利用片段大小信息的双端测序降低X染色体非整倍体的产前游离DNA筛查阳性率

《Prenatal Diagnosis》：Prenatal Screening Via cfDNA – Paired-End Sequencing Utilizing Fragment Size Information Reduces the Screen Positive Rate for X Chromosome Aneuploidies

摘要 目的：产前游离DNA（cell?free DNA, cfDNA）筛查已深刻改变临床诊疗模式，然而区分X染色体非整倍体信号来源于孕妇还是胎儿仍具挑战性，导致筛查阳性率与假阳性率升高。潜在解决方案之一是整合双端测序（paired?end sequencing, PES）获得的片段大小数据。 方法：研究人员基于大规模临床队列，评估在cfDNA筛查中引入PES片段大小信息对X染色体非整倍体检测性能的影响。在同一批孕妇（n = 118?859）中，比较整合片段大小数据前后单体X（monosomy X, MX）与XXX型三体（trisomy X, XXX）的筛查阳性率；同时比较采用PES（含片段大小信息）与单端测序（single?end sequencing, SES，无片段大小信息）的孕妇（n = 141?364）中报告的假阳性率。 结果：整合PES片段大小信息后，MX筛查阳性率显著降低49.1%（227/446），XXX筛查阳性率降低42.9%（60/105）。PES组的MX报告假阳性率为0.0033%，低于SES组的0.0085%；研究期间未收到XXX假阳性报告。 结论：结果表明，利用PES片段大小信息可有效降低筛查阳性率，有望减少临床cfDNA产前筛查中的假阳性情况。

研究背景与意义

产前游离DNA（cfDNA）筛查凭借高灵敏度与特异度，已成为常规产科人群染色体非整倍体筛查的首选手段，尤其对13、18、21号染色体三体检测表现优异，并减少了侵入性操作的需求。然而性染色体非整倍体（sex chromosome aneuploidies, SCAs）的检测性能明显滞后，其中单体X（MX）与XXX型三体（XXX）因可在孕妇体内以生殖系或体细胞嵌合形式存在，导致母胎cfDNA混合信号难以溯源，显著推高筛查阳性率与假阳性率。母体X染色体嵌合现象普遍且常未被诊断，可在筛查中被误判为胎儿异常，引发不必要的心理负担与侵入性检查。美国医学遗传学与基因组学学会建议对所有孕妇提供SCAs风险评估，因此提升SCA检测准确性具有重要临床价值。双端测序（PES）可精确测定cfDNA片段长度，而母体来源片段平均长于胎盘（胎儿）来源片段，为区分信号来源提供了可能。本研究旨在评估PES片段大小信息在临床cfDNA产前筛查中的应用价值，成果发表于《Prenatal Diagnosis》。

关键技术方法

研究回顾性分析了2020年1月1日至2023年12月31月间260?223例单胎妊娠样本，排除未申请性染色体分析、纽约州居民及年龄小于18岁者。样本由CLIA认证的Illumina实验室进行Verifi产前筛查，分别采用PES平台（n = 118?859）与SES平台（n = 141?364）。生物信息学分析分为两个阶段：第一阶段不纳入片段大小信息，使用SeqFF法估算胎儿分数（fetal fraction, FF），计算X染色体标准化覆盖值（normalized chromosome value, NCV_X）进行分型；第二阶段仅针对PES初筛为MX或XXX的样本，联合短片段（<150?bp，胎儿富集）与全片段池的计数比值，构建似然比统计模型重新分类。假阳性率通过临床自愿上报的不一致结果进行评估。统计学分析采用R语言及相关软件包完成。

研究结果

3.1 双端测序对MX筛查阳性率的影响

在118?859例PES样本中，初筛（Before FS）共446例被判为MX高风险。整合片段大小信息（With FS）后，仅227例维持MX诊断，其余219例被重新归类为XX。MX筛查阳性率从0.38%降至0.19%，下降幅度达49.1%（p < 2.2×10^?16）。定量NCV_X分布显示，最终判为MX与XX的两组间存在显著重叠，表明仅凭覆盖度无法可靠区分信号来源。

3.2 双端测序对XXX筛查阳性率的影响

XXX初筛阳性105例，经片段大小分析后，60例维持XXX诊断，45例转为XX，筛查阳性率从0.09%降至0.05%，降幅42.9%（p = 0.0006）。同样观察到NCV_X分布在两类结果间存在重叠。

3.3 人口统计学特征

MX初筛群体平均孕妇年龄为32.1岁，平均孕周13.0周；最终MX与XX亚组孕周相近，年龄差异不显著。XXX初筛群体平均年龄34.2岁，最终XXX组平均年龄显著高于XX组（37.4岁 vs. 29.2岁），与已知高龄受孕风险相符。

3.4 双端测序对自愿上报假阳性率的影响

研究期间未收到XXX假阳性报告。SES组MX报告假阳性12例，假阳性率0.0085%；PES组仅4例，假阳性率0.0033%，下降约61%。部分假阳性与MX/XY嵌合或母体嵌合有关。

讨论与结论

本研究证明，PES技术结合片段大小信息可将MX筛查阳性率降低近一半，XXX筛查阳性率亦显著下降，且报告假阳性率同步降低。由于母体与胎儿来源的X染色体信号在无片段信息时高度重叠，PES可有效区分两者，从而提升阳性预测值（PPV）并减少不必要的侵入性检查。虽然缺乏完整的随访数据限制了PPV的直接计算，但既往研究显示该技术可使MX的PPV提升至31%–80%，XXX的PPV达72%–100%。此外，PES为是否及如何报告母体偶然发现提供了灵活性，可在不影响胎儿风险评估的前提下兼顾孕妇健康管理。研究优势在于大样本量及同一样本的前后对照设计，局限性在于临床随访不完整及上报偏倚。未来可将该策略推广至其他易受母体嵌合影响的染色体异常筛查，以进一步降低假阳性率。

结论

区分cfDNA产前筛查中X染色体非整倍体信号来源于孕妇还是胎儿，长期困扰临床并导致假阳性问题。本研究表明，利用双端测序的片段大小信息进行生物信息学分析，可显著降低单体X与XXX型三体的筛查阳性率，并减少临床报告的假阳性案例，从而改善cfDNA产前筛查的整体性能。