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心脏特化涉及核程序，然而，腔室特异性对核蛋白质组格局的调控仍属未知。在本研究中，研究人员从健康小鼠心脏的四个主要解剖区域（新鲜组织）中分离出细胞核，并采用基于定量质谱的蛋白质组学技术，构建了左心室（LV，2403种蛋白质）、右心室（RV，2242种蛋白质）、左
心脏特化涉及核程序，然而，腔室特异性对核蛋白质组格局的调控仍属未知。在本研究中，研究人员从健康小鼠心脏的四个主要解剖区域（新鲜组织）中分离出细胞核，并采用基于定量质谱的蛋白质组学技术，构建了左心室（LV，2403种蛋白质）、右心室（RV，2242种蛋白质）、左心房（LA，2368种蛋白质）和右心房（RA，1816种蛋白质）的全面核蛋白质组格局。这导致了核区域蛋白质组特征的发现[心室特征，297种蛋白质；心房特征，183种蛋白质]；这些特征与氧化代谢和氧化还原调控、铁死亡、细胞外基质重塑、SUMO（小泛素相关修饰蛋白）和应激响应控制以及转录调控相关。腔室水平分析进一步识别了左心室（120种蛋白质）、左心房（188种蛋白质）和右心房（72种蛋白质）中独特的核特征。此外，研究人员定义了一个跨所有解剖区域共享的保守核心核蛋白质组（230种蛋白质），该组富含转录调控因子复合物、核仁/核糖体相关、RNA加工和染色质组织成分。在此核心网络中，研究人员报告了78个转录因子/共因子，并选择了与心脏相关的29个特异性因子（例如，Alpk3、Rbm14、Arglu1、Hmgb1、Myef2、Sf1）。在区域层面，研究人员通过免疫荧光验证了H2ac21和Sun2在左心房以及Ptbp2在左心室中的空间定位。本研究提供了对心脏核蛋白质组的腔室分辨视角，建立了将核蛋白质组学特征与心房和心室生物学联系起来的框架，揭示了心脏核蛋白质组景观相对于其他器官的独特特征，并为研究心脏病理生理学中的核重塑提供了基线。
研究背景与动机
心脏是一个高度组织化和代谢活跃的器官，通过节律性收缩和舒张维持全身循环。其四个腔室——左心室、右心室、左心房和右心房——在截然不同的机械和代谢负荷下运作。这种功能多样性依赖于调控收缩、能量代谢和信号转导的蛋白质的精确协调。细胞核是这一调控网络的核心，作为一个动态控制中枢，整合生物化学和生物力学线索以指导基因表达和染色质组织。然而，由于核蛋白通常丰度低，常与染色质结合，且心肌致密的收缩结构限制了其回收和检测，心脏核蛋白质组一直未被明确定义。常规的整体蛋白质组学分析在解析亚细胞区室化方面存在挑战，导致关键的转录和染色质相关调控因子在传统的心脏蛋白质组数据集中代表性不足。因此，深入了解心脏腔室特异性核蛋白质组，对于阐明正常心脏功能的基本调控机制，以及理解在肥厚、纤维化和心力衰竭等病理状态下的核重塑过程至关重要。本研究旨在填补这一空白，构建一个腔室分辨的小鼠心脏核蛋白质组图谱。
关键技术方法
本研究采用了优化的核富集工作流程，对新鲜分离的C57BL/6小鼠（12-14周龄，雌性）心脏的四个主要解剖区域（左心室、右心室、左心房、右心房）进行了核分离。通过改良商业试剂盒的离心步骤，显著减少了胞质蛋白的污染。同时，为每个区域制备了全局组织和胞质组分作为对照。所有样本（4个生物学重复）均采用基于磁珠的SP3（单罐固相增强样品制备）工作流程进行蛋白质酶解。肽段通过纳流液相色谱分离，并在Q Exactive HF-X轨道阱质谱仪上以数据非依赖采集（DIA）模式进行分析。质谱数据使用DIA-NN（数据非依赖采集神经网络）软件进行处理和分析，通过严格的过滤标准（如每组内至少67%的重复样本中有有效定量值）确保数据质量。差异丰度分析使用limma线性模型进行，功能富集分析通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路完成。最后，研究人员通过免疫荧光显微镜对筛选出的区域特异性核蛋白（H2ac21、Sun2、Ptbp2）在小鼠心脏组织切片上进行了空间定位验证，以支持蛋白质组学发现。
研究结果
心脏四个解剖区域细胞核的分离与表征
研究人员优化了一种核富集方案，通过额外的低速离心步骤，有效提升了核标志物（如组蛋白H3、Lmna）的富集，同时减少了胞质污染。对四个心脏区域的全局、胞质和核组分进行基于质谱的定量蛋白质组学分析，共鉴定了大量蛋白质。主成分分析显示，不同亚细胞组分（全局、胞质、核）的样本明显分离，而与解剖区域无关。差异丰度分析和k均值聚类揭示了三个与不同亚细胞区室相关的蛋白质簇：C1簇（1038个蛋白质）与核组分相关，富含核周、核斑等核相关功能；C2簇（1431个蛋白质）与膜和细胞器相关；C3簇（1854个蛋白质）与胞质组分相关，富含过氧化物酶体、蛋白酶体等功能。代表性核蛋白在所有区域的核组分中均显示出显著更高的丰度，验证了核分离的有效性。
心脏核蛋白质组景观的基准测试
通过与其他器官（脑、肝、肾）的核蛋白质组、心脏组织富集转录本数据集、已发表的小鼠心脏区域整体蛋白质组数据以及基于整体密度分级的心脏核蛋白质组数据进行比较，研究人员评估了本研究数据集的覆盖度。结果显示，本研究鉴定出1580个心脏特有的核蛋白质，并揭示了966个在其他器官核蛋白质组中未鉴定到的核注释蛋白质。与心脏区域整体蛋白质组相比，本研究额外鉴定了718个独特的蛋白质。这些比较证明了当前研究构建的小鼠心脏区域核蛋白质组景观具有全面性和独特性。
心脏区域间核蛋白质组景观的多样性
对四个心脏区域核组分的分析显示，蛋白质鉴定数量具有可比性，样本间相关性聚类清晰地显示了心房与心室核蛋白质组的分离。通过对核组分进行区域间差异丰度分析，研究人员鉴定出973个具有显著区域依赖性丰度差异的蛋白质。k均值聚类将其分为六个腔室相关的蛋白质簇，其中C2簇（297个蛋白质）为心室特征，富集于氧化磷酸化和心脏肌肉收缩通路；C3簇（183个蛋白质）为心房特征，与细胞骨架和催产素/apelin信号相关。此外，还识别出右心房主导特征、左心房主导特征和左心室主导特征等特异性簇。通过对这些差异蛋白质进行功能分类，研究人员详细描绘了转录因子与共因子、RNA加工/剪接/输出、染色质与表观遗传调控、核膜/核纤层与运输、应激响应与RNA颗粒、核-细胞骨架与肌节调控、细胞死亡与存活、细胞周期与有丝分裂以及蛋白质稳态等九大类核功能程序在不同心脏腔室中的特异性分布模式，揭示了核蛋白质组与腔室特异性机械负荷、代谢需求和信号环境的紧密关联。
心脏的核心核结构
研究人员从核组分中鉴定出的2876个蛋白质中，筛选出958个在所有区域和重复样本中稳定检测到且丰度无显著区域差异的蛋白质，定义为保守集合。通过进一步与匹配的胞质组分比较，从中确定了230个在核组分中显著富集的蛋白质，定义为“保守的核核心”。该核心富含转录调控因子复合物、核仁/核糖体相关、RNA加工和染色质组织成分，并包含78个转录因子/共因子，其中29个是相对于已报道的小鼠心脏组织转录因子网络中独有的因子。基因本体富集分析显示该核心定位于核质、染色体、核仁和核膜/核孔等经典核区室。核心内16个保守转录因子（如Mecp2、Ctcf、Creb1）的蛋白质相互作用网络图，突出了其在心脏发育和功能中的中心作用。代表性核心蛋白在不同心脏区域中丰度一致，支持了跨腔室共享的稳定核结构框架的存在。
通过免疫荧光验证区域特异性核蛋白
为验证质谱分析揭示的区域主导性核特征，研究人员对三个代表性核蛋白（H2ac21、Ptbp2、Sun2）进行了免疫荧光显微成像。结果与蛋白质组学聚类高度一致：H2ac21（左心房主导）在左心房心肌细胞核中信号最强；Ptbp2（左心室主导）在左心室核中富集程度最高；Sun2（左心房主导）主要定位于左心房心肌细胞的核膜区域。免疫荧光显示的腔室特异性定位模式定性地匹配了无标记质谱数据的区域趋势，从空间上证实了核蛋白质组学特征的生物学相关性。
讨论与结论总结
本研究首次系统定义了健康小鼠心脏不同解剖区域的核蛋白质组，绘制了核心核结构和区域主导性核程序图谱。研究人员建立了一个优化的核富集工作流程，显著提升了染色质相关和调控蛋白的回收率，并减少了胞质污染。研究揭示，心脏共享一个由230个蛋白质组成的保守核核心，其中包含一个高度互联的转录调控网络，为腔室特异性功能的建立提供了共同的支架。在此稳定核心之上，叠加了反映不同腔室独特生理角色的区域特异性程序：心室核蛋白质组特征与高代谢和收缩需求相匹配，富集氧化磷酸化和收缩相关调控因子；心房核蛋白质组则更侧重于核膜结构、钙信号和细胞骨架耦合，以适应其不同的机械和信号环境。通过与其它器官核蛋白质组比较，研究还揭示了966个心脏特有的核注释蛋白。对筛选出的区域富集蛋白（H2ac21、Sun2、Ptbp2）进行的免疫荧光验证，在组织水平支持了蛋白质组学的发现。
总之，这项研究通过整合优化的核分离、深度蛋白质组学分析、通路解析和空间验证，构建了一个腔室分辨的心脏核蛋白质组参考图谱。该资源将核组织与心房和心室生物学联系起来，为研究心脏病理生理学中的核重塑提供了基线，并为理解心脏转录调控网络和潜在的组织工程与再生医学研究提供了新的见解。
