心外膜细胞外囊泡在心肌缺血再灌注损伤的心芯片模型中调控基因表达

《Materials Today Bio》：Epicardial extracellular vesicles modulate gene expression following ischemia-reperfusion injury in heart-on-a-chip

心外膜（Epicardium）是心脏发育、稳态维持及损伤反应的关键调节因子，然而心外膜细胞分泌的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的组成及其影响尚不完全清楚。本研究利用一种整合了人干细胞来源心外膜细胞与功能性心肌的“心外膜Biowire”平台，通过转录组学分析揭示了在心外膜细胞存在的组织中，细胞外囊泡转运过程显著富集。研究人员对心外膜来源的细胞外囊泡（Epi-EVs）进行了谱系分析，鉴定了关键miRNAs，并证实了这些miRNAs在刺激诱导的上皮-间质转化（Epithelial–Mesenchymal Transition, EMT）过程中的保守性。向经历缺血再灌注损伤（Ischemia–Reperfusion Injury, IRI）的组织补充Epi-EVs，影响了与细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑减少、成纤维细胞活化抑制以及细胞-ECM相互作用减弱相关的基因表达。通过将EV-miRNAs与其mRNA靶点进行关联分析，研究强调了miR-30d-5p、miR-9-5p、miR-16-5p及let-7家族在体外心肌损伤模型中调节有害的纤维化活化及基质重塑的作用。

论文解读：心外膜来源细胞外囊泡在心脏损伤修复中的调控机制

研究背景与意义

心外膜（Epicardium）作为心脏最外层的细胞层，在心脏发育、成体稳态及损伤修复中扮演着多重关键角色。在胚胎发生过程中，心外膜细胞通过上皮-间质转化（EMT）迁移至心肌层，分化为血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞等关键谱系，并分泌旁分泌因子协调心肌生长。在成体心脏中，心外膜在损伤后具有再激活能力，这使其成为通过旁分泌作用调节炎症、支持血管生成及减少纤维化的潜在治疗靶点。

细胞外囊泡（EVs）是介导细胞间通讯的重要载体，其携带的miRNA和蛋白质 cargo 深刻影响心脏生理、病理及修复过程。尽管已有研究提示心包液外泌体及心外膜脂肪组织来源的EVs在心肌梗死等疾病中发挥作用，但由于难以从人源心外膜-心肌样本中分离纯净的EVs，且在多细胞组织块中难以追溯EVs的细胞来源，心外膜细胞特异性分泌的EVs（Epi-EVs）的分子谱及其在健康与疾病心肌中的调控作用，尤其是在损伤早期的功能，仍知之甚少。

传统体外模型难以精确模拟心外膜-心肌的复杂相互作用。近年来发展的自组装心脏类器官及工程化心肌组织（EHTs）为研究这一互作提供了新视角。本研究团队此前开发的“心外膜Biowire”心脏芯片模型，通过在心轴周围预先形成的心肌组织外依次接种心外膜细胞，成功模拟了心外膜迁移过程及缺血再灌注损伤（IRI），为在生理相关条件下解析Epi-EVs的功能提供了理想平台。

本研究旨在利用人多能干细胞来源的心外膜-心肌组织模型，揭示Epi-EVs在心肌缺血再灌注损伤中的分子组成及功能影响，为靶向心外膜信号通路及开发新一代EV疗法奠定基础。该论文发表于《Materials Today Bio》期刊。

关键技术方法

为解析心外膜细胞外囊泡（Epi-EVs）在心脏损伤中的角色，研究人员构建了多层次的研究体系：

1. 1.
   构建心外膜-心肌组织模型：采用24孔板Biowire平台，将人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的心肌细胞（CM）与人心脏成纤维细胞（CF）包埋于胶原-Matrigel水凝胶中形成工程化心肌组织，随后在外层接种人胚胎干细胞（hESC）来源的GFP标记心外膜细胞，构建具有生理层次结构的“Epi”组织。
2. 2.
   诱导心外膜细胞分化与EMT：在二维培养中，利用SB-431542（SB）抑制剂诱导hESC来源的前心外膜细胞分化为成熟心外膜细胞；并分别应用转化生长因子-β（TGF-β）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）刺激，诱导其发生上皮-间质转化（EMT），生成不同谱系细胞用于后续EV分离。
3. 3.
   EV分离与表征：从上述不同谱系细胞培养上清中分离Epi-EVs，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定粒径与浓度，利用透射电镜（TEM）观察形态，并通过Western blot检测CD63、ALIX等EV标志物以进行定性验证。
4. 4.
   转录组学与功能分析：对“Epi”与“No Epi”（无外膜细胞）组织进行批量mRNA测序（RNA-seq），通过差异表达分析、基因本体（GO）富集分析及基因集富集分析（GSEA）揭示心外膜细胞的转录调控网络；进一步通过miRNA测序解析Epi-EVs的miRNA cargo，并将其与IRI损伤模型的转录组变化进行关联，锁定关键调控miRNA。

研究结果

2.1 心外膜细胞在常氧条件下增强工程化心脏组织的ECM发育与囊泡转运相关基因表达

研究人员比较了包含心外膜细胞（Epi）与不包含心外膜细胞（No Epi）的Biowire组织在培养两周后的转录组差异。尽管Epi组织中心肌细胞比例相对稀释，但差异表达分析显示，心外膜的加入特异性上调了579个基因，仅下调55个基因。值得注意的是，Epi组织显著上调了心脏组织特异性基因（如BIN1、GJA5）及心外膜标志物（WT1、TBX18）。GO分析表明，Epi组织独特地富集了与细胞外基质（ECM）组织、胶原纤维组织及基底膜相关的生物学过程。GSEA进一步揭示，Epi组织中“囊泡介导的转运”及“胰岛素样生长因子（IGF）转运调控”通路显著激活，提示心外膜细胞通过增强囊泡运输及ECM重塑能力，为组织修复提供了有利的微环境。

2.2 经历EMT的心外膜来源细胞分泌具有共同富集miRNA cargo的EVs

为解析Epi-EVs的分子特征，研究团队从成熟心外膜细胞（SB组）、TGF-β诱导的EMT细胞（TGF-β组）、bFGF诱导的EMT细胞（FGF组）及未处理的前心外膜细胞（NT组）中分离EVs。NTA与TEM表征确认了各组EVs的典型形态与粒径分布（主要位于100-200 nm）。尽管不同谱系来源的EVs在物理参数上无显著差异，但miRNA测序分析发现，四个组别的Epi-EVs中存在一组共同高表达的miRNAs（共54个），其中包括miR-30d-5p、miR-21-5p、miR-148a-5p、miR-16-5p及let-7家族成员。值得注意的是，这些miRNAs在经历EMT的细胞（TGF-β与FGF组）来源的EVs中保守性极高，表明EMT过程并未根本性改变Epi-EVs的核心miRNA cargo谱，提示其可能承载了心外膜细胞的基础调控功能。

2.3 Epi-EVs在体外IRI模型中减弱纤维化反应并调节心脏基因表达

为了评估Epi-EVs的功能，研究人员在Biowire平台诱导缺血再灌注损伤（IRI）后，向培养基中补充来自成熟心外膜细胞（SB组）的Epi-EVs。转录组分析显示，Epi-EVs处理显著下调了与细胞外基质组织、胶原分解代谢及成纤维细胞活化相关的基因（如COL1A1、COL3A1、TNC、POSTN）。GO分析进一步证实，Epi-EVs抑制了“细胞-ECM相互作用”及“整合素介导的信号通路”。这些分子层面的变化表明，Epi-EVs并非促进修复性纤维化，而是倾向于抑制IRI后过度的基质重塑及成纤维细胞激活，从而可能减轻有害的瘢痕形成。

2.4 Epi-EVs中富集的miRNAs与IRI损伤模型中下调的mRNA靶点相关

为建立Epi-EVs的miRNA cargo与其心脏保护作用之间的因果关系，研究人员将Epi-EVs中共同富集的miRNAs（来自2.2）与IRI损伤模型中差异表达的mRNAs进行了整合分析。结果显示，多个Epi-EVs高表达的miRNAs（如miR-30d-5p、miR-9-5p、miR-16-5p、let-7家族）的预测靶mRNAs，在IRI损伤组织中显著下调。这些靶mRNAs富集于TGF-β信号通路、EMT过程及细胞-基质粘附等生物学过程。该结果强烈提示，Epi-EVs可能通过递送上述miRNAs，在转录后水平抑制促纤维化及促基质重塑基因的表达，从而在IRI损伤中发挥保护作用。

讨论与结论

本研究利用先进的“心外膜Biowire”心脏芯片模型，首次系统揭示了人源心外膜细胞在生理相关组织环境中通过细胞外囊泡（Epi-EVs）调控心脏转录程序的作用。研究表明，心外膜细胞的加入显著增强了工程化心肌组织的ECM发育与囊泡转运能力。从心外膜细胞及其EMT衍生细胞中分离的Epi-EVs携带一组保守且功能相关的miRNAs（包括miR-30d-5p、miR-16-5p、let-7家族等）。在缺血再灌注损伤（IRI）背景下，补充Epi-EVs能够通过调节基因表达，抑制过度的细胞外基质重塑、成纤维细胞活化及细胞-ECM相互作用。Epi-EVs中富集的miRNAs与其在IRI模型中下调的促纤维化mRNA靶点显著相关，阐明了其潜在的作用机制。

综上所述，心外膜来源的细胞外囊泡通过其特定的miRNA cargo，在心肌损伤早期发挥抗纤维化及保护心肌的作用。这些发现不仅深化了对心外膜旁分泌机制的理解，也为开发基于Epi-EVs或其所含miRNA的新型心脏修复疗法提供了重要的理论依据与候选分子。