可设计的近红外-II光触发生物相容性金纳米颗粒，用于高效光热治疗宫颈癌

《RSC Advances》：Designable NIR-II light triggered biocompatible Au NRs for highly efficient photothermal therapy of cervical cancer

　　金纳米棒（Au NRs）在宫颈癌的光热治疗（PTT）方面具有巨大潜力，但其临床应用受到第二近红外（900–1700 nm，NIR-II）光谱窗口吸收效率不佳、合成异质性以及细胞毒性表面活性剂残留物的限制。为了克服这些限制，我们将计算设计与实验合成相结合，开发了一种新型的NIR-II优化金纳米棒。有限差分时域模拟预测，这种金纳米棒的长度为88纳米，直径为13纳米，在1058纳米处具有强烈的局域表面等离子体共振（LSPR）峰，使其能够在NIR-II光谱区域深入组织。实验上，我们通过种子生长法合成了高度均匀的金纳米棒@PEG纳米颗粒（NPs），用生物相容性的聚乙二醇（SH-PEG-5000）替代了有毒的溴化十六烷基三甲基铵（CTAB），实现了1026纳米的吸收峰。金纳米棒@PEG表现出60.89%的优异光热转换效率、良好的肿瘤积聚能力以及极低的系统毒性。体内研究表明，在NIR-II光激发下，肿瘤抑制效果达到93.5%，并且能够承受多次治疗循环。在这项工作中，我们通过合理的光学工程和表面修饰，介绍了一种设计高性能、临床可行的光热剂的方法。

宫颈癌是全球影响女性最常见的癌症之一。传统的治疗方法，包括手术切除、放疗和化疗，常用于宫颈癌的管理。然而，每种方法都有其固有的局限性。手术切除往往难以完全切除肿瘤，并可能导致组织损伤和对未来生育能力的负面影响。放疗使用高能X射线或γ射线，可能对癌细胞和正常细胞造成不可逆的损伤。尽管化疗有效，但它缺乏对癌细胞的特异性，会导致健康组织的附带损伤。为了克服这些限制，人们投入了大量研究努力来开发创新的诊断和治疗策略。其中，基于纳米材料的光热治疗（PTT）被认为是一种有前景的治疗方法。其主要优点包括治疗时间短（大约几分钟）、逃避能力低、治疗效果显著以及副作用少（大多数光敏剂在低浓度下相对无害）。

特别是在第二近红外（900–1700 nm，NIR-II）光谱窗口内的PTT受到了广泛关注，因为它具有深层组织穿透能力（>5 mm）和低光毒性。目前，金纳米材料因其可调的局域表面等离子体共振（LSPR）特性而在临床试验中受到青睐。金纳米棒（Au NRs）由于其独特的各向异性结构，可以通过调整长宽比来精确调节其在可见光和近红外波长区域（650–1300 nm）的LSPR吸收峰。这种能力使它们成为PTT最重要的材料之一，也是光学性质最容易调节的贵金属纳米材料。Au NRs的治疗效果与其LSPR波长、颗粒均匀性和生物相容性密切相关。然而，目前的Au NRs常常面临尺寸和形状不均匀、吸收峰局限于较短NIR光谱区域（例如808 nm）以及使用有毒表面活性剂（如溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等问题。此外，非均匀的纳米颗粒（NPs）在体内容易非特异性聚集，增加了生物毒性的风险。最近的进展开发了基于Au NRs的纳米平台，提高了它们的生物相容性和治疗效果。这些改进包括使用有机材料和聚合物（如聚乙二醇（PEG）进行简单的化学修饰。例如，Chen等人开发了一种Au NRs@DOX药物输送系统，在808 nm近红外光下实现了光热效应，导致肿瘤细胞凋亡增加，从而在体外和体内都改善了治疗效果。此外，涂有PEG的金纳米棒囊泡显示出改进的光热转换效率（PCE）和光学响应性，表明其在未来成像应用中的潜力。

本研究使用尺寸依赖的折射率模型和有限差分时域（FDTD）模拟软件来分析金纳米棒的光学吸收特性。模拟结果表明，长度为88纳米、直径为13纳米的金纳米棒在1058纳米处表现出明显的纵向局域表面等离子体共振（L-LSPR）吸收峰。基于这些发现，我们使用种子生长法制备了一种具有NIR-II吸收特性（1026 nm）的高均匀性金纳米棒系统。使用SH-PEG修饰替代了传统的CTAB表面活性剂，从而消除了表面毒性残留。本研究探讨了在NIR-II光照射下，涂有PEG的金纳米棒（Au NRs@PEG）作为光热剂的潜力。结果表明，金纳米棒@PEG纳米颗粒（NPs）能有效抑制宫颈肿瘤生长。PCE和毒性测试显示，Au NRs@PEG在肝脏和脾脏中积聚，集中在肿瘤细胞周围。体内研究证实了Au NRs的光热稳定性，支持单次注射后的多次治疗周期。这项工作介绍了一种通过合理的光学工程和表面修饰来设计高性能、临床可行的光热剂的多功能方法。

材料

所有化学品在收到后未经额外纯化直接使用，所有实验程序中均使用了去离子水。中国上海的Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.提供了盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）、抗坏血酸和甘氨酸；中国上海的Sigma Aldrich提供了硼氢化钠（NaBH4）、溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）、三氯化金（HAuCl4）、硝酸银（AgNO3）、吲哚菁绿（ICG）和油酸钠（NaOL）。中国上海的Gibco提供了Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、青霉素-链霉素、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和含有EDTA的0.25%胰蛋白酶。Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.提供了Bis-benzamide H33342（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）和二甲基亚砜。Beyotime（中国上海）提供了Calreticulin（CRT）兔单克隆抗体、高迁移率组蛋白B1（HMGB1）兔单克隆抗体和带有JC-1的线粒体膜电位测定试剂盒。此外，中国上海的Weierbo Biotechnology Co., Ltd.提供的4%甲醛、苏木精-伊红、EDTA抗凝管和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）也被用于实验。

金纳米棒（Au NRs）和金纳米棒@PEG通过紫外-可见光谱（UV-vis spectroscopy）、ζ电位测量（zeta-potential measurements）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR spectroscopy）以及在200 kV加速电压下运行的透射电子显微镜（TEM，JEOL JEM1230，日本）进行了表征。金纳米棒和金纳米棒@PEG的细胞内化行为使用尼康ECLIPSE Ti共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，日本）进行了研究，温度监测使用了Heat Image Technology Co., Ltd.（中国上海）的热成像设备。细胞活力的评估使用了微孔板读取器（Thermo Fisher，美国）。流式细胞术实验使用了BD FACS Canto流式细胞仪（BD Biosciences，美国），常规血液检查和肝肾功能测试在Mindray BS-240 VET上进行。光学成像研究使用了PerkinElmer IVIS Spectrum小型动物成像系统进行体外和体内NIR-I荧光成像。

金纳米棒是通过二元表面活性剂方法制备的，这些纳米材料的合成包括以下两个关键步骤：

种子制备

将0.01 M的HAuCl4溶液（0.125 mL）加入到4.75 mL的CTAB（0.1 M）水溶液中，置于塑料管中。为了混合溶液，轻轻倒置混合液，然后一次性加入0.3 mL的冰镇新鲜制备的NaBH4（0.01 M）。溶液快速倒置2分钟后，静置2小时不搅拌。

生长过程

在含有10 mL CTAB（10 mM）水溶液的塑料管中，依次加入0.5 mL HAuCl4（10 mM）和80 μL AgNO3（10 mM）。轻轻倒置混合成分，然后加入80 μL新配制的100 mM L-抗坏血酸溶液并充分混合。生长溶液的各份加入不同体积的CTAB稳定的种子溶液，每个反应混合物轻轻搅拌10秒后，静置过夜不搅拌。

金纳米棒@PEG的制备

将制备好的金纳米棒悬浮液离心，收集的纳米棒重新分散到10 mL水介质中。随后加入0.5 mL浓度为0.05 g/10 mL的硫醇-聚（乙二醇）-5000（CH3O-PEG-SH），然后让混合物静置过夜不搅拌。

细胞培养和细胞摄取

HeLa人宫颈腺癌细胞从美国类型培养集（ATCC，Manassas，VA，美国）获取，并在包含45 mL高葡萄糖DMEM（90%）、4 mL 8%胎牛血清和0.5 mL双抗生素溶液的完整生长培养基中培养，按照典型的细胞培养协议进行。HeLa细胞在37 °C、二氧化碳浓度为5%的培养箱中培养。使用CLSM分析暴露于不同浓度（40, 80, 和100 μg/mL）处理下的HeLa细胞，每种浓度体积为600 μL。细胞以每孔1 × 10^5个细胞的密度接种到35 mm玻璃底皿中，并培养过夜。

细胞毒性分析

使用CCK-8试剂评估金纳米棒@PEG的细胞毒性。96孔培养板每孔接种3 × 10^3个HeLa细胞，培养过夜。之后，细胞暴露于不同剂量的金纳米棒@PEG（10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 和120 μg/mL）中，同时设置对照组和空白组，培养4小时。培养结束后，孔暴露于1064 nm激光（400 mW cm^-2）下10分钟。激光处理完成后，每个孔加入10 μL CCK-8试剂，然后在黑暗中培养2小时。细胞活力使用以下公式（1）计算：

(1)

用Au NRs@PEG处理的细胞的光密度（OD）表示为ODsample，不含细胞的PBS介质的OD称为ODblank，含有细胞的介质的OD表示为ODnegative。450 nm处的OD测量使用微孔板读取器进行。

体外细胞凋亡测定

HeLa细胞接种到共聚焦培养皿中，培养24小时，然后额外用Au NRs@PEG处理6小时。培养期后，细胞暴露于1064 nm NIR照射下，功率为400 mW cm^-2，持续10分钟。暴露后，细胞在37 °C下培养20分钟，存在浓度为2 μM的Calcein-AM和浓度为5 μM的Propidium Iodide（PI）的混合物中。细胞用PBS洗涤，并使用CLSM成像。为了更详细地研究细胞死亡机制，我们使用了流式细胞术技术，利用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒。处理后，细胞在室温下与Annexin V-FITC和PI共培养10分钟。随后使用流式细胞术进行分析。

本研究旨在建立光热效率与悬浮液浓度以及激光功率强度之间的关系。为此，将0.5 mL不同浓度的Au NRs@PEG分散液（12.5, 25, 和50 μg/mL）暴露于1064 nm激光下，功率密度分别为100, 300, 和500 mW cm^-2。使用红外热成像系统监测从初始温度到达到最高和最稳定温度的温度变化。监测以30秒间隔进行10分钟，以确定最佳激光功率密度。随后通过将25 μg/mL的水分散液暴露于1064 nm激光下，功率为400 mW cm^-2，来评估Au NRs@PEG的光热转换效率（η）。在溶液达到热平衡后，激光被关闭，从而促使温度恢复到环境条件。在此过程中，热成像技术有助于记录温度变化动态。η值可以使用方程（2）来计算：

(2)

其中h表示热传递系数，S代表反应容器的表面积，I代表激光功率，Tmax是达到的峰值温度，Tsurr是周围温度，A1064代表样品在1064纳米处的吸光度。hS的值可以通过方程（3）来确定：

(3)

其中MD（溶剂质量）为0.5毫克，CD（溶剂热容量）为4.2焦耳每克每摄氏度。τs是特定于样品系统的常数，通过方程（4）计算得出：

细胞划痕实验

HeLa细胞被接种在六孔细胞培养板上并让其达到汇合状态。之后，通过将200微升的移液器尖端垂直压在细胞单层上，创建一条直线划痕。随后，每隔几小时对划痕区域进行成像。此外，仔细选择3-5个随机位置，并通过测量划痕边缘随时间的变化来评估细胞迁移的程度。最终数据使用ImageJ软件进行分析。线粒体膜电位的评估

按照既定的培养和处理方案，处理后细胞用PBS清洗一次，然后在37摄氏度下在黑暗中用1毫升JC-1染色工作溶液孵育20分钟。用PBS清洗三次后，使用CLSM评估线粒体膜电位。CRT暴露和HMGB1迁移的评估

HeLa细胞按照既定方案进行培养和处理。处理后，细胞用PBS清洗三次，然后加入CRT和HMGB1抗体溶液，在4摄氏度下孵育24小时。去除抗体并用PBS清洗细胞三次后，加入荧光标记的二次抗体，在室温下孵育2小时。去除二次抗体后，用PBS清洗细胞三次。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜捕获荧光图像。NIR-I荧光成像

将ICG负载的Au NRs@PEG（40微克每毫升）静脉注射到15-18克的6-8周大的雌性小鼠体内，以评估纳米颗粒的体内生物分布。在注射后5分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和48小时进行体内NIR荧光成像。之后，对小鼠实施安乐死，并采集主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）进行体外荧光成像，激发波长为745纳米，发射波长为840纳米。小鼠模型和体内抗肿瘤研究

通过将1 × 10^6个HeLa细胞（悬浮在100微升DMEM中）注射到腋下区域，建立了一个携带HeLa肿瘤的BALB/c雌性小鼠模型（6-8周大）。一旦肿瘤体积达到大约50立方毫米，小鼠被随机分配到四个组，每组五只：对照组（注射生理盐水）、激光组（1064纳米激光处理）、Au NRs@PEG组（Au NRs@PEG注射）和组合组（Au NRs@PEG注射和1064纳米激光处理）。Au NRs@PEG的剂量为5毫克每千克。相关组的小鼠在1064纳米下接受功率密度为400毫瓦每平方厘米的NIR照射，持续10分钟。通过红外成像监测温度变化。每两天测量肿瘤体积和体重。肿瘤体积的计算公式为：V = (L × W^2)/2，其中L是最大肿瘤长度，W是最短横向宽度。第14天，对小鼠实施安乐死，并采集肿瘤和重要器官进行组织学分析，使用苏木精和伊红（H&E）染色。结果和讨论

如图1所示，通过种子介导的生长方法合成了在NIR-II窗口具有强吸收的Au NRs。然后进行SH-PEG-5000的表面功能化处理，以提高生物相容性。使用1064纳米NIR-II激光照射实现了对宫颈癌细胞的有效光热消融，这种激光具有深层组织穿透能力。图1

Au NRs@PEG的制备及其在NIR-II激光辅助PTT中的应用。Au NRs的光吸收光谱设计

非球形纳米颗粒的光学性质可以通过数值方法进行模拟，包括有限元方法（FEM）、时域有限差分方法（FDTD）、离散偶极近似（DDA）和边界元素方法（BEM）。26-29 在这项研究中，使用FEM和尺寸依赖的折射率模型模拟了Au NRs的光吸收性质。纳米棒由两个直径为D的半球和一个高度为（L - D）的圆柱体组成，如图1a所示。这种结构配置已被证明与合成纳米棒的形态更加匹配，从而使其更适合实际加工和在各种应用中的制造。根据计算，做出以下假设：入射光沿x轴传播，电场沿z轴振荡，纳米棒的旋转轴位于xoz平面内，φ是旋转轴与z轴之间的角度（即方位角）。如图1b所示，指定一个最小厚度为1/2波长的球形区域作为颗粒外部的周围介质（SM）层。指定一个厚度相当于TM层波长1/4的球形区域作为外部区域的完美匹配层（PML）。PML构成了一个人工吸收层，用于在具有开放边界的问题中截断计算区域。波在PML中被完全吸收，以防止它们作为反射返回。图1

Au NRs的光学特性的理论分析。(a) Au NRs的几何形状和方向的示意图。(b) FEM模拟配置。(c) Au NRs在水中的吸收光谱随长度L的变化，直径D为13纳米，角度φ设为0°。(d) Au NRs在水溶液中的吸收光谱变化，直径D保持不变，长度L = 88纳米，角度φ = 0°。(e) Au NRs在水中的吸收光谱变化，取决于生物组织的折射率（nm），其中L = 88纳米，D = 13纳米，φ = 0°。(f) 基于Au NRs的方向，其在水中的吸收光谱变化，长度L = 88纳米，直径D = 13纳米。单个纳米颗粒的光吸收能力可以通过吸收效率Qabs来定量描述，其表达式为方程(5)：

(5)

在此背景下，Qh表示纳米颗粒每单位面积吸收的光功率，Vp表示颗粒体积，Reff表示颗粒的有效半径——相当于具有相同体积的球体的半径。入射光的强度定义为Ii = (nmE0^2)/(2Z0)，其中nm表示SM的折射率，E0表示入射电场的幅度（在模拟中固定为1），Z0表示真空阻抗。对于纳米颗粒，获取纳米材料本身的折射率对于确定其吸收效率（Qabs）至关重要。对于金属纳米颗粒，折射率取决于入射光的频率和纳米颗粒的尺寸。这种尺寸依赖性源于当纳米颗粒尺寸小于自由电子的平均自由路径时，自由电子与纳米颗粒表面的碰撞增强，导致表面散射显著。30 因此，金属纳米颗粒的尺寸依赖性折射率可以表示为：

(6)

考虑了入射光的角频率（ω）、块体金属的复折射率（nbulk）、等离子体频率（ωp）、费米速度（vf）、自由电子的平均自由路径（l∞）和无量纲参数A（在本文中接近1）。有效自由电子平均自由路径（Leff）也是模型的一个关键组成部分，通常取Leff = Reff。Au块体的折射率来自McPeak发布的数据，31 ωp = 9.03 eV，vf = 1.4 × 1706 m s^-1，l∞ = 42 nm的值来自已发表的论文。32,33 水的折射率来自Kedenburg发布的数据。34 为了定量分析尺寸对吸收光谱的影响，计算了长度为80纳米、88纳米、96纳米和104纳米的Au NRs的体积吸收效率作为波长的函数，如图1c所示。随着长度从80纳米增加到104纳米，Au NRs的共振波长从994纳米变为1182纳米，其吸收能力增加。如图1d所示，计算了直径为10纳米、13纳米和16纳米的Au NRs的吸收效率作为波长的函数。随着直径从10纳米增加到16纳米，Au NRs的共振波长从1238纳米变为942纳米。这种变化归因于纳米颗粒的光学性质和电子结构的变化。首先，纳米颗粒的LSPR频率随着尺寸的增加而变化，导致光吸收也随之变化。其次，纳米颗粒的电子态密度随尺寸变化，这反过来影响它们吸收光子的能力。35 模拟结果表明，长度为88纳米、直径为13纳米的Au NRs的共振波长为1058纳米，接近1064纳米的激光波长。如图1e所示，计算了不同生物组织（折射率为1.3、1.4、1.5和1.6）中Au NRs的吸收效率作为波长的函数。随着生物组织的折射率从1.3增加到1.6，Au NRs的共振波长从1040纳米红移至1250纳米，吸收效率从36.39降低到35.07。这种现象的根本原因是SM的折射率增加，导致光在介质中的传播速度减慢，从而减少了光的波长。这导致激发纳米颗粒LSPR的入射光波长增加。如图1f所示，计算了四种不同方向（φ = 0°、30°、60°和90°）的Au NRs的吸收效率。在吸收光谱中识别出两个独立的共振峰，分别对应于沿颗粒轴向（纵向LSPR，L-LSPR）和垂直于轴向（横向LSPR，T-LSPR）的自由电子振荡。L-LSPR模式下的电荷密度相对较低，而在T-LSPR模式下电荷密度较高。作用在振荡电荷上的恢复力与积累的电荷成正比，导致L-LSPR模式下的电子振荡频率较慢（因此共振波长较长），而在T-LSPR模式下频率较快（导致共振波长较短）。36 在0°的方位角下，仅观察到L-LSPR模式，其在1058纳米的共振波长下的吸收效率为36.78。在90°时，仅检测到T-LSPR模式，但其贡献可以忽略不计。在30°和60°的方位角下，观察到L-LSPR和T-LSPR模式，共振峰几乎保持不变。这种现象源于纳米颗粒尺寸和电荷密度的恒定性。无论粒子尺寸如何变化，T-LSPR的波长都限制在一个狭窄的可见光谱范围内，而L-LSPR的波长可以在从可见光到近红外（NIR）区域的宽广光谱范围内进行调整。此外，L-LSPR的强度显著高于T-LSPR。Au NRs@PEG的合成与表征

模拟结果表明，长度约为88纳米、直径为13纳米的金纳米棒（Au NRs）的共振波长为1058纳米，接近1064纳米的激光波长。为了研究这些Au NRs在宫颈癌治疗中的潜力，采用了一种传统的种子介导方法来合成平均长度为87 ± 6纳米、宽度为13 ± 2纳米、长宽比为6.76的Au NRs（见图2a和e）。吸收光谱显示，Au NRs的最大吸收峰分别位于513纳米和1028纳米（图2g中的黑线）。

对裸露的Au NRs和Au NRs@PEG进行了表征。展示了（a）裸露Au NRs和（b）Au NRs@PEG的透射电子显微镜（TEM）图像。（c）和（d）分别对应于（a）和（b）的晶格条纹。（e）裸露Au NRs和（f）Au NRs@PEG的直方图显示了它们的长度和宽度分布。每个样本分析了50个纳米粒子（NPs），以量化裸露Au NRs和Au NRs@PEG的长度和宽度。（g）裸露Au NRs和Au NRs@PEG的紫外-可见-近红外（UV-vis-NIR）吸收光谱。通常，在Au NRs的合成过程中使用CTAB作为稳定剂和保护剂，帮助控制纳米棒的形状和大小。然而，当Au NRs用于光热疗法（PTT）时，溶液中的CTAB具有高毒性，可能会干扰治疗过程并阻碍Au NRs与生物分子的相互作用。为了提高Au NRs的生物相容性和稳定性，我们用聚乙二醇（SH-5000-PEG）对其表面进行了修饰。结果显示，经过PEG修饰后，Au NRs的分散性、尺寸（平均长度87.84 ± 6.19纳米，宽度13.28 ± 1.41纳米）、长宽比6.61以及形态基本保持不变（见图2b和f）。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像证实了Au NRs和Au NRs@PEG的高度结晶性（见图2c和d）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）进一步证实了Au NRs上成功涂覆了PEG，显示出特征性的C–H和C–O–C键，表明PEG的存在（见图S1）。此外，Au NRs和Au NRs@PEG的ζ电位从正变为负，并且在7天内性质稳定（见图S2）。此外，PEG修饰后的Au NRs的T-LSPR模式吸收峰保持不变，而L-LSPR模式吸收峰发生了8纳米的红移（见图2g中的红线）。

本研究旨在探讨Au NRs@PEG在1064纳米近红外（NIR-II）光激发下的光热性能。为此，选择了500毫瓦每平方厘米（mW cm?2）的激光功率，使用红外相机评估不同浓度（12.5、25和50微克每毫升（μg mL?1）的Au NRs@PEG的光热性能。结果表明，在25 μg mL?1的浓度下，Au NRs@PEG的温度在10分钟内升高到了56.7 °C，而水的温度变化可以忽略不计（见图3a）。如图3b所示，在恒定浓度（25 μg mL?1）的水溶液中，Au NRs@PEG在不同激光功率照射下的光热性能得到了验证。正如预期的那样，在1064纳米激光照射下，Au NRs@PEG表现出明显的、与激光功率相关的温度升高。如图3c所示，经过五次激光开关加热循环后，Au NRs@PEG的光热性能没有明显变化。光热转换效率（PCE）定义为纳米粒子将激光能量转化为热量的能力。激光照射10分钟后，关闭激光，并以30秒的间隔记录冷却速率，以评估热量从纳米粒子传递到周围环境的速度（见图3d）。与其他剂如GNR@Ag（28.8%）和Au@金属-有机框架（30.2%）相比，Au NRs@PEG在1064纳米下的PCE高达60.89%（见图3e和表S1）。

对Au NRs@PEG的光热性能进行了体外评估。（a）在500 mW cm?2激光照射下Au NRs@PEG的红外热成像图像。（b）在不同激光功率密度下，25 μg mL?1 Au NRs@PEG分散体的温度变化。（c）连续激光照射过程中Au NRs@PEG的光热稳定性。（d）激光治疗过程中Au NRs@PEG的加热和随后的冷却曲线。（e）Au NRs@PEG的量化PCE。

为了评估Au NRs@PEG的体外光热效果，我们研究了NIR-II光照射对癌细胞消融的影响。如图4a所示，在没有激光照射的情况下，暴露于不同浓度Au NRs@PEG的HeLa细胞对细胞存活率的影响很小，即使在最大浓度120 μg mL?1时也没有观察到显著差异。这一发现证实了Au NRs@PEG的生物相容性得到了提升。相反，在NIR-II光照射后，与Au NRs@PEG共培养的HeLa细胞经历了显著的光热介导的细胞死亡，这种效应与浓度相关。值得注意的是，当Au NRs@PEG浓度达到120 μg mL?1，并在1064纳米激光（400 mW cm?2）下照射几分钟后，大约80%的细胞被消灭。如图4b和c所示，对照组、仅激光处理组、仅Au NRs@PEG处理组以及Au NRs@PEG + 1064纳米激光处理组之间的迁移距离有显著差异。Au NRs@PEG + 1064纳米激光组对HeLa细胞的迁移表现出显著的抑制作用。

Au NRs@PEG的体外应用。（a）在Au-NR@PEG纳米粒子作用下CCK-8细胞的相对存活率。（b）使用伤口愈合实验在12小时、24小时和48小时评估HeLa细胞的迁移抑制情况。（c）实验重复三次，使用GraphPad软件进行定量分析。在12小时、24小时和48小时使用伤口愈合实验评估HeLa细胞的迁移抑制情况。每个实验重复三次，通过GraphPad Prism进行定量数据分析。**p < 0.01；***p < 0.001。比较分析显示，实验组中的迁移细胞数量显著减少，同时细胞形态也发生了显著变化。这些发现表明，Au NRs@PEG与1064纳米激光照射（光疗）的结合对细胞增殖和迁移具有明显的抑制作用。随后通过活细胞/死细胞荧光染色实验进一步探讨了Au NRs@PEG的光热性能。在该实验中，使用了Calcein-AM（发出绿色荧光以标记活细胞）和PI（红色荧光标记死细胞）。在NIR-II激光照射前，用50和100 μg mL?1的Au NRs@PEG处理的HeLa细胞中检测到了强烈的绿色荧光（激发波长：488纳米）。在10分钟的NIR-II激光照射后，用50和100 μg mL?1的Au NRs@PEG处理的HeLa细胞显示出显著的红色荧光（561纳米），表明细胞死亡。相比之下，未经Au NRs@PEG处理的HeLa细胞在相同NIR-II照射下，照射前后都显示出强烈的绿色荧光。这一发现表明，在没有Au NRs@PEG的情况下，激光并未直接导致细胞死亡。为了定量评估Au NRs@PEG的抗癌效果，对用Au NRs@PEG标记并用PI和FITC处理的HeLa细胞进行了流式细胞术分析。在1064纳米激光照射下，用Au NRs@PEG处理的HeLa细胞的凋亡率显著增加到58.5%（见图5b），证实了光热诱导的细胞死亡。为了进一步研究机制，我们检查了线粒体膜电位的变化。如图S3所示，用Au NRs@PEG处理并暴露于1064纳米激光的HeLa细胞显示出线粒体膜电位的显著下降，这通过明亮的荧光信号得到证实，而其他处理组没有显示出显著变化。这表明在光热效应下线粒体受到了损伤。此外，我们评估了不同处理后HeLa细胞中CRT和HMGB1蛋白的表达。只有Au NRs@PEG + 激光处理组显示出了CRT的外排和HMGB1的释放（见图S4和S5），表明Au NRs@PEG在激光照射下的光热效应诱导了免疫原性细胞死亡。这些发现表明，当Au NRs@PEG暴露于1064纳米激光照射时，有效地促进了细胞凋亡并增强了抗癌活性。

Au NRs@PEG在1064纳米激光照射下对肿瘤细胞的促凋亡效应。（a）在1064纳米、400毫瓦每平方厘米（1064 nm, 400 mW cm?2）激光照射前后，用Calcein AM和PI标记的对照组、50 μg mL?1和100 μg mL?1 Au NRs@PEG组的荧光图像。（b）凋亡HeLa细胞的流式细胞术分析。（c）在不同处理条件（DMEM、单独1064纳米激光、单独Au NRs@PEG、Au NRs@PEG + 1064纳米激光）下HeLa细胞的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。比例尺=100 μm。为了探讨Au NRs@PEG在光热疗法（PTT）中的治疗潜力，通过CLSM观察了样品。结果表明，用FITC标记的HeLa细胞在无NIR-II照射的情况下显示出微弱的荧光信号。然而，在NIR-II光照射后，荧光信号显著增强（见图5c）。这些观察结果证实，当Au NRs@PEG与激光照射结合使用时，能够有效地靶向并破坏HeLa细胞。

已经证明，作为光热治疗剂的Au NRs@PEG在激光照射下会产生热量，从而导致肿瘤细胞的破坏，这与纳米材料在癌症治疗中的发现一致。为了解决生物安全性和生物分布问题，我们评估了Au NRs@PEG的体内荧光成像和长期生物安全性。将ICG负载到纳米粒子上，然后通过静脉注射到小鼠体内，并在不同时间点进行NIR荧光成像。结果显示，在注射后的前2小时内肝脏荧光迅速增加，在注射后2小时达到峰值，随后逐渐减少，并在48小时几乎完全消除。这表明其在体内的停留时间较短，主要通过肝脏和肾脏代谢清除，从而降低了潜在的毒性。这些发现支持Au NRs@PEG作为宫颈癌有前景的光热治疗剂。为了进一步研究其潜力，我们使用动物模型评估了Au NRs@PEG的体内光热治疗效果。体内治疗的实验程序如图6a所示。对于体内评估，通过肌肉注射将Au NRs@PEG直接注射到肿瘤部位，并使用红外热成像设备持续监测小鼠的温度。如图6b和c所示，在10分钟的激光治疗期间，肿瘤部位的温度从大约34.5 °C迅速升高到50.5 °C，从而证实了Au NRs@PEG的光热效应产生的热量足以有效治疗肿瘤。相比之下，对照组在10分钟激光照射后温度仅上升了3.4 °C，进一步证实了Au NRs@PEG作为宫颈癌有前景的光热治疗剂的疗效。图6

体内光热疗法（PTT）安全性评估。(a) 体内治疗方案的示意图。(b) 给予PBS或Au NRs@PEG与1064纳米激光（400 mW cm?2）联合治疗的HeLa肿瘤小鼠的红外热成像图，分别在多个时间点拍摄。(c) 激光照射期间肿瘤部位的温度变化。(d) 治疗期间小鼠的体重变化。(e) 各治疗组中的代表性肿瘤图像。(f) 治疗后14天各组的肿瘤重量。(g) 肿瘤体积随时间的变化。(h) 来自对照组和Au NRs@PEG + 激光组小鼠的肿瘤及器官的H&E染色图。所有图像的刻度尺均为50 μm。(i) 和 (j) 血液学检查及肝肾功能指标的评估。使用携带宫颈肿瘤的小鼠模型评估了Au NRs@PEG的体内抗肿瘤活性。实验小鼠被分为四组：对照组、仅接受激光治疗的组、仅接受Au NRs@PEG治疗的组以及同时接受激光和Au NRs@PEG治疗的组。在注射Au NRs@PEG后12小时，对小鼠进行1064纳米激光治疗，持续时间为10分钟。结果显示，小囊泡诱导的PTT后小鼠体重没有显著下降，表明治疗没有引起急性不良反应（图6d）。如图6e、f和g所示，在14天的监测期间，对照组的肿瘤体积显著增加，Au NRs@PEG组和1064纳米激光组的肿瘤体积也有所增加。然而，Au NRs@PEG + 1064纳米激光治疗组的肿瘤大小和体重均有所下降。与其它组相比，Au NRs@PEG + 1064纳米激光治疗组在14天后肿瘤重量显著减少，肿瘤抑制率为93.5%。监测期结束时，收集小鼠的主要器官进行切片并进行了H&E染色。H&E染色显示组织样本中没有明显的损伤或坏死。Au NRs@PEG的光热作用成功诱导了肿瘤细胞的凋亡，而其他治疗方法未产生类似效果，证实了其光热治疗疗效。在1064纳米激光照射后，Au NRs@PEG诱导了肿瘤细胞的凋亡并抑制了肿瘤生长（图6h和S7）。此外，PTT后未观察到明显的组织或器官损伤，表明Au NRs@PEG不会损害主要器官。对接受治疗的肿瘤小鼠的器官进行组织学分析，未发现不良变化。此外，通过血液学参数评估了对重要器官的潜在体内副作用。与对照组小鼠相比，对每个治疗组的所有测量参数进行统计分析，未发现显著差异（图6i和j），表明Au NRs@PEG和1064纳米激光联合应用不会对血液生化标志物或肝肾功能产生负面影响。这些结果清楚地证明了Au NRs@PEG的优异生物安全性。

结论

总之，使用有限元方法和尺寸依赖的折射率模型对Au NRs的光吸收特性进行了数值模拟。模拟结果表明，长度为88纳米、直径为13纳米的Au NRs在NIR-II光照射下表现出最高的光转换效率（PCE）。基于这些发现，我们采用种子生长法合成了相同尺寸（长度88纳米、直径13纳米）的金纳米棒，并进一步用PEG对其进行功能化处理，以提高其稳定性和生物相容性。所得到的Au NRs@PEG复合物在1036纳米处显示出吸收峰，并表现出60.89%的高光热能量转换效率。此外，Au NRs@PEG在1064纳米照射下表现出优异的光声信号生成能力和组织穿透深度。体外和体内实验均证实，Au NRs@PEG在NIR-II光谱窗口内具有显著的光热疗效和生物安全性。这些纳米粒子具有内在的光学特性，可用于成像，并显示出未来光热治疗的潜力。

作者贡献

熊家宝和海雷古·图逊：撰写-原始草稿和编辑。丁佳怡：软件支持。董彪和努尔尼莎·阿利富：撰写-审阅和编辑。

利益冲突

无需要声明的利益冲突。

数据可用性

作者确认，支持本研究结果的数据包含在文章中。补充信息（SI）包括：用于治疗应用的金纳米棒的比较、Au NRs@PEG的FT-IR和ζ电位表征、HeLa细胞中的线粒体膜电位分析、CRT和HMGB1免疫荧光染色、体内NIR-I荧光图像及定量分析、肿瘤和主要器官的H&E染色，以及额外的参考文献。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d5ra10095j。

致谢

本研究得到了多个资助机构的支持，包括新疆医科大学的高发疾病发病机制预防与治疗国家重点实验室（编号SKL-HIDCA-2023-15）、新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号2022D01C727）、新疆维吾尔自治区天池博士人才计划（编号0301050903）、新疆医科大学人才专项基金（0103010211）、陕西省教育厅重点科研项目（23JS016）、新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号2022D01C715）、大学生创新创业培训计划（X35）、新疆维吾尔自治区区域协同创新专项科技援助计划（2022E02130）、重点项目（2022D01D40）、杰出青年项目（2023D01E06）以及新疆维吾尔自治区自然科学基金青年科学基金（2022D01C215）。此外，还得到了国家自然科学基金（授权号82073475、62035011、82260613和82060326）的支持。所有动物实验均按照新疆医科大学的实验室动物护理和使用指南进行，并获得了新疆医科大学动物伦理委员会（IACUC-20230509-01）的批准。

脚注

熊家宝和海雷古·图逊对本工作的贡献是等同的。