非洲猪瘟病毒基因I型和II型鉴别检测的四引物扩增阻滞突变系统-PCR（ARMS-PCR）的建立

《Transboundary and Emerging Diseases》：Establishment of a Tetra-Primer ARMS-PCR Assay to Discriminate Genotypes I and II African Swine Fever Viruses

非洲猪瘟（ASF）由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起，对全球养猪业和粮食安全构成持续威胁。目前，特别是已传播至非洲以外地区的基因I型和II型毒株，其控制策略严重依赖于以分子诊断为基础的生物安全措施。为满足基因分型需求，本研究建立了一种四引物扩增阻滞突变系统PCR（tetra-primer ARMS-PCR），能够区分基因I型和II型ASFV及其混合感染。该检测方法使用了四种引物的多重反应：一对通用的外侧引物，以及一对针对基因I型和II型ASFV特异性基因中一个保守单核苷酸多态性（SNP, G1656A）的等位基因特异性内侧引物。四引物ARMS-PCR检测的灵敏度为每反应100个拷贝，与世界动物卫生组织（WOAH）推荐的PCR方法相当，且与八种其他猪源病毒无交叉反应。此外，临床验证证实，该检测方法与标准的WOAH推荐PCR方法的一致性率达97.22%（35/36）。总之，四引物ARMS-PCR为ASF流行病学监测提供了一种实用、特异且经济高效的工具，非常适用于资源有限地区以及基因I型和II型ASFV共循环的地区。

论文解读：建立一种区分非洲猪瘟病毒基因I型和II型的四引物ARMS-PCR检测方法

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种具有高度传染性和致死性的病毒性疾病，对全球养猪业和粮食安全构成严重威胁。ASFV的基因（编码p72蛋白）C端478个核苷酸区域的序列变异，是区分其至少24个基因型的基础。其中，基因I型和II型是唯一传播至非洲大陆以外的基因型，对全球ASF的流行态势具有决定性影响。自2007年基因II型毒株在格鲁吉亚首次出现并迅速蔓延至欧、亚、美三大洲以来，全球ASF疫情进入了新的传播时代。然而，2021年中国重新出现基因I型毒株的报道，以及2023年以来在中国、越南和俄罗斯相继发现的基因I/II型重组病毒，使得ASFV的流行态势变得更为复杂。这些重组病毒的出现尤其令人担忧，因为它们可能逃避基于基因II型毒株的减毒活疫苗所提供的免疫保护。因此，建立能够准确、快速地区分基因I型和II型ASFV的检测方法，对于监测病毒演化、追踪疫情来源以及制定有效的防控策略至关重要。

目前，ASFV基因分型的“金标准”是基于基因C端区域的PCR测序，此外也存在基于高通量测序、悬浮芯片（xMAP技术）或多重定量PCR（qPCR）的检测方法。然而，这些方法通常需要昂贵的设备、荧光探针、特殊试剂和专业操作人员，在资源有限地区的应用受到限制。相比之下，基于单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）检测的四引物扩增阻滞突变系统PCR（tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR）具有操作简单、快速、可靠且成本效益高的优点，已被广泛应用于SNP检测和基因分型领域。本研究旨在开发一种基于基因中一个保守SNP位点的四引物ARMS-PCR检测方法，以期在单一PCR反应中即可区分基因I型、II型及其混合感染，为资源有限地区提供一种实用的基因分型工具。本研究成果发表在《Transboundary and Emerging Diseases》期刊上。

关键技术方法简述

研究团队利用已有的ASFV基因I型和II型毒株分离株（分别来自哈尔滨兽医研究所保存的SD/DY-I/21、HeN/ZZ-P1/21等5株基因I型毒株，以及HLJ/18、HuB/628/20等6株基因I型毒株）和构建的重组质粒pCAGGS-I和pCAGGS-II作为模板。首先，基于对126株ASFV分离株（78株基因I型，48株基因II型）基因的分析，研究人员鉴定出四个位于该基因C端区域的保守SNP位点，并选择了位于1656位的SNP（G₁₆₅₆A）用于四引物ARMS-PCR检测的开发。他们设计了两条针对该SNP的等位基因特异性内引物，并采用已报道的通用分型外引物P72-U和P72-D。通过优化引物组合、退火温度和引物浓度，确定了最佳反应体系。随后，利用标准质粒进行了检测限（Limit of detection, LOD）分析，并与世界动物卫生组织（WOAH）推荐的PCR方法进行了灵敏度比较。最后，使用36份来自感染基因I型或II型ASFV猪只的临床样本（血液、口腔和直肠拭子、脾脏、扁桃体和淋巴结等），对该方法与WOAH推荐PCR法的检测性能进行了比较验证。

研究结果

1. 1.
   四引物ARMS-PCR区分基因I型和II型ASFV的设计
   研究人员基于之前鉴定的基因C端四个保守SNP位点，选择了位于1656位的SNP3（G₁₆₅₆A）用于检测方法开发。利用通用分型引物P72-U和P72-D作为外侧引物，可扩增出所有ASFV共有的478 bp片段。同时，设计了两条分别针对基因I型和II型该SNP位点的等位基因特异性内引物（I-F和II-R）。当模板为基因I型时，I-F内引物与P72-D外引物配对产生310 bp的特异性片段；当模板为基因II型时，P72-U外引物与II-R内引物配对产生220 bp的特异性片段。对于I型和II型混合感染的样本，则可同时扩增出478 bp、310 bp和220 bp三条特征性条带（参见图1示意图）。
2. 2.
   四引物ARMS-PCR反应条件的优化
   利用pCAGGS-I和pCAGGS-II标准质粒作为模板，对反应条件进行了系统优化。结果显示，最佳扩增条件为：使用引物组合U/D/F2/R2，退火温度为52°C，引物P72-U、P72-D、F2和R2的浓度分别为0.8、0.8、0.4和0.4 pmol/μL（参见图2A-C）。此条件被用于后续所有实验。
3. 3.
   四引物ARMS-PCR检测方法的验证与分析特异性
   该方法成功区分了所有测试的基因I型（5株）和基因II型（6株）ASFV毒株，分别产生了相应的478 bp/310 bp和478 bp/220 bp片段组合（参见图3A）。特异性分析表明，该方法仅能扩增基因I型和II型ASFV的DNA，而对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病病毒（PRV）等其他八种常见猪病毒均无交叉反应（参见图3B），显示出良好的特异性。
4. 4.
   四引物ARMS-PCR与WOAH推荐PCR方法的分析灵敏度比较
   该检测方法对标准质粒pCAGGS-I（基因I型）和pCAGGS-II（基因II型）的检测下限均为每反应100个拷贝（参见图4A,B）。此灵敏度与使用PPA-1/2引物的WOAH推荐PCR方法相当，后者的检测下限同样为每反应100个拷贝（参见图4C,D）。
5. 5.
   使用临床样本对四引物ARMS-PCR与WOAH推荐PCR方法进行比较验证
   对36份临床ASFV阳性样本（18份基因I型，18份基因II型）的检测结果显示，对于基因I型样本，两种方法的检测结果完全一致（100%一致）。在18份样本中，15份为两种方法均阳性，3份为两种方法均阴性。对于基因II型样本，两种方法的总体一致率为94.4%（17/18），其中7份为两种方法均阳性，10份为两种方法均阴性，仅1份样本结果存在差异。分析表明，四引物ARMS-PCR方法能够准确检测出Ct值小于30的样本，而当样本Ct值高于30时，常规PCR的检测结果会变得不稳定（参见图5）。

讨论与总结

讨论部分总结：

本研究成功建立了基于ASFV（p72）基因1656位点SNP的四引物ARMS-PCR检测方法。鉴于目前仅有基因I型和II型ASFV传播至非洲以外，该方法在很大程度上足以满足非洲大陆以外地区对ASFV基因分型的当前需求，尤其在两种基因型共循环的地区具有重要价值。该方法的灵敏度（100拷贝/反应）与WOAH推荐PCR法相当，但略低于一种更新的通用ASFV PCR检测法（60拷贝），也低于之前报道的用于基因型区分的双重ARMS-qPCR检测法（10拷贝）。该方法能够成功地从多种临床样本（血液、拭子、组织）中同步区分基因I型和II型ASFV。需要指出的是，由于PCR技术本身固有的灵敏度限制，四引物ARMS-PCR的准确检测仅限于Ct值小于30的样本。未来通过优化PCR试剂和引物浓度，可能有助于提高检测灵敏度并减少非特异性扩增。此外，该方法使用的通用分型外引物P72-U和P72-D可扩增出几乎所有ASFV基因型共有的片段，但其针对基因I型和II型的内引物特异性，仍需针对其他基因型病毒进行进一步评估。同时，考虑到基因在流行过程中可能发生点突变，该检测方法的引物与靶序列的匹配度需要进行持续的监测。尽管qPCR是WOAH推荐的ASF分子诊断金标准，但常规PCR在缺乏精密设备或专业人员的资源有限实验室中仍具有广泛适用性。因此，四引物ARMS-PCR检测方法非常适合在资源有限的地区部署应用。

研究结论翻译：

四引物ARMS-PCR检测方法为当前非洲猪瘟的流行病学监测，特别是在基因I型和II型ASFV共循环的地区，提供了一种快速、特异且准确的工具。