围手术期关节感染研究中的新兴概念：RNA、DNA及蛋白质测序工具在围手术期关节感染特征分析与诊断中的应用

《The Journal of Arthroplasty》：Emerging Concepts in Periprosthetic Joint Infection Research: RNA, DNA, and Protein Sequencing Tools for the Characterization and Diagnosis of Periprosthetic Joint Infection

Nathanael D. Heckmann | Sahil S. Telang | Karan Goswami | Michael A. Mont | Jay R. Lieberman | Javad Parvizi
美国加利福尼亚州洛杉矶南加州大学Keck医学院骨科外科

**摘要**
历史上，骨科领域一直使用基于培养的诊断方法来帮助识别全关节置换术后（TJA）发生假体周围关节感染（PJI）的致病微生物。然而，传统培养技术在高达42%的病例中未能分离出致病微生物。这令人担忧，因为对于培养阴性的PJI患者来说，治疗是一个真正的挑战，通常需要长期使用多种抗菌药物。此外，向患者解释PJI的诊断结果、多次手术的必要性以及在没有明确致病微生物的情况下进行长期抗菌治疗也非常具有挑战性，这突显了诊断的不确定性，进而影响了预后判断、抗菌药物的选择以及共同决策过程。为了帮助识别致病微生物（特别是在培养阴性病例中），研究人员开发了新的测序技术，以更好地理解PJI的发病机制和感染复发情况。具体而言，下一代测序（NGS）技术（包括DNA测序和RNA测序以及基于蛋白质的分析）已成为有前景的工具。基于DNA的方法在临床实践中最为常用，与培养方法联用时表现出更高的敏感性和特异性。除了病原体检测外，基于RNA的测序还能提供宿主免疫反应和活性病原体基因表达的谱型分析。初步证据表明，基于RNA的测序技术还能够识别抗生素耐药基因。此外，这些新型测序工具还有助于阐明PJI的发病机制、描述微生物与宿主之间的相互作用，并提高对慢性及顽固性PJI的理解。

**临床意义**
尽管在成本和结果解读方面仍存在挑战，但基于测序的工具有可能提高诊断准确性、识别新的生物标志物、指导针对性抗菌治疗，并最终改善治疗效果并预防感染复发。此外，高分辨率测序平台揭示了临床表现相似的感染病例之间的异质性。总体而言，这些不断发展的技术代表了从简单的病原体检测向全面分析微生物身份、病原体活性和宿主反应的范式转变。

**引言**
下一代测序（NGS）等新型测序工具在骨科领域得到了越来越多应用，用于改进假体周围关节感染（PJI）的病原体检测，并更好地理解其发病机制。虽然传统的PJI病原体检测方法依赖基于培养的技术，但传统培养技术在高达42%的PJI病例中无法识别致病微生物，而在多微生物PJI病例中可能只能检测到一种（优势）病原体。[[1], [2], [3], [4], [5], [6]] 基于培养的方法的局限性，加上PJI的顽固性和高致残性，凸显了需要更全面的诊断方法和对其病理生理学更深入的理解。因此，NGS有可能变革微生物诊断方法。
NGS是一个涵盖多种测序技术的总称，为外科医生提供了快速测序DNA或RNA片段的不同方法。与传统的Sanger测序（依次顺序分析遗传物质）相比，NGS能够并行分析大量DNA或RNA，大大缩短了分析时间和成本。[7,8] 遗传测序是指确定构成DNA或RNA分子的核苷酸基序。测序通过“扩增”（复制少量DNA或RNA片段）来进行，然后读取这些片段的核苷酸序列。本文旨在介绍有助于改进病原体识别并阐明PJI病因的新兴分子技术，希望为PJI的诊断理念带来根本性转变，从单纯的基于培养的检测方法转向更全面地理解微生物基因表达和宿主免疫反应。我们希望这一综述能为骨科外科医生提供一个共同的语言基础，使他们能够在临床实践中 increasingly 遇到并解读这些新技术。

**基于DNA的方法**
特别是细菌16S rRNA测序和霰弹枪宏基因组测序，是骨科临床实践和PJI研究中最常用的NGS技术。这两种基于DNA的NGS方法可以识别并测量样品中的DNA（包括滑液、假体周围组织和超声处理液）中的微生物种类及其数量。基于DNA的NGS方法既可用于靶向分析（利用引物选择性地扩增特定区域），也可用于非靶向分析（测序样品中的所有DNA物质）。[[9], [10], [11]] 在PJI病例中，基于DNA的NGS技术在识别病原体方面具有诊断和治疗价值，同时还有助于选择合适的抗生素。

当“下一代测序（NGS）”这一术语用于临床环境时，通常指的是16S rRNA基因测序。16S rRNA基因包含所有细菌共有的高度保守的DNA区域，其不同变异可作为不同细菌种类和菌株的独特标识符。[[14], [15], [16], [17]] 因此，16S测序采用扩增子测序技术，选择性地靶向16S rRNA基因以生成短DNA片段（扩增子）。然后对这些扩增子进行测序，并与参考数据库进行比对，从而在属（如金黄色葡萄球菌）或种（如金黄色葡萄球菌）水平上识别细菌。
在PJI的研究中，早期研究发现16S测序在识别菌膜中的病原体（包括假体组件和不可吸收缝线材料上的病原体）方面具有实用性。[18,19] 因此，16S测序可能比传统诊断方法提供更全面的病原体信息。值得注意的是，在Goswami等人的的一项多中心研究中，他们对301例培养阴性的PJI病例进行了前瞻性评估，发现16S测序在65.9%的病例中成功检测到病原体，其中大部分感染为多微生物感染。[6] 该研究表明，16S测序可能比单纯依赖培养方法提供更全面的致病病原体信息。后续研究还比较了16S测序与培养方法的诊断准确性。[19] 一项为期两年的多中心横断面研究评估了264例疑似PJI患者和35例初次TJA患者的16S测序结果，结果显示其敏感性为73.3%，特异性为95.5%（根据美国感染病学会的标准）。[20] 此外，一项关于超声处理液样品的荟萃分析显示，16S测序的敏感性为76%，特异性为93%；而假体周围组织样品的敏感性为73%，特异性为95%。[21] 新的证据还表明，结合基因组学分析，16S测序有助于预测抗生素敏感性。[22] 总体而言，这些发现表明16S测序是一种可靠的辅助工具，可以提高微生物检测的准确性。

**然而，16S测序也存在局限性**
分析细菌负荷低或DNA提取不足的样本时，16S测序的敏感性存在问题。[20] 此外，像所有基于PCR的检测方法一样，16S测序也可能出现假阳性结果，因为它可能会扩增污染物和不可存活的细菌DNA。[20] 因此，需要细致解读16S测序结果，因为阳性结果不一定表示活跃的感染，应结合其他临床信息进行综合判断。

**与16S测序相比，霰弹枪宏基因组测序**
霰弹枪宏基因组测序以非靶向的方式分析生物样本中的所有核酸。[[23], [24], [25]] 具体来说，16S测序仅针对细菌中的16S rRNA基因，而霰弹枪宏基因组测序则分析生物样本中的所有DNA，以检测所有微生物（包括真菌）。[23], [24], [25]] 这使得霰弹枪宏基因组测序在识别真菌和培养阴性病例方面具有更高的物种级别分辨率，从而能够检测更广泛的微生物。[26], [27], [28]] 例如，在对408份超声处理液样本的分析中，Thoendel等人发现霰弹枪宏基因组测序在94.8%的培养阳性PJI病例中识别出致病微生物，并在9.6%的培养阳性样本中发现了新的潜在病原体。[29] 同样，在43.9%的培养阴性病例中也检测到微生物。[29] 此外，仅有3.6%的无菌手术失败病例出现阳性结果，表明该方法具有高特异性和低假阳性率。[29] 但在对158例PJI患者的后续研究中，Ivy等人的敏感性低于Thoendel等人的结果。[24] 使用Thoendel等人描述的测序方法，Ivy等人发现霰弹枪宏基因组测序在90%的培养阳性PJI样本、83%的培养阴性样本以及12%的无菌翻修样本中分别识别出病原体的属和种。[24] 当前关于霰弹枪宏基因组的文献报告的结果存在差异，但总体而言显示出良好的潜力。虽然16S测序和霰弹枪宏基因组测序在识别病原体方面各有优势，但它们的具体性能、成本效益和实际应用仍需进一步研究，以了解它们如何在现有的基于培养的诊断算法中发挥作用。

**比较研究**
Hong等人比较了16S测序和霰弹枪宏基因组测序在395份超声处理液样本中的表现，发现两者在培养阳性PJI患者中的阳性一致率相似（72.1% vs 73.1%）。[32] 在识别所有PJI病例的致病微生物方面，16S测序的敏感性为85.5%，霰弹枪宏基因组测序的敏感性为84.7%。[32] 作者认为16S测序更为经济高效，所需试剂更易获得，数据分析工作量更少，周转时间更快。[32] 与此相反，另一项荟萃分析比较了79项研究，发现霰弹枪宏基因组测序的敏感性为88.6%，而16S测序的敏感性为80.0%。[33] 在培养阴性病例中，霰弹枪宏基因组的敏感性为83%，而16S测序的敏感性仅为68%。[33] 各种方法的特异性在培养阳性和阴性病例中均较高，范围为93.2%至98%。[33] 排除质量较低的研究后，作者发现诊断准确性有所提高，这反映了不同NGS技术和研究方法之间的差异，强调了谨慎解读结果的必要性。

**结论**
16S测序和霰弹枪宏基因组测序在诊断中的作用互补，可在基于培养的诊断流程中发挥重要作用。Flurin等人在进行了一项回顾性研究，分析了154份滑液样本，其中36份来自PJI（假性关节炎）患者。研究发现，将滑液培养与16S测序进行比较时没有显著差异（敏感性分别为72%和69%），但结合使用培养和测序方法后，整体敏感性提高到了83%。[34] 在影响患者预后方面，Flurin等人指出，将16S测序数据与培养结果结合使用后，改变了11%的PJI病例的抗生素使用方案，并促成了手术干预的决定。[34] 类似的结果也在 shotgun 全基因组学研究中得到证实。[35] 在一项针对216例PJI病例的研究中，Fang等人采用了传统培养和 shotgun 全基因组测序相结合的方法，旨在确定全基因组学是否能改善感染控制情况（定义为至少两年内无需使用抗生素且炎症标志物恢复正常）。[35] 值得注意的是，在培养结果阴性的病例中，结合使用 shotgun 全基因组学后，感染控制率从63.3%提高到了94.4%，抗生素相关并发症率从36.4%降低到了8.8%。[35] 研究人员将这些益处归因于病原体识别和抗生素耐药基因（ARG）检测能力的提升，这直接支持了针对性抗生素的选择。[35] Flurin和Fang等人的研究结果表明，将下一代测序（NGS）的高灵敏度与传统的培养技术相结合，可能是诊断PJI和确定致病病原体的最有效策略，尤其是在诊断和病原体鉴定具有挑战性的临床情况下。

RNA测序（RNA-seq）是一种下一代测序技术，能够为临床医生提供关于活跃转录组的详细信息，即细胞在特定时间产生的所有RNA，反映哪些基因正在被表达。[12] 虽然全基因组学可以揭示细胞或细胞群体可能的功能，但RNA-seq能够帮助我们了解实际发生的情况。为此，RNA-seq利用高通量测序技术来识别哪些基因正在被表达及其相对表达量。[36,37] 在PJI研究中常用的基于RNA的测序方法包括批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和宏转录组学（metatranscriptomics）。具体来说，批量RNA测序和scRNA-seq主要用于翻译机制的研究，以阐明PJI的发病机制和宿主免疫反应，而宏转录组学则显示出在临床应用中的巨大潜力。[35] 批量RNA测序是一种能够洞察宿主转录组的NGS工具。该技术通过从生物样本中提取RNA分子并将其逆转录为互补DNA后进行测序来实现。[38] 这种测序方法可以生成转录本丰度的定量数据，并有助于识别差异表达的基因和分子通路。[38] 在PJI病例的应用中，批量RNA-seq显示出了改善感染控制的效果：感染控制率从63.3%提高到94.4%，抗生素相关并发症率从36.4%降低到8.8%。[35] 研究人员认为这归功于病原体识别和抗生素耐药基因（ARG）检测能力的提升，从而为精准选择抗生素提供了依据。[35] Flurin和Fang等人的研究结果表明，将NGS的高灵敏度与传统的培养技术相结合，可能是诊断PJI和确定致病病原体的最有效策略，尤其是在诊断和病原体鉴定具有挑战性的临床情况下。

RNA测序（RNA-seq）是一种下一代测序（NGS）技术，能够为临床医生提供关于活跃转录组的详细信息，即细胞在特定时间产生的所有RNA，反映哪些基因正在被表达。[12] 虽然全基因组学可以揭示细胞或细胞群体可能的功能，但RNA-seq能够帮助我们了解实际发生的情况。为此，RNA-seq利用高通量测序技术来识别哪些基因正在被表达及其相对表达量。[36,37] 在PJI研究中常用的基于RNA的测序方法包括批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和宏转录组学（metatranscriptomics）。具体来说，批量RNA测序和scRNA-seq主要用于翻译机制的研究，以阐明PJI的发病机制和宿主免疫反应，而宏转录组学则显示出在临床应用中的巨大潜力。[35] 批量RNA测序是一种能够洞察宿主转录组的NGS工具。该技术通过从生物样本中提取RNA分子并将其逆转录为互补DNA后进行测序来实现。[38] 这种测序方法可以生成转录本丰度的定量数据，并有助于识别差异表达的基因和分子通路。[38] 在PJI病例的应用中，批量RNA-seq显示出了改善感染控制的效果：感染控制率从63.3%提高到94.4%，抗生素相关并发症率从36.4%降低到8.8%。[35] 研究人员认为这归功于病原体识别和抗生素耐药基因（ARG）检测能力的提升，从而为精准选择抗生素提供了依据。[35] Flurin和Fang等人的研究结果表明，将NGS的高灵敏度与传统的培养技术相结合，可能是诊断PJI和确定致病病原体的最有效策略，尤其是在诊断和病原体鉴定具有挑战性的临床情况下。

RNA测序（RNA-seq）是一种下一代测序（NGS）技术，能够为临床医生提供关于活跃转录组的详细信息，即细胞在特定时间产生的所有RNA，反映哪些基因正在被表达。[12] 虽然全基因组学可以揭示细胞或细胞群体可能的功能，但RNA-seq能够帮助我们了解实际发生的情况。为此，RNA-seq利用高通量测序技术来识别哪些基因正在被表达及其相对表达量。[36,37] 在PJI研究中常用的基于RNA的测序方法包括批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和宏转录组学（metatranscriptomics）。具体来说，批量RNA测序和scRNA-seq主要用于翻译机制的研究，以阐明PJI的发病机制和宿主免疫反应，而宏转录组学则显示出在临床应用中的巨大潜力。[35] 批量RNA测序是一种能够洞察宿主转录组的NGS工具。该技术通过从生物样本中提取RNA分子并将其逆转录为互补DNA后进行测序来实现。[38] 这种测序方法可以生成转录本丰度的定量数据，并有助于识别差异表达的基因和分子通路。[38] 在PJI病例的应用中，批量RNA-seq显示出了改善感染控制的效果：感染控制率从63.3%提高到94.4%，抗生素相关并发症率从36.4%降低到8.8%。[35] 研究人员认为这归功于病原体识别和抗生素耐药基因（ARG）检测能力的提升，从而为精准选择抗生素提供了依据。[35] Flurin和Fang等人的研究结果表明，将NGS的高灵敏度与传统的培养技术相结合，可能是诊断PJI和确定致病病原体的最有效策略，尤其是在诊断和病原体鉴定具有挑战性的临床情况下。随着这些技术在临床和研究环境中越来越多地应用于人工关节感染（PJI）的诊断和治疗，将它们整合到诊断算法中有可能改善患者的治疗效果。对临床实践的影响包括：
- 在培养结果阴性或多微生物引起的PJI病例中，下一代测序技术，特别是16S rRNA测序和鸟枪法宏基因组学，可以帮助确定潜在的致病菌。
- 鉴于新型诊断工具的出现，应鼓励关节置换外科医生使用统一的术语，强调标准化的语言，以促进骨科医生、传染病专家和微生物学家之间的协作。

**作者贡献说明：**
- **Nathanael D. Heckmann**：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、方法学、正式分析、概念构建。
- **Sahil S. Telang**：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学、研究、正式分析、概念构建。
- **Karan Goswami**：撰写——审稿与编辑、监督、正式分析、概念构建。
- **Michael A. Mont**：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、正式分析、概念构建。

**作者名单：**
- **Nathanael D. Heckmann** 医学博士：概念构建、正式分析、方法学、监督、撰写——初稿、撰写——审稿与编辑
- **Sahil S. Telang** 文学学士：正式分析、研究、方法学、撰写——初稿、撰写——审稿与编辑
- **Karan Goswami** 医学博士（哲学博士）：概念构建、正式分析、监督、撰写——审稿与编辑
- **Michael A. Mont** 医学博士：概念构建、正式分析、监督、撰写——初稿、撰写——审稿与编辑
- **Jay R. Lieberman** 医学博士：概念构建

（说明：每位作者的具体贡献已在文中明确标注。）