DNA引导的CRISPR–Cas12用于细胞RNA靶向

《Nature Biotechnology》：DNA-guided CRISPR–Cas12 for cellular RNA targeting

　　

摘要：在此，研究人员提出ΨDNA，一种基于DNA的引导子，可实现Cas12核酸酶对RNA的靶向，克服了传统上对RNA引导系统的依赖。研究人员对ΨDNA进行工程化改造，使其以反向取向模拟CRISPR RNA（crRNA）支架，从而使AsCas12a和Cas12i1能够识别RNA并触发强烈的单链DNA反式切割，以灵敏检测多种RNA物种，包括在临床样本中实现100%准确的丙型肝炎病毒RNA检测。ΨDNA还通过核糖体停滞，在多种人源细胞系中实现了对细胞内源性RNA转录本的70–95%多重敲低。机制研究表明，其活性依赖于一个茎环结构，该结构可稳定具有催化活性的Cas12–ΨDNA–RNA复合物。最后，crRNA和ΨDNA的共同递送使得单个效应子能够同时进行DNA编辑和RNA敲低，并且将不同酶模块化融合到AsCas12a上可将ΨDNA的应用扩展到RNase H介导的RNA降解和基于METTL3的表观转录组编辑。总之，ΨDNA引导子构成了一个适应性强的工具包，将Cas12系统的应用从基因组编辑和诊断扩展到了对细胞转录组及其表观转录组标记的精确、可编程控制。

论文解读：

研究背景与动机

CRISPR-Cas系统自发现以来，已被广泛应用于DNA和RNA的基因组编辑，并进一步改造用于诊断等领域。然而，传统的RNA引导（crRNA）系统存在一些局限性，例如RNA合成复杂、成本高、稳定性较差且保质期短。这限制了其在需要大规模、稳定、低成本引导分子的应用场景中的潜力。与此同时，尽管CRISPR-Cas9和Cas12在DNA靶向方面表现出色，而Cas13专门靶向RNA，但能够利用DNA引导分子实现精确、高效的细胞内RNA靶向和调控的系统尚未得到充分开发。因此，开发一种基于DNA的引导系统，使其能够兼容现有的、功能强大的Cas12效应蛋白，以实现可编程的RNA检测、敲低和修饰，具有重要的科学价值和广阔的应用前景。

研究概述与意义

本研究在《Nature Biotechnology》上发表，核心是开发了一种名为ΨDNA（伪引导DNA）的合成DNA引导分子。该分子通过模拟反向的crRNA支架结构，成功地引导AsCas12a和Cas12i1这两种V型Cas12效应蛋白特异性识别并结合RNA靶标。这种结合能够激活Cas12固有的、对单链DNA（ssDNA）的非特异性反式切割活性，从而实现了对RNA的高灵敏度检测。更重要的是，在细胞内部，AsCas12a-ΨDNA复合物能够结合目标mRNA，通过诱导核糖体停滞等方式，高效敲低内源性RNA转录本，而无需Cas蛋白直接切割RNA。该研究不仅扩展了Cas12系统的功能边界，使其从传统的DNA编辑和诊断工具，转变为能够对细胞转录组进行精确、可编程操控的多功能平台，还为开发更稳定、更经济的RNA靶向工具提供了新思路。

关键技术方法

本研究采用了多种技术方法验证ΨDNA系统的功能：

1. 1.
   蛋白质工程与生化分析：对多种Cas12同源蛋白（如AsCas12a, Cas12i1等）进行表达纯化，通过体外反式切割荧光检测实验，系统评估了不同crRNA支架截短形式和ΨDNA设计（如不同位置添加DNA手柄）对RNA靶标激活能力的影响，并确定了最优结构。
2. 2.
   结合与动力学表征：利用电泳迁移率变动分析（EMSA）、生物膜层干涉技术（BLI）和DNase I足迹法，证实了ΨDNA能与AsCas12a及靶RNA形成稳定的三元复合物，并测定了其结合亲和力与酶促动力学参数（如K_d, k_cat/K_m）。
3. 3.
   高通量筛选与优化：构建了包含256个变体的ΨDNA茎环突变库，结合高通量测序和功能验证，系统评估了支架茎环结构对活性的关键作用，并筛选出性能更优的非经典支架序列。
4. 4.
   细胞水平功能验证：在HEK293T、HeLa、HepG2、MCF-7等多种人源细胞系中，通过质粒转染或慢病毒转导稳定表达AsCas12a，并递送化学修饰的ΨDNA。利用流式细胞术、RT-qPCR、荧光显微镜等技术，定量评估报告基因和内源基因的翻译抑制与mRNA敲低效率。
5. 5.
   多组学与脱靶效应分析：通过RNA免疫共沉淀（RIP）、紫外交联免疫共沉淀测序（CLIP-seq）、核糖体测序（Ribo-seq）与mRNA测序（mRNA-seq）联用，在细胞水平证实了AsCas12a-ΨDNA复合物与靶RNA的特异性结合，揭示了其通过影响翻译效率（如核糖体停滞）导致RNA降解的潜在机制，并全面评估了其相对于RfxCas13d更低的转录组脱靶效应。
6. 6.
   临床样本验证：使用来自临床项目（如HCV-TARGET）的20份阳性与20份阴性丙型肝炎病毒（HCV）人血清样本，通过提取病毒RNA、逆转录-PCR（RT-PCR）、体外转录（IVT）结合ΨDNA-Cas12检测的流程，验证了该技术在复杂临床样本中检测RNA的准确性与特异性。

研究结果

Engineering of ΨDNAs for RNA detection using Cas12 enzymes

研究人员通过截短crRNA支架发现，Cas12i1和AsCas12a在仅有靶标结合区（无支架）的引导下，仍能对单链DNA（ssDNA）靶标保持反式切割活性。这提示它们可能接受DNA引导。进一步工程化发现，在互补DNA（cDNA）的3‘端添加一个模拟天然crRNA支架的DNA“手柄”（称为ΨDNA）时，能最大程度地增强AsCas12a和Cas12i1对RNA靶标（如microRNA）的检测活性。该系统显示出高特异性和可调的灵敏度，最佳引导长度在16-28个核苷酸之间。通过筛选77种不同的支架序列，发现AsCas12a对支架具有一定的容忍度，非经典支架（如来源于LbCas12a的支架）有时能带来更好的检测性能。机制研究表明，ΨDNA的茎环结构对于稳定具有催化活性的AsCas12a–ΨDNA–RNA三元复合物至关重要。该系统成功检测了包括丙型肝炎病毒（HCV）、登革热病毒和寨卡病毒在内的长链RNA靶标。在40份临床HCV样本（20阳，20阴）的验证中，针对HCV 5‘非翻译区（5’UTR）的ΨDNA引导子实现了100%的准确检测，展现了其临床诊断潜力。

Translational repression in HEK293T cells with ΨDNA and AsCas12a

为了评估ΨDNA–AsCas12a在活细胞中的功能，研究构建了一个报告系统。将靶向mCherry mRNA起始密码子或编码区的ΨDNA与AsCas12a–GFP和mCherry表达质粒共转染HEK293T细胞。荧光显微镜和流式细胞术分析显示，与单独使用ΨDNA或AsCas12a的对照组相比，AsCas12a与ΨDNA共同存在时，能更显著地降低mCherry的蛋白表达（平均荧光强度）和mRNA水平。这表明ΨDNA引导的AsCas12a复合物能在细胞内结合靶mRNA，并通过可能触发无义介导的mRNA衰减（No-go decay, NGD）等细胞内在机制，实现翻译抑制和RNA降解。

Efficient endogenous RNA knockdown using ΨDNA-guided CRISPR–Cas12a with low off-target effects

研究进一步证明了ΨDNA–AsCas12a系统能够高效敲低内源性RNA转录本。在HEK293T细胞中，靶向PPIA、RPL4和PCSK9等内源基因的ΨDNA与AsCas12a共表达，可导致目标mRNA水平降低50-70%。在稳定表达AsCas12a的细胞系中，敲低效率可进一步提升至95%。RNA免疫共沉淀（RIP）实验证实了AsCas12a在ΨDNA存在下能特异性结合靶RNA。重要的是，与广泛使用的RNA靶向酶RfxCas13d相比，AsCas12a–ΨDNA系统虽然敲低效率稍低，但其引起的转录组脱靶效应显著更低（对于PPIA基因低17.7倍）。核糖体测序（Ribo-seq）分析表明，ΨDNA–AsCas12a靶向会导致靶标PPIA的核糖体占据增加和翻译效率改变，这与核糖体停滞机制一致。CLIP-seq数据进一步在细胞水平证实了该复合物在靶转录本位点上的特异性结合与富集。

Potential application of AsCas12a and ΨDNA system

本研究展示了ΨDNA–AsCas12a平台的多功能应用潜力：

1. 1.
   DNA与RNA双重靶向：通过共同递送靶向DNA的crRNA和靶向RNA的ΨDNA，单个AsCas12a效应子能够同时在HEK293T细胞中实现对CCR5基因座的有效基因组编辑和对PPIA/RPL4RNA的敲低，且与单独使用ΨDNA相比，AsCas12a的存在将脱靶转录本数量减少了约43倍。
2. 2.
   多重RNA敲低：将靶向PPIA、RPL4、NRAS和PCSK9的多个ΨDNA混合递送，可在同一细胞中实现对这四种内源转录本的同时、高效敲低（效率达70%以上）。
3. 3.
   融合蛋白扩展功能：将AsCas12a与核糖核酸酶H（RNase H）的催化结构域融合，可进一步增强其对靶RNA的降解能力。将AsCas12a与RNA甲基转移酶METTL3融合，并在ΨDNA引导下，可在目标RNA位点（如GAPDH和FOXM1的特定位点）特异性地引入N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰，实现了可编程的表观转录组编辑。

讨论与结论总结

研究人员提出，AsCas12a–ΨDNA–RNA三元复合物的形成可能引发了类似于crRNA-dsDNA结合所触发的构象变化，从而激活了Cas12的反式切割活性。添加3‘DNA手柄的ΨDNA进一步稳定了这一复合物。由于Cas12缺乏HEPN结构域，该系统不会直接切割RNA，其细胞内的RNA敲低效应可能源于核糖体停滞引发的无义介导衰减（NGD）等细胞通路，邻近连接实验（PLA）也提示其可能与内源性RNase H1存在空间关联。

本研究开发的ΨDNA引导系统具有重要优势：DNA合成比RNA更廉价、稳定且快速，这为大规模、高通量的RNA检测和筛选应用提供了经济实用的替代方案。最重要的是，该工作成功地将主要用于DNA操作的CRISPR-Cas12系统，改造为一个独特的RNA靶向平台。与Cas13系统相比，DNA引导的AsCas12a由于不具RNA切割活性，展现出更低的转录组脱靶效应，为需要高特异性的瞬时基因沉默和基于融合蛋白的RNA操控（如定位、碱基编辑、表观转录组修饰）提供了有前景的新策略。此外，实现DNA编辑与RNA敲低的同步操作，为多层级的基因调控、功能基因组学研究及治疗开发（例如同时破坏病原体DNA并抑制其RNA）开辟了新的可能性。综上所述，ΨDNA引导子构成了一个适应性强、可扩展的工具包，极大地扩展了Cas12系统的功能范围，使其能够对细胞转录组及其表观转录组标记进行精确、可编程的控制。