《New Biotechnology》：Organoid-Based Transcriptomics Indicate IFIT-Associated Immune Modulation during Cryptotanshinone Treatment in Bladder Cancer
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膀胱癌（Bladder Cancer, BC），特别是肌层浸润性或转移性疾病，尽管免疫治疗取得了进展，仍然是一个主要的临床挑战。在这项研究中，研究人员筛选了五种候选小分子化合物，并鉴定隐丹参酮（Cryptotanshinone, CTS）为最有前景的化合物
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膀胱癌（Bladder Cancer, BC），特别是肌层浸润性或转移性疾病，尽管免疫治疗取得了进展，仍然是一个主要的临床挑战。在这项研究中，研究人员筛选了五种候选小分子化合物，并鉴定隐丹参酮（Cryptotanshinone, CTS）为最有前景的化合物。研究人员利用膀胱癌细胞系和膀胱肿瘤类器官评估了CTS对细胞增殖、迁移、凋亡和类器官生长的影响。通过对膀胱肿瘤类器官进行转录组测序，结合蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析和公共数据库（TCGA-BLCA、TIMER和TISIDB）分析，研究人员表征了CTS相关的分子特征。整合分析鉴定出IFIT1、IFIT2和IFIT3为与BC进展、预后、免疫浸润以及PD-1/PD-L1表达相关的代表性干扰素刺激候选基因。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析证实了这些发现，结果显示CTS处理后IFIT1/2/3在mRNA和蛋白水平的表达均降低。分子对接分析表明CTS与干扰素相关信号蛋白之间存在潜在的结合关系。一致地，CTS降低了TBK1和STAT1的磷酸化水平，为其与干扰素相关信号调节的关联提供了初步的实验支持。总之，CTS在膀胱癌模型中发挥了抑制生长的作用，并与肿瘤细胞固有的干扰素相关转录和信号变化相关，为进一步研究其作为膀胱癌候选小分子药物提供了基础。
论文解读文章：
研究背景、问题与研究目的
膀胱癌（BC）是全球第九大常见癌症，肌肉浸润性或转移性膀胱癌的治疗选择仍然有限，现有疗法主要依赖化疗和根治性膀胱切除术。尽管免疫检查点抑制剂（如pembrolizumab和nivolumab）在治疗转移性膀胱癌方面显示出希望，但仅有部分患者从中受益，因此迫切需要开发可靠的预后生物标志物以更好地指导治疗决策。类器官技术已成为癌症研究的关键工具，能够模拟肿瘤特征、微环境和疾病进展。隐丹参酮（CTS）是一种脂溶性醌类化合物，具有包括抗肿瘤和免疫调节在内的多种药理活性。然而，此前缺乏在能更准确模拟疾病生物复杂性的实验模型中对CTS进行的全面评估。干扰素诱导的四肽重复序列（Interferon-induced tetratricopeptide repeat, IFIT）家族成员在抗病毒免疫反应、细胞功能调控以及肿瘤发生发展中起关键作用，但IFIT1、IFIT2和IFIT3在膀胱癌中的作用尚未被充分探索。基于此，本研究旨在利用BBN诱导的膀胱癌类器官模型，探究CTS在膀胱癌中的作用及其分子机制，特别关注与IFIT家族相关的免疫调节作用。
关键技术方法
为探究CTS在膀胱癌中的作用机制，研究人员综合运用了多种体外和分子生物学技术。细胞功能实验包括CCK-8法检测细胞毒性、集落形成实验、伤口愈合实验和流式细胞术检测细胞凋亡。研究核心使用了N-丁基-N-(4-羟基丁基)亚硝胺（BBN）诱导的小鼠膀胱组织构建的膀胱肿瘤类器官模型，用于药物敏感性测试、免疫荧光染色和随后的批量RNA测序分析。测序数据分析包括主成分分析、差异表达基因分析、基因本体和京都基因与基因组百科全书富集分析、蛋白-蛋白相互作用网络构建与分析。生物信息学分析利用TCGA、GTEx、CCLE、TIMER、TISIDB等公共数据库评估IFIT1/2/3的表达模式、临床意义和免疫学相关性。实验验证通过qRT-PCR和Western blot在细胞和类器官水平检测基因和蛋白表达变化。最后，通过AutoDock Vina对CTS与干扰素相关信号通路关键蛋白进行分子对接模拟，并通过Western blot检测相关信号蛋白的磷酸化水平以提供初步实验验证。
研究结果
3.1. CTS在体外表现出显著的抗膀胱癌活性
研究人员评估了五种小分子化合物在膀胱癌细胞系5637和T24上的抗肿瘤活性。结果发现，CTS表现出最强的抗癌活性，显著优于其他化合物。
3.2. CTS在体外抑制膀胱癌生长
在二维细胞模型中，CTS处理以时间和剂量依赖性的方式降低了膀胱癌细胞的活力，并减少了克隆形成能力、抑制了细胞迁移、增加了凋亡细胞比例。在三维BBN诱导的膀胱肿瘤类器官模型中，CTS处理同样导致类器官大小和数量呈剂量依赖性减少，并降低了增殖标志物Ki67的表达。
3.3. CTS改变膀胱癌类器官的转录组谱
对CTS处理与未处理的膀胱癌类器官进行RNA测序分析。主成分分析显示两组样本的基因表达模式明显分离。差异表达分析共鉴定出700个差异表达基因，其中498个在CTS组下调，202个上调。下调基因中包括Ifit1、Ifit2、Ifit3、Cxcl15和Ifi44等。
3.4. 富集分析揭示CTS相关的代谢和干扰素/免疫相关特征变化
基因本体和KEGG通路富集分析表明，上调基因主要富集于细胞应激反应、解毒和代谢过程相关通路。而下调基因则主要富集于干扰素和免疫相关的生物学过程，如先天免疫反应调节、细胞因子介导的信号通路、细胞对干扰素-β的反应等。KEGG通路分析也支持下调基因与NOD样受体信号通路、cAMP信号通路等干扰素/免疫相关及肿瘤相关信号特征相关。
3.5. IFIT1/2/3成为与CTS反应相关的代表性候选基因
通过对差异表达基因进行蛋白-蛋白相互作用网络分析，并利用MCODE算法识别核心模块。排名最高的核心模块包含Ifit3、Ifit1、Ifit2等基因，其中IFIT家族成员在网络中占据相对中心的位置。在TCGA-BLCA队列中，这些基因在肿瘤组织中的表达普遍高于癌旁组织。生存分析表明，IFIT1、IFIT2或IFIT3的高表达与膀胱癌患者较差的生存期相关。qRT-PCR和Western blot验证证实，CTS处理降低了类器官中Ifit1/2/3的mRNA表达以及膀胱癌细胞中IFIT1/2/3的蛋白表达水平。
3.6. IFIT1/2/3在膀胱癌中表达上调并与免疫浸润相关
对多癌种TCGA数据分析显示，IFIT1/2/3在包括膀胱癌在内的多种肿瘤组织中表达上调。在TCGA-BLCA数据中，IFIT1/2/3的表达在晚期临床分期、高组织学分级和非乳头状亚型中更高。利用ESTIMATE算法分析发现，IFIT1/2/3的表达水平与ESTIMATE评分、免疫评分、基质评分呈显著正相关，与肿瘤纯度呈负相关。进一步的免疫浸润分析表明，IFIT1/2/3的表达与多种肿瘤浸润免疫细胞（如CD8+T细胞、巨噬细胞、调节性T细胞等）的估计丰度呈正相关。
3.7. IFIT1/2/3表达与膀胱癌中免疫相关因子的关联
IFIT1/2/3的表达水平与大多数趋化因子及其受体、主要组织相容性复合体相关基因、免疫激活分子（如ICOS、CD80）以及多种免疫抑制分子（如PDCD1(PD-1)、CD274(PD-L1)、LAG3）的表达呈显著正相关。
3.8. 分子对接提示CTS与干扰素相关信号网络的潜在关联
通过GeneMANIA网络分析发现，IFIT1/2/3与cGAS-STING和JAK-STAT信号通路中的多个基因（如STING1、STAT1、IRF9）存在功能关联。分子对接分析预测，CTS可能与cGAS-STING通路中的STING1、cGAS以及JAK-STAT通路中的JAK1、TYK2、STAT1等关键蛋白具有潜在的结合能力。初步的Western blot实验证据显示，CTS处理降低了5637膀胱癌细胞中TBK1和STAT1的磷酸化水平，而总蛋白水平变化不大。
讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出，本研究通过整合转录组学和生物信息学分析，表征了CTS在膀胱癌中相关的分子特征，突出了IFIT家族基因和干扰素相关转录程序作为CTS反应网络的潜在组成部分。研究发现CTS在膀胱癌模型（包括细胞系和类器官）中抑制了生长相关表型，并伴随着干扰素/免疫相关基因表达的变化，其中IFIT1、IFIT2和IFIT3成为CTS反应的干扰素刺激基因特征中的代表性候选基因。这些基因的表达与不良生存结局和膀胱癌中的免疫相关特征相关，提示了潜在的临床意义。分子对接和初步的信号实验（TBK1和STAT1磷酸化水平降低）为CTS与IFIT相关的干扰素信号之间的可能联系提供了支持。然而，研究人员也指出了本研究的局限性，包括对cGAS-STING-IFN-I-JAK-STAT信号轴机制洞察的不完整、缺乏IFIT基因功能缺失/获得实验以确定其是否介导CTS表型效应、以及类器官模型在模拟肿瘤免疫微环境复杂性方面的不足。未来需要在免疫健全的体内模型中进行更深入的功能验证和机制研究。
结论部分翻译：
总之，本研究表明，CTS在膀胱癌模型（包括二维细胞模型和三维膀胱肿瘤类器官）中抑制了生长相关表型。转录组学和生物信息学分析显示，CTS处理伴随着干扰素/免疫相关基因表达的变化，其中IFIT1、IFIT2和IFIT3成为CTS反应的干扰素刺激基因特征中的代表性候选基因。它们在膀胱癌中与不良生存结局和免疫相关特征的关联进一步支持了其潜在的临床相关性。重要的是，通过qRT-PCR和Western blot分析在mRNA和蛋白水平上进一步验证了IFIT1、IFIT2和IFIT3的下调。此外，CTS降低了TBK1和STAT1的磷酸化水平，为将CTS治疗与IFIT相关干扰素信号通路的减弱联系起来提供了初步的信号水平证据。总体而言，这些发现为理解膀胱癌中CTS相关的转录和信号反应提供了一个假设生成的框架。需要利用免疫健全的体内模型和功能扰动实验进行进一步研究，以阐明CTS的确切机制和治疗相关性。
