细胞核、线粒体或叶绿体，其中叶绿体工程是最常见的方法。该系统已被用于生产抗原、抗体、抗菌肽、激素和酶。此外，基于藻类的平台已被探索用于口服疫苗生产，甚至用于生产针对病毒的重组抗体。主要缺点是在叶绿体中缺乏糖基化途径，这限制了对复杂糖蛋白的适用性。
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胡萝卜细胞: 基于胡萝卜(Daucus carota)细胞的平台越来越被认为是重组蛋白质生产的可行宿主。胡萝卜的悬浮培养物和毛状根系统已证明能够表达生物药物。这种系统的优势包括植物型翻译后修饰、病原体污染风险低以及可扩展生产。
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乳酸乳球菌(Lactococcus lactis): 这种革兰氏阳性菌广泛用于食品工业，被公认为安全(GRAS)且不具有免疫原性内毒素，使其对治疗性蛋白质生产具有吸引力。它的遗传可塑性允许高效工程化。此外，其将蛋白质直接分泌到培养基中的能力简化了纯化，提高了可扩展性和成本效益。
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塔氏利什曼原虫(Leishmania tarentolae): 这种原生动物提供了与人类糖基化模式非常相似的翻译后修饰。与哺乳动物细胞不同，它更容易、更便宜地培养，同时仍能生产达依泊汀α等复杂蛋白质。此外，它已被用于生产凝血因子和疫苗抗原，证明了其在各个治疗领域的多功能性。该系统显著降低了通常与酵母或昆虫来源蛋白质相关的免疫原性问题，使其对有前景的糖蛋白药物有希望。
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小立碗藓(Physcomitrella patens): 这种苔藓结合了植物系统的可扩展性和低成本，以及执行工程化人源化糖基化的能力。它在生物反应器中受控条件下培养，确保了可重复性和安全性。除了法布里病酶替代疗法和因子H，苔藓也被测试用于重组抗体和凝血抑制剂。这个平台特别适用于难以表达的糖蛋白和疫苗。
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糖工程酵母: 毕赤酵母仍然是一种强大的微生物宿主，具有高产量和可扩展性。其主要限制是高甘露糖基化导致的免疫原性，这已通过糖工程菌株如GlycoSwitch?解决，该菌株可产生人源化N-聚糖。应用包括工程化抗体和溶酶体酶。虽然可能发生不完全或异质的糖基化，但持续的改进现在能够一致地生产候选治疗药物和免疫原。
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无内毒素大肠杆菌: 标准大肠杆菌仍然是最广泛使用的宿主，但其脂多糖(LPS)是一个主要的免疫原性问题。工程化菌株如ClearColi?产生去毒的LPS变体，大大降低了与内毒素相关的风险。除了功能蛋白，这些系统已被应用于疫苗和酶生产。然而，与传统菌株相比，产量通常较低，这可能会影响成本效益。
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转基因鸡蛋: 在转基因动物平台中，转基因鸡蛋代表了一种有趣的生物生产平台，其中重组蛋白在输卵管中产生并积聚在蛋清中，实现可扩展的收集。该系统支持适当的折叠和翻译后修饰，并已成功应用于生产抗体和细胞因子等治疗性蛋白质。然而，产量的可变性和对专门转基因系的需求仍然是重要的限制。
2.3 生产系统间的成本权衡
从制造角度来看，所有这些平台在成本和工艺复杂性方面也存在显著差异，反映了培养基需求、生长动力学、基础设施和下游加工要求的变化。微生物系统通常提供最低的生产成本和最快的周转时间，但可能产生与蛋白质重折叠和纯化相关的额外费用。酵母和昆虫细胞系统提供中等成本状况，在可扩展性和部分翻译后修饰能力之间取得平衡。相比之下，如CHO细胞等哺乳动物平台涉及显著更高的资本和运营支出，这是由于复杂的培养条件和严格的监管要求，但对于生产结构复杂且经过临床验证的糖蛋白仍然是不可或缺的。如乳酸乳球菌、利什曼原虫、苔藓、微藻、植物细胞系统和转基因鸡蛋等新兴平台正在被积极探索，以进一步优化成本效益和可扩展性。这些系统能够实现量身定制的翻译后修饰，减少对常规哺乳动物细胞工厂的依赖。然而，它们的工业采用仍然有限，通常受到监管不确定性、工艺标准化挑战以及缺乏大规模制造经验的限制。在这种背景下，平台选择通常由成本-质量权衡驱动，其中降低的制造成本必须与对分子保真度、产品功能和监管合规的需求仔细权衡。
3 蛋白质药物工程创新
3.1 改进天然蛋白质
虽然宿主系统定义了生产重组蛋白的基本能力，但创新越来越多地来自于工程化蛋白质本身，从而产生了新颖的治疗形式。治疗性蛋白质已经彻底改变了癌症、自身免疫和传染病的治疗，使其成为增长最快的生物制剂类别之一。然而，其全部临床潜力常常受到次优药代动力学的限制，例如半衰期短、稳定性低以及需要频繁给药，这反过来限制了疗效，增加了免疫原性风险，并提高了生产成本。为了克服这些障碍，已经开发了多种策略，包括氨基酸工程、与天然或合成聚合物的共轭、基因融合和靶向递送系统。生产相关的异质性代表了另一个挑战，因为它会影响稳定性、药代动力学和免疫原性。
在这种情况下，一个核心方法是开发生物类似药的改进型，即已批准生物制剂的工程化版本，旨在在半衰期、免疫原性、稳定性和给药方案方面提供具有临床意义的改进，超越了生物相似性的范围。聚乙二醇化、Fc融合和自蛋白结合技术的进步推动了下一代生物治疗药物的创造，这些药物结合了增强的药理特性和既定的安全性及可扩展制造。
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聚乙二醇化、酰化和脂化: 聚乙二醇化是将聚乙二醇链共价连接到治疗性蛋白质上的过程，可提高溶解度，屏蔽酶促蛋白水解和快速肾脏消除。然而，针对PEG的免疫反应已有报道。此外，聚乙二醇化有时可能会降低内在活性，需要在药代动力学益处和功能保留之间取得平衡。其他限制包括缺乏生物降解性和组织积累、注射部位和器官特异性毒性以及制造复杂性。为了应对这些限制，已经出现了超越基于PEG方法的替代半衰期延长策略。可生物降解的聚合物偶联物以及重组融合策略，旨在保留空间屏蔽和药代动力学益处，同时减少长期积累和免疫原性。
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Fc融合蛋白: 通过将治疗性蛋白连接到人IgG的Fc区产生，Fc融合蛋白药物通过FcRn介导的再循环延长血清半衰期，实现二聚化，并可赋予效应功能。然而，该策略也存在重要限制，如结构不稳定性、蛋白水解降解、设计敏感性，以及上游和下游生物加工复杂性的增加。
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自蛋白融合和自蛋白结合方法: 基于自蛋白的蛋白质构建体利用自蛋白在循环中的长持久性。重组自蛋白或工程化的自蛋白结合域可以与治疗性蛋白融合，增加半衰期和稳定性。这些技术也带来了一些限制，包括可能改变药物的功能特性和免疫原性风险。
除了分子修饰，创新的递送系统正在改变蛋白质疗法。一个值得注意的例子是Susvimo?，一种可重复填充的眼部植入物，用于输送雷珠单抗治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性。它实现了长达6个月的持续释放，减轻了每月玻璃体内注射的负担。总的来说，这些技术说明了从天然蛋白质到具有优化药理学特征和临床结果的高度工程化生物类似药改进型的转变。未来的创新可能涉及定点偶联、PEG的替代品以及用于从头蛋白质设计的合成生物学平台。
3.2 下一代蛋白质治疗形式
基于这些进展，该领域现在正在超越天然蛋白质的简单或略微改进的版本，转向全新的治疗架构。虽然常规形式长期以来一直主导着该领域，但最近的进展催生了新一代创新的蛋白质疗法。这些设计超越了传统支架，融入了模块化、多特异性、增强的靶向性和受控递送。其中几种已经上市，而许多其他仍处于临床前或临床开发阶段，准备重塑治疗格局。
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抗体衍生形式:
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抗体片段: 此类别包括单链可变片段(scFvs)和抗原结合片段(Fabs)。两种形式都是截短的抗体，保留抗原结合能力但缺乏Fc区，从而改善了组织渗透并降低了免疫原性。它们较小的尺寸使得能够进入肿瘤或眼睛等传统抗体效果较差的隔室。已批准的产品包括brolucizumab、ranibizumab和abciximab。其他Fab基的例子包括certolizumab pegol和idarucizumab。
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纳米抗体: 纳米抗体是在骆驼科动物中天然发现的仅重链抗体的可变域，由单个抗原结合域组成。尽管尺寸小，它们仍保持完全的抗原结合能力，高度稳定，且易于工程化。其紧凑的结构使其能够识别较大抗体无法进入的隐蔽表位，并且它们也可以被格式化为多价或多特异性构建体。上市的例子包括caplacizumab、envafolimab和ozoralizumab。
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抗体药物偶联物: 抗体药物偶联物通过化学连接子将抗体与细胞毒性有效负载结合起来，实现选择性肿瘤细胞杀伤。连接子化学和有效负载多样性的进展扩展了其安全性和有效性。自2000年Mylotarg?首次获批以来，已有超过15种ADCs上市。
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双特异性T细胞衔接器: 双特异性T细胞衔接器被设计用于连接T细胞上的CD3和肿瘤抗原，促进直接的细胞毒性杀伤。它们提供了“活体药物”效应，而没有CAR-T疗法的复杂性，尽管细胞因子释放综合征和半衰期短是关键限制。下一代BiTEs整合了Fc区或自蛋白结合域以延长持久性并降低毒性。上市的例子包括blinatumomab、mosunetuzumab和teclistamab。
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类抗体形式: 非抗体、类抗体支架是模仿抗体结合的工程化蛋白质。它们通常比传统抗体小，高度稳定，易于在微生物宿主中生产，降低了制造复杂性和成本。其简化的支架还允许快速工程化结合亲和力和特异性。DARPins、adnectins、affibodies和anticalins是正在开发的重要例子，通常设计用于阻断信号分子如生长因子或炎性细胞因子。
另一方面，肽体代表了一种混合方法，其中生物活性肽与Fc域融合以增强其稳定性和半衰期。该肽提供治疗活性，而Fc域通过FcRn介导的再循环延长循环并促进大规模生产。这种设计使得原本不稳定的肽能够用于临床。Romiplostim和dulaglutide是这种策略临床成功的例证。
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受体模拟物: 受体模拟物蛋白质复制天然受体域，作为诱饵捕获病理配体，从而恢复信号通路中的稳态。与受体阻断剂不同，这些药物直接在循环中中和疾病介质。
