由分子结构调控的pH-温度双重响应性两亲性聚合物纳米颗粒的可编程收缩与聚集

《RSC Applied Interfaces》：Programmable shrinking and aggregation of pH–thermo dual-responsive amphiphilic polymeric nanoparticles governed by molecular architecture

　　刺激响应型聚合物纳米颗粒代表了强大的药物输送系统，能够对病理微环境做出响应。然而，大多数双响应平台被视为二元的开/关系统，目前仍缺乏一个将分子结构与刺激应用时纳米颗粒结构演变联系起来的预测框架。在这里，我们报告了一个两亲性嵌段共聚物的模块化库，该库结合了疏水性聚乳酸（PLA）的核心形成段、pH响应型聚甲基丙烯酸（PMAA）的稳定段以及基于聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯（PEGMA）的冠状层，使得纳米颗粒的行为能够在生理pH值和温度范围内进行编程。通过系统地改变嵌段的组成和长度，可以独立调节纳米颗粒的大小（78–244纳米）、表面电荷（-53至-4毫伏）、相变温度（30–44摄氏度）和临界胶束浓度（1.55–15.82毫克/升），同时保持狭窄的颗粒大小分布和优异的胶体稳定性。重要的是，PMAA段的存在从根本上改变了热响应机制。在没有PMAA的情况下，纳米颗粒在相变温度以上会发生聚集，导致颗粒大小显著增加；而含有PMAA的纳米颗粒则表现出可控且可逆的颗粒内冠状层塌陷，从而实现可预测的收缩而不丧失胶体完整性。为了解释这种行为，我们引入了一个结构生长数（GN），这是一个现象学描述符，用于捕捉冠状层塌陷、静电稳定和疏水聚集之间的平衡。GN与热响应引起的尺寸变化之间的单调相关性表明，纳米颗粒的命运可以通过结构进行编程，从而实现收缩和聚集状态之间的精确切换。这个模块化平台为双响应纳米载体建立了一种预测性设计策略，并为工程化适应性药物输送系统提供了基础，这些系统能够在复杂的生物环境中实现可控的大小调节和局部激活。

引言

刺激响应型聚合物纳米颗粒已成为适应性药物输送的有希望的平台，因为它们的结构组织可以动态响应环境参数（如pH值和温度）的局部变化。这些参数的梯度在病理组织中尤为重要，包括肿瘤和炎症区域，其中细胞外酸中毒和轻微的高温创造了与健康生理环境显著不同的条件。将这些微妙的物理化学变化转化为可预测的纳米尺度结构转变，提供了一种增强靶向效率、控制药物释放和提高治疗选择性的强大策略。从制药角度来看，这些物理化学特性在病理条件下特别相关，因为在这些条件下，局部微环境梯度可以作为内源性激活的线索。实体瘤就是一个主要的例子，因为它们通常与细胞外酸中毒、异常的血管通透性、淋巴引流受损以及由于代谢活动增强或外部施加的轻微高温而导致的局部温度升高有关。类似的考虑也适用于炎症组织，其中免疫细胞的浸润和代谢的改变可以产生比健康组织更酸性和更温暖的微环境。在这种情况下，pH值和温度响应型纳米颗粒可能为设计具有改进的空间控制稳定性的纳米载体提供了合理的依据。热响应型聚合物纳米颗粒也被探索用于在体积受限的组织（如眼睛）中的局部和持续输送，以及用于包括基因输送和成像在内的先进生物医学应用。在这个更广泛的制药框架内，能够编程纳米颗粒收缩或聚集的可能性特别有吸引力：收缩系统可能有利于组织渗透和细胞摄取，而易于聚集的系统可能支持局部保留和储库形成。

这些考虑突显了建立结构-响应性关系的重要性，这使得纳米载体的行为能够与特定的病理微环境相匹配。在这方面，含有PLA的甲基丙烯酸大分子，包括HEMA接枝的乳酸衍生物，之前已被报道为制备可降解聚合物结构的多功能构建块。它们与受控的自由基聚合策略的结合，提供了一种方便的方法来制备两亲性聚合物系统，在这些系统中，疏水性、可降解的域可以与功能性响应段集成。热响应型聚合物通常依赖于聚合物-聚合物和聚合物-水之间的温度依赖性平衡，导致在特征性的临界温度下发生可逆的相变。表现出较低临界溶液温度（LCST）的聚合物在该阈值以下是可溶的并且高度水合的，而在加热时会发生脱水和塌陷。聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）由于其LCST（即32摄氏度）接近生理温度，历来是最广泛研究的热响应型聚合物。然而，基于寡聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯（EGMAs）的替代系统可能提供几个关键优势。基于EGMA的聚合物显示出优异的生物相容性和生物惰性，减少蛋白质吸附，并且具有高度可逆的热转变和最小的滞后。它们的相分离温度（PST）可以通过调整聚合物主链和寡聚(乙二醇)侧链的长度以及共聚来精细调节。这种组成的多样性使得基于EGMA的聚合物成为工程化热响应型纳米结构的特别有吸引力的平台。在纳米颗粒系统中，热响应性不仅由响应段的固有属性驱动，还受到其结构环境的驱动。热响应链在核壳界面处的限制、它们的伸展程度和水合情况，以及底层核心的性质，都可以强烈影响转变温度和这种转变的结果。

实际上，热诱导的响应可以从微妙的颗粒内重组到以聚集为主的转变，这取决于组装内部吸引力和稳定相互作用之间的平衡。另一方面，pH响应型聚合物利用了一种互补的机制，基于酸性或碱性功能团的离子化。甲基丙烯酸（MAA）是用于此目的的最常用的单体之一，因为其在酸性pH下的羧基质子化导致静电排斥和水合的显著减少，促进链的关联和结构重排。在聚合物纳米颗粒中，pH响应转变的程度和锐度不仅受MAA的存在影响，还受其有效密度、空间分布以及与结构中其他块的相互作用的影响。MAA含量的变化已被证明直接影响表面电荷、胶体稳定性以及观察到的尺寸变化和聚集现象的pH阈值，这通常通过动态光散射（DLS）和ζ电位测量来捕获。在这种情况下，在单一纳米载体中结合pH和热响应性代表了一种进一步精细控制纳米颗粒稳定性和药物释放的吸引策略。双响应系统可以利用病理组织中多种物理化学梯度的共存，其中轻微的酸中毒通常与炎症或高代谢活动相关的局部温度变化同时发生。虽然已经报道了几个pH/热响应型核壳纳米颗粒的例子，但这些系统通常被视为二元的“开/关”平台，其中响应性得到了证明，但没有系统地进行调节。特别是，聚合物组成、嵌段结构和纳米颗粒核心特性之间的相互作用很少被探索作为调节热诱导尺寸转变或pH触发结构重排的幅度、方向和机制的设计参数。因此，对于双响应型纳米颗粒的全面结构-响应性关系仍然缺乏。在这项工作中，我们通过研究一个定义明确的双pH和热响应型嵌段共聚物库来应对这一挑战，这些共聚物被设计为自组装成具有可编程行为的纳米颗粒。更具体地说，我们将2-羟基乙基甲基丙烯酸（HEMA）与PLA链接枝在一起，然后与MAA在统计共聚物中结合，再通过聚(EGMA)段进行链延伸，形成两亲性大分子。这些被证明可以在水环境中自组装成核壳纳米颗粒，其中核心预期由PLA悬挂链形成，pH响应的MAA单元暴露在水中，而热响应的EGMA段位于冠状层。通过系统地改变聚合度和相对嵌段组成，我们建立了一个模块化平台，在该平台上可以精细且独立地调节pH和温度触发的响应（图1）。通过全面的物理化学表征，我们展示了如何控制聚合物结构的变化转化为不同的胶体稳定性、尺寸调节和在pH和温度上的聚集状态，提供了明确的结构-响应性关系，使得双响应型纳米载体的合理设计成为可能。

两亲性嵌段共聚物结构结合了疏水性的PLA核心形成段、在统计共聚物中的pH响应型MAA单元以及基于PEGMA的冠状层，与缺乏可电离PMAA单元的类似PLA-PEGMA系统进行了比较。在水介质中分散后，两类聚合物都会自发自组装成核壳纳米颗粒，其中相对嵌段组成控制着冠状层的水合、链构象和界面稳定性。在LCST以上，含有PMAA的纳米颗粒通过残余的静电和水合介导的排斥相互作用保持胶体稳定性，导致可控的颗粒内冠状层重组和尺寸收缩。相比之下，缺乏PMAA嵌段的纳米颗粒由于缺乏稳定相互作用而发生聚集驱动的转变，导致形成超胶体组装体。这种结构比较突出了聚合物组成在驱动热响应纳米颗粒行为的机制和幅度方面的核心作用。

实验部分

材料

d,l-乳酸（Sigma Aldrich）；八氧化二锡（Sn(Oct)2，Sigma Aldrich）；甲苯（Sigma Aldrich）；甲基丙烯酸（MAA，Sigma Aldrich）；2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)（AIBN，Sigma Aldrich）；丙酮（Sigma Aldrich）；乙醚（Sigma Aldrich）；二氯甲烷（DCM，Sigma Aldrich）；己烷（Sigma Aldrich）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma Aldrich）；羟基乙基甲基丙烯酸酯（HEMA，Sigma Aldrich）；4-氰基-4-[(十二烷基硫酰基硫羰基)硫烷]戊酸（CTA）；Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（Sigma Aldrich）；乙腈（ACN；Sigma Aldrich）；四氢呋喃（THF；Sigma Aldrich）；乙醇（Sigma Aldrich）；二(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯（POEGMA2）；聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯（POEGMA8）；磷酸（H3PO4，Sigma Aldrich）；盐酸（HCl，Sigma Aldrich）；硫酸（H2SO4，Sigma Aldrich）；氯化钠（NaCl，Sigma Aldrich）；三聚磷酸盐（TSP）均为分析级纯度，除非另有说明，否则按接收状态使用。

HEMA接枝-LA12的合成

d,l-乳酸的开环聚合（ROP）使用2-羟基乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）作为羟基终止剂和八氧化二锡（Sn(Oct)2）作为催化剂，在无水甲苯中作为溶剂进行。聚乳酸（PLA）嵌段的预期聚合度为12个乳酸单元，由初始单体与引发剂的摩尔比定义。简而言之，首先将Sn(Oct)2（0.014克，0.035毫摩尔）溶解在60毫升甲苯中，并在连续磁力搅拌下进行。完全溶解后，依次向反应混合物中加入d,l-乳酸（6.00克，41.63毫摩尔）和HEMA（0.892克，6.94毫摩尔），对应的乳酸与引发剂的摩尔比为6:1。溶液用氮气冲洗15分钟以确保惰性气氛并最小化水分和氧气污染。然后将反应混合物加热到130摄氏度，并在恒定搅拌下维持4小时。聚合完成后，在减压下去除溶剂和残留的挥发性物质，然后在高真空下干燥直至达到恒定重量。在反应开始时（0小时）和聚合结束时（4小时）收集样品，进行结构和分子量表征。d,l-乳酸转化为PLA的转化率和所得HEMA接枝-LA12的分子量演变分别通过质子核磁共振（1H NMR）光谱和凝胶渗透色谱（GPC）进行评估，具体方法在以下部分详细描述。

P((HEMA-graft-LA12)-co-MAA的合成

MAA和HEMA接枝-LA12的统计共聚物是通过在密封的Pyrex小瓶（10毫升）中进行的可逆加成-断裂链转移（RAFT）共聚反应合成的，这些小瓶放置在一个恒温加热块中。MAA和HEMA接枝-LA12以不同的比例溶解在5毫升ACN中，并在磁力搅拌下进行。具体来说，使用CTA（0.028克，0.069毫摩尔）和AIBN（0.004克，0.023毫摩尔），以固定的摩尔比1:3（AIBN/CTA）进行反应。通过同时改变PLA和MAA相对于CTA的量来调节P((HEMA-graft-LA12)-co-MAA嵌段的组成。研究了两种目标组成，分别对应于P((HEMA-graft-LA12)12.5-co-MAA12.5)和P((HEMA-graft-LA12)25-co-MAA25，其中下标表示每种组分相对于CTA的摩尔数，因此表示预期的聚合度。此外，还合成了一个纯疏水的参考嵌段，由不含MAA的P((HEMA-graft-LA12)25组成。这种组成调节允许系统地评估疏水部分对随后自组装和热响应行为的影响，同时在所有配方中保持相同的自由基和RAFT条件。一旦获得均匀溶液，用氮气冲洗反应混合物30分钟以去除溶解的氧气并建立惰性气氛。将小瓶避光并加热到70摄氏度，然后在恒定搅拌下进行24小时的聚合。通过1H NMR光谱（图S2）和GPC分别评估HEMA接枝-LA12和MAA的转化率以及所得统计共聚物的分子量演变。P((HEMA接枝-LA12)-共-MAA)-b-P(EG2MA共-EG8MA)的合成

最终的双亲性嵌段共聚物是通过将P((HEMA接枝-LA12)-共-MAA进行链延伸，通过与热响应性单体EG2MA和EG8MA的第二次RAFT共聚反应获得的。通过系统地改变第二嵌段中EG2MA和EG8MA的相对投料比，设计出了12种不同的配方，同时保持每个样品子集中第一段P((HEMA接枝-LA12)-共-MAA的组成不变，从而每次只改变一个结构自由度，确保不同共聚物结构之间的直接可比性。在典型的合成过程中，P((HEMA接枝-LA12)-共-MAA作为大分子CTA，与EG2MA和EG8MA一起被加入到密封的Pyrex小瓶（10 mL）中，并在磁力搅拌下溶解在5 mL的ACN中，直到获得均匀溶液。然后加入自由基引发剂AIBN（0.004 g，0.023 mmol），保持与第一次聚合步骤中使用的CTA相同的摩尔比1:3。反应混合物用氮气冲洗30分钟以去除溶解的氧气，避光处理，随后在恒温加热块中加热至70°C。聚合在连续搅拌下进行24小时。通过1H NMR光谱（图S3）和GPC（图S4）分别跟踪单体的转化率和所得共聚物的分子量变化。不同嵌段共聚物的投料组成总结在表1中。

表1：12种不同P((HEMA接枝-LA12)-共-MAA)-b-P(EG2MAn-co-EG8MAm配方的EG2MA和EG8MA含量

纳米粒子的制备

通过将双亲性嵌段共聚物从水介质中置换出来制备聚合物纳米粒子。简要来说，首先将50 mg的聚合物溶解在1 mL的ACN中，得到澄清均匀的溶液。然后将有机相逐滴加入到装有10 mL蒸馏水的25 mL玻璃小瓶中，并以600 rpm的速度进行磁力搅拌，使用200 μL的校准微量移液器确保添加速率可控。与水接触后，由于聚合物的自组装和溶剂交换，会自发形成纳米粒子。所得的胶体悬浮液在搅拌下保持至少30分钟，以完成纳米粒子的完全平衡和稳定。纳米粒子形成后，将其转移到分子量截断为3.5 kDa的透析膜中，并用蒸馏水透析3小时以去除残留的ACN，然后进行DLS表征。使用EFTEM Leo 912AB显微镜（Carl Zeiss，Jena，德国）在80 kV下进一步研究制备的纳米粒子的大小和形态。样品是通过将5 μL的纳米粒子分散液滴在Formvar/碳涂层的铜网格上来制备的。样品在成像前放置过夜干燥。对于代表性的配方，分析了三种条件：室温下干燥的纳米粒子、在45°C下干燥的纳米粒子以及在沉积和干燥前酸化至pH 3的纳米粒子。使用CCD相机（Esi Vision Proscan相机）获取数字图像。

聚合物和纳米粒子的物理化学表征

通过配备折射率检测器（RI-2031 Plus，Jasco）的Jasco LC-2000 Plus色谱系统，使用GPC确定了合成聚合物及其中间前体的分子量和分散度。分离使用三个Agilent PLgel柱（5 × 10^-6 m粒径，300 × 7.5 mm，分子量分离范围5 × 10^2–1.7 × 10^6 g mol^-1）。样品通过将聚合物溶解在四氢呋喃（THF）中制备，浓度为4 mg mL^-1，然后通过0.2 μm的PTFE膜过滤后进行注射。使用分子量从580到325,000 g mol^-1的聚苯乙烯标准品进行校准，并使用纯THF进行空白运行。使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments）在173°的散射角下，通过DLS研究了纳米粒子的流体动力学尺寸、表面电荷和刺激依赖的胶体行为。对于每次测量，将100 μL的纳米粒子悬浮液稀释在2.9 mL的蒸馏水或pH范围从1到14的缓冲溶液中，以单位增量进行。将1 mL的所得分散液转移到玻璃比色皿中进行分析。折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010。通过在所需温度下平衡样品来进行温度依赖的测量，然后进行数据采集。使用Jasco V-630 UV-vis分光光度计进行光透射实验，以探究纳米粒子分散液的pH响应性。对于pH依赖的研究，使用上述相同的稀释协议将纳米粒子悬浮液稀释在不同的pH缓冲溶液中，并将1 mL的每个样品转移到高性能石英比色皿中。温度触发的测量则在蒸馏水中进行。通过监测外部刺激下的光透射变化来捕捉胶体稳定性和聚集状态的变化。使用Jasco FP-8500荧光分光光度计和芘作为极性敏感探针，通过荧光光谱确定了聚合物系统的临界胶束浓度（CMC）。

在适用的情况下，实验数据使用ANOVA方差分析进行统计分析。统计显著性设定为p值<0.05。结果以平均值±标准差的形式呈现。

聚合物库的设计和分子表征

本工作中采用的合成策略依赖于三步分层方法，以生成具有独立可调的疏水性、pH响应性和热响应性片段的双亲性嵌段共聚物（图2）。

通过ROP和RAFT聚合合成双亲性嵌段共聚物的顺序聚合策略。第一步，使用HEMA作为引发剂，通过ROP聚合d,l-乳酸，得到适合后续RAFT聚合的乙烯基终止的PLA大分子单体。这种中间体提供了一个精确控制的疏水骨架，同时保留了可聚合的甲基丙烯酸酯官能团以进一步进行链增长。通过1H NMR光谱（图S1）确认了HEMA接枝-LA12前体的成功形成，显示了PLA的特征共振以及末端甲基丙烯酸酯基团的乙烯基质子，证实了ROP后末端官能团的保留。GPC（图S4）和1H NMR分析表明形成了低分子量的PLA寡聚物，具有狭窄的分子量分布，与目标短疏水链一致（表2）。用于基于1H NMR的转化分析和分子量估计的详细方程式，包括每个合成步骤中使用的积分共振的定义，在支持信息中有所报告。实验测得的数均分子量与从单体到引发剂的投料比计算出的理论值相符，对应于大约12个乳酸重复单元的平均PLA长度，从而证实了对ROP过程的有效控制。在第二步中，将HEMA接枝-LA12用于与MAA的第一次RAFT共聚，生成双亲性前体嵌段P((HEMA接枝-LA12)-共-MAA。研究了两个目标的聚合度，即P((HEMA接枝-LA12)12.5-co-MAA12.5)和P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25，以及一个纯疏水的P(HEMA接枝-LA12)25参考样品，其中避免了MAA共聚单体。首先通过动力学分析评估了这种统计共聚物的受控生长。对于HEMA接枝-LA12和MAA，都实现了高单体转化率（图3a），初始和瞬时单体浓度之比的自然对数（ln(M0/M)随时间线性增长（图3b），表明自由基浓度恒定，终止反应的贡献有限，这与一个控制良好的RAFT过程相符。表2

通过GPC和1H NMR获得的HEMA接枝-LA12大分子单体、P(HEMA接枝-LA12)-共-MAA大分子CTAs和最终嵌段共聚物的平均分子量。还报告了通过1H NMR确定的单体转化率（χ）和实验聚合度（DP）。对于第一次RAFT共聚步骤，分别报告了HEMA接枝-LA12和MAA的转化率，并连续排列在行上。样品名称中的下标指的是目标的聚合度，而报告的DP值对应于实验估计的值。Mn、转化率和DP确定的详细方程式和计算程序在SI中提供。

样品
GPC
1H NMR
Mn (Da)
Mw (Da)
? (—)
χ (%)
DP LA12
DP MAA
DP EG2MA
DP EG8MA

—
HEMA接枝-LA12
890
893
1553
1.74
913
—
12.31
—
—
—
—

P((HEMA接枝-LA12)12.5-co-MAA12.5)
12 576
12 430
16 284
1.31
11 793
91.3
11.41
11.64
—
—

P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25
25 152
27 463
35 152
1.28
23 144
90.9
22.72
23.57
—
—

P(HEMA接枝-LA12)25
23 000
25 289
35 657
1.41
21 480
92.5
23.12
—
—

A
P((HEMA接枝-LA12)12.5-co-MAA12.5)-b-P(EG2MA17-co-EG8MA33
31 786
33 940
36 774
1.08
33 222
90.6
11.41
11.64
18.49
35.90

B
P((HEMA接枝-LA12)12.5-co-MAA12.5)-b-P(EG2MA25-co-EG8MA25
29 672
31 415
36 724
1.17
29 488
91.6
11.41
11.64
25.71
25.71

C
P((HEMA接枝-LA12)12.5-co-MAA12.5)-b-P(EG2MA46-co-EG8MA4)
24 121
23 814
26 475
1.11
24 123
91.8
11.41
11.64
53.22
4.63

D
P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25)-b-P(EG2MA17-co-EG8MA33)
46 339
46 726
53 776
1.15
50 459
93.6
22.72
23.57
23.57
45.76

E
P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25)-b-P(EG2MA25-co-EG8MA25)
44 224
36 770
45 041
1.22
50 246
91.8
22.72
23.57
28.31

F
P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25)-b-P(EG2MA46-co-EG8MA4)
38 674
42 730
50 489
1.18
48 395
91.6
22.72
23.57
68.21
5.93

G
P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25)-b-P(EG2MA34-co-EG8MA66)
64 473
60 450
69 862
1.16
68 723
91.8
22.72
23.57
39.33

H
P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25)-b-P(EG2MA50-co-EG8MA50)
60 244
57 803
63 090
1.09
62 467
92.1
22.72
23.57
57.14

I
P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25)-b-P(EG2MA92-co-EG8MA8)
49 142
29 371
36 317
1.24
56 434
91.5
22.72
23.57
132.6

J
P(HEMA接枝-LA12)25-b-P(EG2MA17-co-EG8MA33)
42 035
46 331
55 719
1.20
51 544
91.8
23.12
—
25.94

K
P(HEMA接枝-LA12)25-b-P(EG2MA25-co-EG8MA25)
39 920
50 494
53 423
1.06
48 854
93.1
23.12
—
39.78

L
P(HEMA接枝-LA12)25-b-P(EG2MA46-co-EG8MA4)
34 370
37 742
42 161
1.12
39 192
94.8
23.12
—
76.44

图3

(a和b) P((HEMA接枝-LA12)12.5-co-MAA12.5)（红色）、P((HEMA接枝-LA12)25-co-MAA25）（绿色）和P(HEMA接枝-LA12)25（蓝色）的RAFT聚合过程中，初始（M0）和瞬时（M）单体浓度之比随时间的单体转化率和相应的半对数图。圆形符号代表HEMA接枝-LA12对应的性质，而十字符号代表MAA。(c和d) 在链延伸步骤中，热响应性EGnMA嵌段的RAFT聚合过程中，初始（M0）和瞬时（M）单体浓度之比随时间的单体转化率和半对数图。颜色对应于不同的配方：样品A（红色）、B（绿色）、C（蓝色）、D（黄色）、E（灰色）、F（棕色）、G（橙色）、H（紫色）、I（品红色）、J（青色）、K（黑色）和L（粉色）。样品名称指的是表2中报告的架构。一致地，1H NMR（图S2）和GPC分析（图S3）显示随着目标链长的增加，数均分子量逐渐增加，同时所有配方的分散度值（? ≤ 1.41）保持相对较低。实验分子量遵循从单体转化率和投料组成得出的预期理论趋势。在最后一步中，P((HEMA接枝-LA12)-共-MAA大分子CTAs通过第二次RAFT聚合与热响应性EG2MA和EG8MA进行链延伸，得到了12种不同嵌段共聚物的库，这些共聚物的壳层和冠状组成系统变化（样品A-L）。1H NMR光谱能够通过特征共振的相对积分定量评估嵌段组成和分子量。这一趋势与第二步RAFT反应的动力学分析完全一致，其中可以实现高单体转化率（图3c），并且随着时间的推移，ln(M0/M)呈线性关系（图3d），证实了在链延长过程中控制了自由基的传播。所有最终的共聚物都表现出狭窄的分子量分布（?范围从1.06到1.24），表明即使在存在体积较大且高度溶剂化的聚乙二醇侧链的情况下，RAFT过程的活性特性也得到了保持。

在整个聚合物库中，实验测得的分子量与根据目标聚合度和单体进料比计算出的理论值相当吻合（表2）。对于某些配方，特别是在EG8MA含量较高的情况下观察到的轻微偏差，可以归因于单体反应性的差异以及使用聚苯乙烯标准品进行GPC校准时的固有局限性，尤其是对于两亲性和高度溶剂化的聚合物。尽管如此，分子参数的整体一致性表明，这种多步骤合成路线能够可靠且模块化地控制嵌段长度、组成和分散性，为后续研究自组装和刺激响应行为提供了坚实的分子基础。

从聚合物库中获得的纳米粒子的物理化学性质在表3中进行了总结，包括流体动力学直径、多分散指数（PDI）、表面电荷、相分离温度（PST）、加热时的直径变化、临界胶束浓度和相分离pH值。这些参数提供了每种配方的结构和胶体特性的全面概述，并为将聚合物结构与纳米粒子稳定性和刺激响应行为联系起来奠定了基础。

纳米粒子的自组装和胶体稳定性贯穿整个聚合物库。

表3总结了从12种两亲性嵌段共聚物自组装得到的纳米粒子的物理化学性质，包括流体动力学直径、多分散指数（PDI）、表面电荷、相分离温度（PST）、加热时的直径变化、临界胶束浓度（CMC）以及pH响应性。当流体动力学直径相对于初始低温值的变化达到或超过20%时，PST值才被操作性地确定。ΔD是高温平台区域测量的流体动力学直径与低温平台区域测量的流体动力学直径之间的差值。

样品
D (nm)
PDI (—)
Z-pot (mV)
PST (°C)
ΔD (nm)
CMC
pH-Resp. A
214
0.132
?23
—
?17.28
2.86
6

B
119
0.078
?25
—
?14.71
3.14
6

C
81.6
0.149
?21
—
?13.48
2.41
6

D
210
0.091
?53
42
?24.76
8.46
4

E
131
0.156
?47
34
?36.42
3.92
4

F
78
0.104
?49
32
?27.38
4.33
4

G
244
0.073
?33
38
?59.01
15.82
5

H
182
0.139
?29
32
?55.66
11.70
5

I
93
0.086
?30
30
?50.26
10.49
5

J
102
0.121
?5
38
276.30
1.70
—

K
82
0.157
?7
36
563.40
1.80
—

L
80
0.095
?4
34
766.10
1.55

纳米粒子的自组装受到共聚物两亲性分子结构的控制。PLA接枝的甲基丙烯酸酯单元、可电离的MAA单元以及基于EGMA的热响应性嵌段之间的共价连接，使得在溶剂置换时形成了固定的空间组织，促进了核壳纳米粒子的形成。在水中，疏水的PLA侧链最小化了与水相的接触，并通过疏水作用驱动了核的形成。相反，MAA单元和EGMA侧链优先暴露在水中，提供了静电、水合介导和空间稳定作用。在中性pH下，去质子化的MAA基团在粒子之间产生静电排斥，而水合的EGMA链有助于形成胶束。加热时，EGMA嵌段的脱水促进了胶束的塌陷，而残余的MAA电离则抵消了粒子间的聚集。在酸性条件下，MAA的质子化减少了静电稳定作用，并增强了链间的关联，导致聚集。所有合成的嵌段共聚物在水介质中溶剂置换后都会自发自组装成胶体稳定的纳米粒子。表3总结了整个聚合物库（样品A-L）在室温下测得的初始流体动力学直径和PDI。所有配方的纳米粒子生产都具有高度的可重复性，产生了直径大约在80到240纳米之间、PDI值通常低于0.16的明确胶体分散体，表明尺寸分布狭窄且胶体均匀性良好。在整个聚合物库中观察到纳米粒子大小明显依赖于其分子结构。这十二种配方被有意地分为三组，其中第一嵌段的组成保持不变，而热响应性嵌段的组成则按照EG2MA/EG8MA比例的相同增量趋势系统性地变化。这种实验设计使得能够在其他核心条件相同的情况下，直接比较胶束组成和长度对纳米粒子大小的影响。在每个子组内，增加EG2MA/EG8MA比例会导致流体动力学直径逐渐减小。对于含有较短两亲性前体P((HEMA-graft-LA12)12.5-co-MAA12.5)的共聚物（样品A-C），随着EG2MA比例的增加，粒子大小从214纳米（样品A）减小到82纳米（样品C）。这种行为反映了EG8MA单元（具有更长和更水合的侧链）逐渐被更紧凑的EG2MA单体取代，导致胶束的水合体积减少，壳层对流体动力学半径的贡献降低。对于P((HEMA-graft-LA12)25-co-MAA25)系列（样品D-F），观察到完全一致的变化趋势，随着EG2MA含量的增加，粒子大小从210纳米（样品D）减小到78纳米（样品F），这证实了热响应性嵌段的结构作用独立于核心的绝对长度主导了纳米粒子的大小。当比较具有相同EG2MA/EG8MA比例的配方时，随着嵌段绝对长度的增加，观察到纳米粒子大小的系统性增大（样品A-D-G、B-E-H和C-F-I）。在这些条件下，随着热响应性嵌段聚合度的增加，纳米粒子大小系统性地增大，表明嵌段的绝对长度直接调节了胶束的水合和空间扩展，从而增加了其对整体流体动力学半径的贡献。同时，当比较具有两亲性和纯疏水核心结构的纳米粒子时，第一嵌段的影响变得明显。对于缺乏可电离MAA单元的样品（样品J-L），观察到最小的粒子大小，这些样品表现出由纯疏水相互作用驱动的更紧凑的核心堆积。嵌段组成对自组装的影响还反映在CMC上。使用芘作为疏水荧光探针确定了共聚物的CMC。在低聚合物浓度下，第三发射带I3与第一发射带I1的强度比I3/I1在0.55–0.57范围内，表明芘主要分散在水相中，证实了没有有序的疏水区域。随着聚合物浓度的增加，I3/I1比率逐渐增加，反映了与胶束成核相关的疏水微环境的逐渐形成。

使用芘作为疏水荧光探针确定了代表性纳米粒子配方的CMC。第三和第一振动发射峰的比率（I3 = 384 nm/I1 = 373 nm）作为聚合物浓度的对数函数绘制。每个面板对应于聚合物库中的不同结构家族：(a) 样品A（红色圆圈），(b) 样品I（橙色菱形），(c) 样品E（灰色三角形），以及(d) 样品L（粉色正方形）。CMC被定义为I3/I1与浓度图的拐点，发现它在整个聚合物库中有一个广泛的范围（1.55–15.82 mg L?1），这与不同嵌段结构引入的疏水-亲水平衡的广泛调节一致。含有MAA嵌段的两亲性共聚物显示出系统性地更高的CMC值，与仅含PLA的类似物（样品J-L）相比，这与MAA单元的额外亲水贡献及其在水介质中的增强水合作用一致。相比之下，缺乏MAA的共聚物显示出最低的CMC值（1.55–1.80 mg L?1），突出了在没有可电离基团的情况下，疏水驱动力的增强。在两亲性系列中，EG8MA含量的增加通常与更高的CMC值相关，反映了热响应性胶束的水合体积和空间扩展的逐渐增大，这减少了胶束化的倾向。这一趋势与尺寸分析完全一致，其中富含EG8MA的配方由于水合壳层的显著贡献而产生了更膨胀的组装体。对样品E进行了TEM分析，作为代表性的配方，以提供刺激响应行为的补充形态学证据。

pH响应行为

纳米粒子库的pH响应行为被发现强烈依赖于有效表面电荷密度，这是通过测量ζ电位来量化的。正如预期的那样，不含MAA的样品J-L的ζ电位接近中性（?4至?7 mV），并且没有显示出任何可检测的相分离pH（PSpH），这证实了需要可电离基团来实现电驱动的结构转变。对于含有MAA单元的两亲性系统，负ζ电位的大小与观察到相分离的pH值之间存在明显的相关性，表现为纳米粒子大小的急剧增加。MAA含量较低的共聚物（样品A-C）显示出中等负ζ电位（大约?21至?25 mV），并在pH约6时表现出pH响应性。在这些系统中，可电离基团的减少密度导致在酸化时表面电荷的早期中和，促进了在温和酸性条件下的链间关联。相比之下，MAA含量较高的共聚物（样品D-F）显示出显著更负的ζ电位（?47至?53 mV），并且pH响应性明显向更酸性的值（pH约4）偏移，因为需要更强的质子化来有效屏蔽静电排斥。具有相同MAA含量但具有更长和更水合的热响应性胶束的样品（样品G-I）显示出中等ζ电位（?29至?33 mV），pH响应性集中在pH约5。这种行为表明，增加的胶束水合和空间屏蔽部分屏蔽了有效表面电荷，使得不稳定阈值向中间pH值偏移。总体而言，因此可以将库分为四种不同的静电状态：没有pH响应性的非电离系统、在温和酸性pH下响应的低电荷系统、需要更强酸化的高电荷系统，以及表现出中间行为的屏蔽电荷系统。这种分层强调了pH响应性不仅受聚合物链中MAA的绝对量控制，还受有效电荷暴露及其通过链结构和胶束水合的调节的影响。为了确保这些状态反映了内在的结构行为而不是配方特定的变异性，使用三个独立的可观测量一致地评估了pH依赖性趋势，即ζ电位、通过DLS测得的流体动力学尺寸和光学透射率。为了清晰起见，报告的pH曲线对应于四个平均趋势，每个趋势代表一个通过平均三个具有相同核心组成和MAA含量但在热响应性壳层结构上不同的结构家族。这种方法增强了所识别状态的稳健性，并强调了潜在的结构-性质关系。随着pH的降低，MAA含量的配方中负表面电荷的逐渐减少伴随着粒子大小的显著增加和浊度的增加（图5），表明了粒子间关联的开始和胶体稳定性的部分丧失。相反，在较高pH值下，强负ζ电位与稳定的流体动力学直径和高光学透射率相关，反映了分散良好的纳米粒子群体。这些独立技术的收敛证实了所识别的pH响应性窗口反映了真实的胶体和结构重排，而不是与单一测量方式相关的伪影。

pH依赖性的静电和胶体响应性

纳米粒子库的pH响应行为被发现强烈依赖于有效表面电荷密度，这是通过测量ζ电位来量化的。正如预期的那样，不含MAA的样品J-L的ζ电位接近中性（?4至?7 mV），并且没有显示出任何可检测的相分离pH（PSpH），这证实了需要可电离基团来实现电驱动的结构转变。对于含有MAA单元的两亲性系统，负ζ电位的大小与观察到相分离的pH值之间存在明显的相关性，表现为纳米粒子大小的急剧增加。MAA含量较低的共聚物（样品A-C）显示出中等负ζ电位（大约?21至?25 mV），并在pH约6时表现出pH响应性。在这些系统中，可电离基团的减少密度导致在酸化时表面电荷的早期中和，促进了在温和酸性条件下的链间关联。相比之下，MAA含量较高的共聚物（样品D-F）显示出显著更负的ζ电位（?47至?53 mV），并且pH响应性明显向更酸性的值（pH约4）偏移，因为需要更强的质子化来有效屏蔽静电排斥。具有相同MAA含量但具有更长和更水合的热响应性胶束的样品（样品G-I）显示出中等ζ电位（?29至?33 mV），pH响应性集中在pH约5。这种行为表明，增加的胶束水合和空间屏蔽部分屏蔽了有效表面电荷，使得不稳定阈值向中间pH值偏移。总体而言，因此可以将库分为四种不同的静电状态：没有pH响应性的非电离系统、在温和酸性pH下响应的低电荷系统、需要更强酸化的高电荷系统，以及表现出中间行为的屏蔽电荷系统。这种分层强调了pH响应性不仅受聚合物链中MAA的绝对量控制，还受有效电荷暴露及其通过链结构和胶束水合的调节的影响。为了确保这些状态反映了内在的结构行为而不是配方特定的变异性，使用三个独立的可观测量一致地评估了pH依赖性趋势，即ζ电位、通过DLS测得的流体动力学尺寸和光学透射率。为了清晰起见，报告的pH曲线对应于四个平均趋势，每个趋势代表一个通过平均三个具有相同核心组成和MAA含量但在热响应性壳层结构上不同的结构家族。这种方法增强了所识别状态的稳健性，并强调了潜在的结构-性质关系。随着pH的降低，MAA含量配方的负表面电荷的逐渐减少伴随着粒子大小的显著增加和浊度的增加（图5），表明了粒子间关联的开始和胶体稳定性的部分丧失。相反，在较高pH值下，强负ζ电位与稳定的流体动力学直径和高光学透射率相关，反映了分散良好的纳米粒子群体。这些独立技术的收敛证实了所识别的pH响应性窗口反映了真实的胶体和结构重排，而不是与单一测量方式相关的伪影。

根据结构家族对纳米粒子库的pH依赖性静电和胶体响应进行了分组。(a) ζ电位，(b) 流体动力学直径（DLS），以及(c) 在500 nm处的光学透射率（UV-vis）作为pH的函数。曲线对应于具有相同核心组成和MAA含量但不同热响应性壳层结构的四种配方的平均数据集。红色：样品A-C；绿色：样品D-F；蓝色：样品G-I；黄色：样品J-L。热响应行为

通过DLS监测流体动力学直径随温度的变化来评估纳米粒子库的热响应行为（图6）。转变的幅度被量化为ΔD，定义为在相分离温度以上的平台区域测量的流体动力学直径与在转变以下的平台区域测量的流体动力学直径之间的差异。见图6。

通过DLS测量的纳米粒子配方A–L的流体动力学直径随温度的变化。颜色编码：a) A（红色），B（绿色），C（蓝色）；b) D（黄色），E（灰色），F（棕色）；c) G（橙色），H（紫色），I（品红色）；d) J（青色），K（黑色）和L（粉色）。当含有P((HEMA-graft-LA12)-co-MAA)嵌段的纳米粒子（样品A–I）与不含MAA的纳米粒子（样品J–L）进行比较时，可以明显区分出两者。前者显示出平滑的S形尺寸-温度曲线，其特点是转变过程中直径的变化适中且可重复，并且在相分离温度以上有明确的平台。此外，还对样品J–L进行了温度依赖性的紫外-可见光（UV-vis）透射率测量，以补充DLS对热响应行为的分析（见图S10）。选择这些样品是因为它们不含MAA稳定单元，并且在加热时表现出以聚集为主的转变，这通过DLS测量的流体动力学直径的显著增加得到了证实。在这些条件下，粒子间的聚集预计会增加浊度并降低透射率，使得UV-vis分析特别有信息量。相比之下，含有MAA的配方主要经历粒子内的收缩，同时保持胶体稳定性，因此不会表现出强烈的浊度响应。样品J–L在相分离温度（PST）以上显示出明显的透射率下降，证实了加热时聚集引起的浊度的开始。在这些系统中，温度触发的响应主要由基于寡乙二醇（oligo(ethylene glycol)）的冠层的逐渐脱水和压缩所主导，而含有亲水性和可电离的MAA嵌段的存在提供了静电稳定。因此，这种转变对应于一个结构重组过程，在这个过程中，单个纳米粒子可以可逆地调整它们的流体动力学直径而不失去胶体身份。相比之下，不含MAA的样品表现出根本不同的响应。尽管它们的转变温度处于相似的热窗口内，但尺寸-温度曲线在跨越转变温度时显示出直径的急剧和突然增加，随后在较大的粒子尺寸处形成一个平台。相关的ΔD值比含有PLA–MAA的系统的ΔD值大一个数量级，表明转变主要是由粒子间聚集引起的，而不是由粒子内构象重排引起的。MAA单元的缺失消除了粒子界面的静电稳定和亲水屏蔽，因此热响应链的崩溃直接促进了广泛的粒子间关联和超胶体组装的形成。在PLA–MAA系列中，转变温度和尺寸响应的幅度都可以通过聚合物结构独立调节。相分离温度的范围大约为30–44°C，这一参数随着冠层中EG8MA含量的增加而增加，这一点之前已有报道。另一方面，ΔD随热响应冠层的长度和水合能力的系统变化而变化。具有更长和更水合壳层的配方显示出更大的绝对收缩，这与冠层脱水对整体流体动力学半径的更大贡献一致。这一趋势在扩展冠层结构（样品G–I）中尤为明显，它们在含有PLA–MAA的家族中显示出最大的ΔD值，而较短冠层系统的尺寸调节较为有限。不仅冠层形成嵌段的总长度，其组成也影响了观察到的ΔD。特别是，热响应部分中EG8MA的摩尔分数越大，纳米粒子的收缩越明显（ΔD越负）。这与之前提到的EG8MA在驱动胶体整体尺寸方面的主要贡献一致，这种重组导致冠层的更强收缩。另一方面，对于以粒子间相互作用为主的样品（样品J–L），随着EG8MA摩尔分数的增加，ΔD的正增长变得不那么明显。这表明这些更亲水的单元即使在相分离温度以上也保持了一定的水合，从而减轻了聚集。尽管ΔD存在这些显著差异，含有PLA–MAA的纳米粒子在转变前后都保持了明确的平台，表明在LCST的两侧都有稳定的胶体状态。这种转变温度与响应幅度之间的解耦使得可以根据温度精细控制纳米粒子的尺寸，同时保持胶体的完整性，这与仅含PLA的系统观察到的聚集驱动的切换相反。从设计角度来看，这种聚合物库因此能够访问两种不同的热响应机制：一种是由粒子间关联驱动的高幅度聚集机制，另一种是由可逆的冠层脱水控制的尺寸调节机制。通过合理的嵌段设计选择性地访问和定量调节这些机制的能力，为工程化具有定量可编程结构响应的热触发纳米结构提供了一个稳健的平台。

为了合理解释在聚合物库中观察到的不同热响应机制，引入了一个生长数（GN）作为现象学的结构描述符，将聚合物结构与LCST期间尺寸变化的幅度和性质联系起来。GN的定义如下：

DPEGMA对应于基于寡乙二醇（oligo(ethylene glycol)）的嵌段的聚合度，通过总结EG2MA和EG8MA的重复单元数量得到；DPMAA代表可电离的甲基丙烯酸单元；DPTOT是共聚物的总聚合度。每个术语反映了不同的物理贡献。热响应嵌段提供了转变的驱动力，因为在PST以上寡乙二醇侧链的脱水会导致冠层的熵增益崩溃。增加DPEGMA会放大这种崩溃的幅度以及相关的聚合物-水相互作用的变化。MAA嵌段通过在LCST以上提供残余电荷和持续的水合作用而起到稳定作用。只要DPMAA > 0，静电屏障就会阻止粒子间的直接接触，将热诱导的崩溃限制在冠层的粒子内重组。相比之下，疏水性的PLA单元在热响应链崩溃后通过增强粒子间的吸引力来促进聚集。在当前的配方中，这种贡献在归一化项DPTOT中得到了结构上的编码，其中包含了疏水性的PLA段。因此，增加DPPLA会增大总聚合度并降低GN的相对幅度，使系统趋向于以聚集为主的机制。额外的添加剂DPEG8MA考虑了较长寡乙二醇侧链的独特结构作用，这些侧链增强了冠层内的水合体积和空间屏蔽。这一术语引入了依赖于结构的调节，区分了富含EG8的冠层和以EG2为主的冠层，解释了在每个结构子组内观察到的系统差异。选择的GN的归一化乘法-加法公式在一个单一的结构描述符中捕捉了脱水驱动的冠层崩溃、静电稳定和疏水吸引之间的协同平衡（见图7）。

圆圈表示样品A、D、G和J；方块表示样品B、E、H和K；菱形表示样品C、F、I和L。颜色按照以下方式标识结构家族：橙色（A–C），绿色（D–F），红色（G–I）和蓝色（J–L）。高GN值对应于那些冠层崩溃被静电稳定有效抵消的系统，导致可控的负ΔD值，与可逆的粒子内收缩相关。相反，当GN接近零时，MAA的稳定作用消失，同样的脱水驱动的崩溃导致广泛的聚集和明显的流体动力学直径增加。重要的是，GN并不是一个严格的热力学参数，而是一个结构指标，它将冠层崩溃、疏水聚集和静电稳定的竞争作用浓缩为一个描述符。GN和ΔD之间观察到的单调相关性证实了纳米粒子的热响应行为是由这些结构元素的相对平衡所控制的，而不是由任何单一嵌段单独控制的。

这项工作建立了一个结构可编程的平台，用于制备双重pH和热响应的聚合物纳米粒子，在这种平台上，分子结构直接编码了热诱导结构转变的性质、幅度和方向。通过系统地调节疏水核心、可电离稳定单元和热响应冠层的相对贡献，我们证明了纳米粒子的行为可以在两种根本不同的机制下精确控制：以聚集为主的转变导致超胶体组装，以及可控的粒子内冠层崩溃，导致纳米粒子可逆收缩同时保持胶体身份。GN的引入提供了一个简单而强大的结构描述符，能够预测这种转变，揭示了纳米粒子的命运是由冠层脱水、静电稳定和疏水吸引之间的平衡所控制的，而不是由任何单一嵌段单独控制的。这一发现建立了直接的结构/响应性关系，并将双重响应纳米粒子从经验优化的系统转变为结构可编程的纳米材料。从转化的角度来看，能够设计出在生理相关的温度和pH变化下经历可控收缩或聚集的纳米粒子，为局部药物递送开辟了新的机会。收缩的纳米粒子可能增强组织渗透和细胞内摄取，而容易聚集的系统可能促进局部保留和储库形成。这个平台的模块化性质进一步使得可以独立调节响应性、尺寸和稳定性，为设计适应特定生物微环境的自适应纳米载体提供了多功能框架。

没有需要声明的利益冲突。

本文中呈现的所有数据都可以应要求由相应的作者提供。补充信息（SI）包括：RAFT聚合过程中合成共聚物的1H NMR光谱；合成共聚物的GPC色谱图；临界胶束浓度的确定。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6lf00061d。参考文献