在体外使用未被充分利用的抗寄生虫植物——Meyna laxiflora Robyns的种子提取物处理后，Ascaridia galli（鸡蛔虫）的结构和组织发生了变化

《Poultry Science》：Structural and histological changes in Ascaridia galli exposed in vitro to underutilized anthelmintic plant, Meyna laxiflora Robyns seed extract

　　**Thoudam Bishaya Devi | N. Mohilal | Chingakham Brajakishor Singh**

**印度曼尼普尔大学动物学系，曼尼普尔邦Canchipur，795003**

**摘要**

本研究评估了Meyna laxiflora Robyns的甲醇种子提取物对最常见家禽线虫Ascaridia galli的体外抗蠕虫作用，通过成虫死亡试验来测定其抗蠕虫潜力。线虫被置于含有0.1%二甲基硫酸酯的生理磷酸盐缓冲盐水溶液中不同浓度的提取物（0.05-100mg/mL）中，并在37 ± 1°C下孵育。同时进行了与广谱抗蠕虫药物Albendazole的平行试验。结果显示，该提取物可导致线虫完全失活和松弛性麻痹，最终死亡时间因剂量而异，这表明提取物的活性与剂量呈负相关。用100mg/mL提取物处理的线虫在7.96 ± 1.00小时内死亡，与Albendazole（4.51 ± 0.37小时）相当。细胞毒性试验表明，该提取物对HEK293T和HeLa细胞的毒性较低（<5%）。定性植物化学分析发现其中含有丰富的生物活性成分，如生物碱、黄酮类、皂苷、甾体和萜类化合物。气相色谱-质谱分析鉴定出主要成分包括Melezitose（51.88%）、L-葡萄糖（7.14%）和3-环己-3-烯丙酸（5.76%）。扫描电子显微镜观察显示，提取物处理后的线虫表皮发生明显变形、脱屑和皱缩。组织学检查进一步证实了提取物对线虫表皮、胃肠道和生殖系统的破坏作用，反映了其强烈的杀虫效果。

**引言**

胃肠蠕虫感染是全球影响动物和人类群体的主要寄生虫病之一，无论是发达国家还是发展中国家都认为这是重要的兽医和公共卫生问题（Perry和Randolph，1999；Hafeez，2003）。多种家禽蠕虫的严重感染限制了散养和深垫料养殖系统中家禽副产品的生产（Permin等人，1999；Fossum等人，2009）。Ascaridia galli是家禽中最常见的蠕虫寄生虫，过去十年中在商业产蛋鸡中的感染率有所增加（Permin等人，1999；Abdelqader等人，2008；Kaufmann等人，2011b；Tarbiat等人，2016）。严重感染的鸡可能会出现疲倦、出血性病变和严重腹泻等症状（Ruff，1999；Permin等人，1998；Sharma等人，2019）；而大量感染则可能导致小肠腔堵塞。肠道黏膜受损，营养吸收受影响，从而降低体重增长（Kilpinen等人，2005；Das等人，2010），导致治疗成本增加和鸡蛋及肉类产量显著下降（Raza等人，2016；Syeonidou等人，2018）。Ascaridia galli的经济影响还在于它可作为病原菌（如沙门氏菌和大肠杆菌）的传播媒介（Chadfield等人，2001；Permin等人，2006；Abdelqader等人，2012）。虽然市场上的广谱抗蠕虫药物（如Albendazole、Levamisole、Ivermectin、Benzimidazole、Febendazole等）对Ascaridia galli具有高效疗效（Yaswinski等人，2013），但多种蠕虫寄生虫已经产生了抗药性（Shalaby，2013；Arece-García等人，2016），这种情况在家禽养殖中尤为普遍（Stear等人，2007）。为缓解药物抗性和家禽产品中的化学残留问题，人们开始探索天然化合物等替代抗蠕虫策略。

**Meyna laxiflora Robyns**

Meyna laxiflora Robyns（图1）属于茜草科（Rubiaceae），是原产于从北孟加拉到缅甸的茂密雨林中的约6500种树木和灌木之一（Janarthanan等人，2019）。它在印地语中称为“Muyna”，孟加拉语中称为“Muduna”，在曼尼普尔语中称为“Heibi”。这种带刺或无刺的灌木原产于印度北方邦西部、西孟加拉邦、东北部和德干半岛。叶子呈卵形至椭圆形；花序为松散的聚伞花序，开淡绿色的花；果实肉质，近球形，颜色从绿色到棕色不等，含有4-5个单室梨果，每个梨果内含一粒种子（Rymbai等人，2022）。种子有白色胚乳和外种皮。果实和叶子均可食用，但叶子作为饲料的质量较低（Gupta，2009）。该植物在传统医学中用于治疗多种疾病，包括炎症和胃肠道疾病（Patil等人，2001）。古印度医学文献《阿育吠陀》记载，Meyna laxiflora具有止泻和抗菌作用（Thoreson等人，2007）。Meiteis民族将种子用于驱虫，叶子则用于制作当地沙拉“Singju”。

目前尚无关于Meyna laxiflora Robyns对抗任何寄生虫（包括Ascaridia galli）的科学研究。因此，本研究旨在科学验证其种子提取物对常见家禽线虫Ascaridia galli的体外抗蠕虫效果。

**材料与方法**

**种子甲醇粗提取物制备**

2022年9月至2023年1月期间，从印度曼尼普尔各地收集了Meyna laxiflora Robyns的新鲜果实。该植物由印度植物调查局的科学家N. Odyuo鉴定（参考编号BSI/ERC/Tech/2022-23/373）。果实用清水彻底清洗，去除果肉和硬壳种子，晾干约一个月后捣碎，提取出类似杏仁的种子，并进一步干燥至无水分，然后用研磨机研磨成细粉。将粉末状种子置于100%甲醇（未经稀释）溶液中进行冷浸提取72小时。将250克粉末样品浸泡在溶剂中（比例1:10），每隔6小时用玻璃棒搅拌一次。过滤后的提取物在40°C减压条件下用Whatman 1号滤纸过滤，浓缩后再冷藏备用。

**提取物产率**

干燥种子粗提取物的产率通过公式计算。

**植物化学成分分析**

通过常用的沉淀和显色反应定性分析粗提取物中的化学成分，鉴定主要植物化学物质。采用标准程序和试剂对提取物进行筛选（Debella等人，2002；Harborne等人，2007），以确定具有抗蠕虫作用的活性成分，如生物碱、黄酮类、糖苷、酚类、鞣质、甾体和萜类。

**气相色谱-质谱分析**

使用Agilent 8890标准型号仪器（配有火焰离子化检测器FID）在马德拉斯IIT的Sophisticated Analytical Instrument Facility（SAIF）进行GC-MS分析。流动相为惰性气体氦气（99.999%），样品体积为1μL。毛细管柱为5%苯基甲基硅氧烷HP-5 MS柱（尺寸30 m x 250 μm x 0.25 μm），温度范围为-60°C至325°C。GC运行时间为53.5分钟。样品注入后，氦气以1 mL/min的速度携带样品通过柱子。在70eV下采集质谱数据。通过质谱库（授权NIST 2017库；软件：Open Lab CDS 2.5版）根据质谱图和保留指数（RI）确定化合物名称、分子量和结构。

**细胞培养与细胞毒性试验**

使用HeLa和HEK 293T细胞系评估MLS的体外细胞毒性。细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养24小时后，暴露于不同浓度的提取物（50、100和400 μg/mL）或50 nM多西他赛（作为阳性对照）48小时。3-4小时后加入MTT试剂测定细胞活力（López-García等人，2014；Chatterjee等人，2022）。接着加入100 μL DMSO，使用微孔板读数仪在570 nm处测量吸光度（A），计算细胞存活率。

**体外成虫死亡试验**

根据Vijaya和Yadav（2016）的方法，评估MLS对新鲜屠宰的自然感染鸡体内的Ascaridia galli成虫的体外抗蠕虫效果。活体健康雌雄线虫在37 ± 1°C的0.9%磷酸盐缓冲盐水（PBS）中反复清洗。将线虫置于37 ± 1°C的培养箱中，分别用不同浓度的MLS（0.05、1、5、10、25、50和100 mg/mL PBS）处理。同时进行相同浓度下的广谱抗蠕虫药物Albendazole（ABZ）对照实验。一组线虫仅在PBS中作为对照组。通过观察线虫的运动能力（麻痹或死亡）来评估化合物的抗蠕虫效果，每15分钟记录一次。确认死亡时使用两种PBS溶液：一种为37 ± 1°C，另一种为40 ± 1°C。用软刷轻轻刺激不动的线虫，若其完全失去运动能力则视为麻痹。当线虫在温暖盐水中持续5分钟仍无运动时，说明其已死亡。每个实验组重复多次以确定死亡时间。

**组织学研究**

从每组培养皿中取出线虫，用无菌工具从中段取样进行组织学切片。标本用10%中性缓冲福尔马林固定，然后用去离子水洗涤。随后依次用不同浓度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）脱蜡，再在石蜡中包埋。使用LEICA RM2125 RTS切片机将组织切成5-8 μm厚。切片后固定在载蛋白玻璃载玻片上，依次用二甲苯（I、II、III）脱蜡，再用分级乙醇（100%、90%、80%、70%）复水。用hematoxylin染色，再用eosin复染。将染色的载玻片用水冲洗后，使用DPX装片介质（Lalchhandama，2010；Darmawi等人，2012a，2013b；Isaac，2023）加上盖玻片进行封装。通过光学显微镜（Olympus CH 20）使用10倍和40倍物镜检查A. galli组织的组织学变化，并进行拍照。扫描电子显微镜（SEM）成像：对于SEM成像，对照组和处理组的寄生虫首先用PBS彻底清洗，然后在0.1 M钠cacodylate缓冲液中加入4%戊二醛在4°C下固定4小时。随后，在相同的缓冲液中用1%四氧化锇（OsO4）进行二次固定1小时。按照Dey等人（1989年）的方法，并由Roy和Tandon（1991年）改良的方法，将样品通过分级丙酮系列脱水，然后在TMS中干燥。干燥后的样品在低真空（10-3 Torr）下使用JFC 1100（JEOL）离子溅射镀膜机镀金。镀金后的样品使用JEOL JSM 6360 SEM（JEOL Ltd.，东京，日本）和QUANTA 250 SEM在15 kV的加速电压下进行检查。统计分析：所有实验数据均表示为平均值±标准差（SD）。使用Origin 2018软件来图形化表示数据。所有数据通过单因素方差分析（ANOVA）进行评估，随后使用Tukey事后检验。p<0.001的结果被认为是统计学上显著的。

M. laxiflora Robyns的提取产量和植物化学成分：在本研究中，M. laxiflora Robyns种子在100%甲醇中的提取产量非常低，仅为4.37%（基于干重）。对MLS的定性植物化学成分分析显示存在多种次生代谢物，如生物碱、皂苷、类固醇和萜类化合物，这些成分的沉淀程度很高（+++），如表1所示。还检测到了酚类化合物、单宁和黄酮类化合物，但flobatannins和蒽醌类化合物没有检出，这可能是因为它们在甲醇溶剂中的溶解度较低。表1. Meyna laxiflora Robyns甲醇种子提取物的初步定性测试。名称 测试方法 原始MLS提取物 生物碱 Dragendroff’s/Kraut’s测试 +++ Hager’s测试 +++ 蒽醌 Borntrager’s测试 - HCl测试 - 黄酮类 Lead acetate测试 +++ 苷糖 Liebermann-Burchard’s测试 +++ 酚类 Ferric chloride测试 + flobatannins HCl测试 - 皂苷 Foam测试 +++ 类固醇 Test for steroid +++ 单宁 Brayner’s测试 + 蒽类 Salkowski’s测试 +++ 注：PSM：植物次生代谢物；+++ = 最高含量成分；++ = 中等含量成分；+ = 最低含量成分；- = 未检出相应的植物化学成分。所有测试都重复进行了三次，并使用了两种不同的提取物制备方法。

GC-MS分析：MLS的气相色谱图显示在图2中，通过质谱鉴定的化合物列表见表2。共鉴定出19种化合物，其中Melezitose（α-D-glucopyranosyl-(1->3)-β-d-fructofuranosyl-(2->1)-α-d-glucopyranoside是一种非还原性三糖，其相对丰度最高，为51.88%，其次是L-Glucose（7.14%和5.51%），D-Glucose的异构体；3-Cyclohex-3-enylpropionic acid（5.76%），一种属于不饱和脂肪酸的挥发性化合物；以及1-(2-Acetoxyethyl)-3,6-diazahomoadamantan-9-one oxime（3.53%），一种含有生物活性的杂环化合物。此外，还检测到了脂肪酸酯，如Valeric acid, tridecyl ester（1.34%）、Hexadecanoic acid, 2-hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester（1.31%）、Octadecanoic acid, 2-hydroxy-1-(-(hydroxymethyl) ethyl ester（0.989%）；生物活性酯，如Cyclohexanecarboxylic acid, 2-hydrox-, ethyl ester（1.79%）；以及Acetic acid, trifluoro-, octahydro-4-hydroxy-1,5-methano-1H（2.76%），这是一种属于萜类化合物的桥接多环酯。还检测到了两种生物碱，1,6-Dimethyl-8-[hydroxymethyl]-tetrahydroquinoline（0.64%）和1,2-Cinnolinedicarboxylic acid, 1,2,3,5,6,7,8,8a octahydro（2.50%）。此外，还确定了n-hexadecanoic acid, 1-(2-butenyl)-2-oxo-, ethylester（1.93%），属于萜类或倍半萜类。n-hexadecanoic acid（0.88%）是一种被认为具有驱虫效果的生物活性饱和脂肪酸（Lalthanpuii等人，2020；Khan等人，2024）。四种最丰富的化合物的离子色谱图显示在补充图S1-S4中。

细胞毒性检测：研究表明，HEK293T和HeLa细胞在最大浓度400μg/ml下的细胞存活率分别为96.35 ± 0.16%和94.49 ± 0.05%（见图3）。因此，即使在最高测试浓度下，MLS提取物对这些细胞的毒性也较低（<5%），可以得出结论MLS提取物用于驱虫是安全的。

体外驱虫活性：研究发现，培养在MLS和ABZ中的A. galli线虫的运动能力下降，随后导致死亡（见表3和补充图S5）。然而，在对照组中，A. galli在0.9% PBS介质中37±1°C下存活了约82小时，之后才变得不动并死亡。对于ABZ和MLS处理的线虫，麻痹和死亡所需的时间具有剂量依赖性，并且与对照组相比具有高度显著性（p≤ 0.001）。在ABZ中，最低剂量0.05mg/mL时，麻痹和死亡时间分别为0.60 ± 0.31小时和0.60 ± 0.31小时；而在最高剂量100mg/mL时，分别为0.60 ± 0.31小时和0.60 ± 0.31小时，显示出最高的驱虫效果。在0.05 mg/mL剂量下，MLS导致麻痹和死亡的时间分别为28.22 ± 0.08小时和30.76 ± 0.12小时；在100mg/mL剂量下，分别为5.64 ± 0.65小时和7.96 ± 0.31小时，也显示出高度的效果，与参考药物相当。

表面地形观察：电子显微镜观察显示，未处理的A. galli具有明显的三角形口器，周围有三片明显的齿状唇，一片背侧唇和一对腹侧唇，前端具有光滑的角质层。唇部的唇乳突更为明显（图4A）。光滑的角质层表面特征是从头部区域到后部的连续横向条纹环状结构。这些条纹比深的横向沟槽（即切口）更为明显和发达，从而使身体呈现出分节的外观（图4B）。详细的角质层表面显示，环状结构进一步细分为中断的平行同心环，即亚环，这些亚环完全环绕着圆柱形的身体，除了最末端。雄性后部区域更为复杂和精细，具有略微膨胀且发育不良的尾翼和正常的泄殖孔突起。腹侧区域有两个明显的开口，即极端的肛门和其前方的预肛门吸盘（图4C）。此外，在尾部的腹侧，肛门两侧有许多类似结节的结构，即尾乳突，作为感觉器官（图4C）。雌性A. galli的后部区域在末端之前有一个明显的肛门开口，其顶端有一对乳突（图4D，E）。尾巴区域直线且末端圆钝，角质层没有条纹（图4F）。

用参考药物ABZ（100mg/mL）处理的线虫表现出角质层表面和口器的显著变形和紊乱。唇部看起来塌陷、松弛且高度折叠（图5A，B）；然而，与MLS处理的寄生虫相比，看起来更平滑、皱纹较少。环状结构和亚环都更明显可见（图5C，D）；但不规则性较少。雌性的后部区域看起来扁平且高度折叠，肛门开口变宽，背面和腹侧都有小凸起（图5E）。用ABZ处理的雌性线虫的尾部区域扁平且有许多褶皱（图5H，I）。

MLS对A. galli的体外影响：在100 mg/mL剂量下，MLS对线虫的细小表面形态显示出显著的影响。保护口器的三片唇和口腔腔塌陷且松弛，表面有明显的不规则皱纹（图6A，B）。由于严重收缩，角质层极度皱缩和剥落，形成了类似脑状的结构，唇乳突不再可见（图6B，C）。整个身体的角质层出现了短的纵向褶皱。角质层还显示出明显的紊乱和正常条纹模式的异常，以及身体表面的角质层剥落（图6D）。环状结构之间的深沟更深，环状结构和亚环看起来不规则，定义了表面的畸形（图6E）。雌性肛门附近的角质层肿胀且起皱（图6F）。雄性尾部的尾翼变形且粗糙，表面有许多褶皱和剥落的角质层（图6G）。SEM图像显示，用100mg/mL MLS处理的A. galli表现出严重的畸形，唇部和身体表面出现皱纹和塌陷：(A) 雌性前部；唇部变形、粗糙、有皱纹，并向外扩展，口腔突出；身体表面有许多纵向褶皱。(B) 雄性前部；唇部严重脱屑、变形、粗糙、萎缩。(C) 雄性唇部放大视图；表皮严重折叠，呈现类似脑状的结构。(D)、(E) 中间部分的表皮显示外层脱落，沟槽变宽且深；环纹和次环纹不规则。(F) 雌性肛门开口，表面粗糙且起皱。(G)、(H) 雄性后端和尾尖；扁平且萎缩，表面有侵蚀痕迹。(I) 雌性尾尖放大视图，显示表皮侵蚀和纵向褶皱。

组织学观察：在光学显微镜下观察A. galli的组织结构显示，该蠕虫的身体由表皮支撑。表皮是由多层蛋白质环组成的复杂结构，形成一个坚硬、致密的结构，这些环连续环绕着身体。表皮下是合胞体表皮（也称为皮下层），它向外部产生复杂的纵向肌肉层，内部则是结缔组织网。肌肉层也分为两部分：一部分是纤维状的、具有张力的部分，沿着表皮纵向分布；另一部分是颗粒状的、无张力的原生质部分，朝向身体中心。蠕虫的大腔被称为假体腔，其中包含肠道，这在切片中可以看到（图7、8）。肠道由单层上皮细胞组成，呈圆形三角形排列，在中心形成一个明显的放射状腔隙。此外，还有一条横向的纵向排泄管，从肌肉的原生质边缘延伸到假体腔。雌性和雄性的A. galli具有不同的生殖器官（图7、8）。

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图7. 成年雌性A. galli通过身体中部的组织切片。(A) 对照组；表皮（C）、肌肉层（ML）、围绕假体腔（P）的纵向排泄管（L），其中含有肠道上皮细胞（IE）和腔隙（IL），子宫（U）被子宫壁（UW）包围，带有腔隙（UL）和许多卵子（E），卵巢（O）带有生殖轴（R），输卵管（OD）带有腔隙（OvL）[10X]。(B) 100mg/mL ABZ处理后；表皮和肌肉层分解，肠道萎缩（I），输卵管变形[10X]。(C)、(D) 50 & 100 mg/mL MLS处理后；表皮和肌肉层分解分离，肠道和生殖器官萎缩变形，子宫受损溶解[10X]。(E) 对照组子宫；受精卵（FE），未受精卵（UE），由几丁质壳（CS）包裹的胚胎（EM）[40X]。(F) ABZ处理后的子宫[40X]。(G)、(H) 50 & 100 mg/mL MLS处理后的子宫；卵子数量减少，许多卵子死亡并脱落外壳（DE），子宫内部物质破裂（箭头所示）[40X]。

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图8. 成年雄性A. galli通过身体中部的组织切片。(A) 对照组；表皮（C）、肌肉层（ML）、围绕假体腔（P）的纵向排泄管（L），其中含有肠道上皮细胞（IE）和腔隙（IL），精囊（SV）含有精子（SC），圆形输精管（VD）和睾丸（T）[10X]。(B) 100mg/mL ABZ处理后；表皮和肌肉层分解，肠道变形（I），精囊和输精管延长[10X]。(C)、(D) 50 & 100 mg/mL MLS处理后；表皮和肌肉层分解分离，肠道变宽，生殖器官受损萎缩[10X]。(E) 对照组体壁；外层表皮（EP）、表皮、合胞体表皮（SE）、纤维层（FM）和原生质层（PM）可见[40X]。(F) 100 mg/mL ABZ处理后，表皮从肌肉层分离[40X]。(G)、(H) 50 & 100 mg/mL MLS处理后；表皮和肌肉层分解破裂（箭头所示）[40X]。

通常，在雌性蠕虫的切片研究中，肠道被一对卵巢、两个子宫和输卵管包围（图7A）。然而，这种雌雄同体的生殖系统具有高度扭曲和盘绕的生殖腺，导致除了子宫以外，还切断了卵巢和输卵管。在雌性A. galli的对照切片（图7A）中，观察到一个子宫，作为阴道后部两个生殖道的交汇处。子宫壁比其他生殖部分更厚、更密集，并含有大量的卵细胞，这些卵细胞被称为卵原细胞。卵子呈椭圆形或多面体形状，被坚硬的几丁质保护壳包裹，内含卵黄和胚胎（图7E）。卵巢呈实心状，直径较小，非管状，中心有一个称为生殖轴的细胞核。而输卵管与卵巢相似，但直径稍大，中央有小的腔隙，最大的直径是子宫。此外，尽管输卵管和子宫是空心的，但由于充满卵子且没有生殖轴，它们可能看起来是实心的（图7A）。雄性A. galli的生殖系统是线性的，由一个睾丸组成，通向输精管，一个精囊用于储存精子，以及一条狭窄的射精管，最终开口于泄殖腔。

用100mg/mL ABZ处理的雌性蠕虫表现出表皮分解，下层合胞体表皮严重受损，相关肌肉层也破裂（图7B）。肠道上皮细胞略微萎缩和收缩，而输卵管完全变形（图7B）。子宫壁保持完整，含有受精卵和未受精卵（图7F）。图7C显示，用50 mg/mL MLS处理的雌性A. galli切片显示肌肉层相互分离，肠道上皮壁完全分解，导致细胞扩散和收缩。卵巢和输卵管变形、萎缩，甚至生殖轴也破裂。由于肌肉壁的塌陷，子宫完全受损，卵子散布在整个假体腔中（图7C）。卵子数量大幅减少，同时看到许多死亡和脱落的外壳卵子（图7G）。用100mg/mL剂量处理的雌性蠕虫受到的损伤比用50mg/mL处理的更严重，表现为表皮完全分解，肌肉层受损；肠道腔隙收缩、肠道萎缩延长；卵巢和输卵管变形（图7D）。子宫变形、破裂，许多死亡和脱落的外壳卵子散布在体内腔中，甚至卵壳破裂，将内部物质排出假体腔（图7H）。

在雄性A. galli的对照切片（图8A）中，肠道被一个明显的圆形精囊和输精管包围，由于高度盘绕，可以看到多个睾丸。此外，精囊内含有精子，这些精子呈现为小颗粒状。图8E显示，体壁完整，表皮和纵向肌肉层均未受损。用100 mg/mL ABZ处理的雄性蠕虫表现出表皮脱屑，下层合胞体表皮严重受损，相关肌肉层破裂（图8B）。肠道、精囊和输精管似乎延长、破裂，导致非鞭毛型变形的精子细胞（图8B）。纵向肌肉层中的肌肉纤维彼此分离（图8F）。用50 mg和100 mg/mL MLS处理的雄性A. galli切片显示出最严重的组织学变化（图8C、D）。在50 mg/mL MLS处理的切片中，肠道腔隙变宽，上皮细胞分解（图8G），精囊和输精管受损，睾丸的上皮壁完全分解并从细胞核生殖轴分离。而在100 mg/mL MLS处理的切片中，表皮从合胞体表皮完全分解（图8H）。肌肉彼此分离，相关肌肉层破裂，肠道和生殖系统完全改变、萎缩，切片中可见明显畸形（图8D）。

讨论：本研究调查了一种先前未被充分利用的植物Meyna laxiflora Robyns的驱虫潜力，这种植物在印度曼尼普尔地区大量分布，因其显著的民族药用价值而具有深厚的文化意义。该植物提取物已被测试用于对抗最常见的家禽蠕虫。研究显示，MLS种子提取物对最常见的家禽蠕虫Ascaridia galli（Schrank, 1788）具有显著的体外驱虫效果。A. galli是最常影响本地鸡品种的寄生虫，持续引发蛔虫病（Shifaw等人，2021）。受感染的鸡表现出肠道内膜肿胀、出血点，以及淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的浸润（Levkut等人，2022）。对于这种居住在肠道内的蠕虫，肠道内膜作为通讯枢纽，导致鸡消化道的上皮细胞损伤，从而导致黏液分泌增加、上皮细胞脱落、黏液绒毛粘附、坏死和杯状细胞增生（Jerica等人，2024；Ritu等人，2024）。A. galli感染会干扰营养吸收，并对宿主的免疫系统产生关键影响，改变其对感染的反应（Das等人，2021）。在同一只Numida meleagris（盔头珍珠鸡）中同时感染Ascaridia galli和Eimeria tenella会导致严重的肠道损伤和营养吸收减少，从而导致肠炎、生长不良和更高的感染风险。这种复合感染增加了经济损失，强调了需要综合控制寄生虫的策略（Attia等人，2025）。虽然合成药物可用于针对急性感染的治疗，但植物化学物质可用于预防性寄生虫管理（Khalil等人，2025）。

当A. galli用甲醇提取物处理时，表现出麻痹状态（5.64 ± 0.65小时），最终死亡（7.96 ± 1.00小时），这与最高测试浓度100mg/mL的ABZ导致的麻痹（0.60 ± 0.31小时）和死亡（4.51 ± 0.37小时）相当。这表明MLS提取物和标准药物ABZ均以剂量和时间依赖的方式起作用，这与之前使用常见民族药用植物对A. galli进行的体外研究结果一致（Mubarokah等人，2019；Nghonjuyi等人，2020；Hazarika等人，2023；Mir等人，2024a，2024b；Tiuria等人，2024）。Areca catechu的水提取物引起A. galli的结构变化，导致其死亡（Mubarokah等人，2019）。Mimosa pudica的叶乙醇提取物和Carica papaya的种子提取物在喀麦隆的研究中发现可以降低粪便中每克的A. galli卵子数量，并影响受感染Kabir鸡的血液和脂肪水平（Nghonjuyi等人，2020）。常见的丁香Syzygium aromaticum的叶提取物在140mg/mL剂量下暴露3、6和9小时后杀死A. galli（Anggrahini等人，2021）。Nyctanthes arbor-tristis和Butea monosperma的叶提取物具有体内抗A. galli活性（Hazarika等人，2023）。Saussurea costus的粗甲醇提取物在100mg/mL剂量下暴露24小时后抑制了A. galli的运动能力（Mir等人，2024a）。Juglans regia L.的乙醇叶提取物在100 mg/mL剂量下暴露24小时后使成年A. galli的运动能力降低96.5%（Mir等人，2024b）。Tiuria等人（2024）报告称，在1000μg/mL剂量下，Phyllanthus niruri L、Andrographis paniculata和Curcuma xanthorrhiza Roxb的乙醇提取物减少了A. galli的运动能力。此外，生物活性成分如Andrographolide和5-Methoxybenzimidazole有助于破坏和脱落蠕虫的表皮层。Rasheed和Aljohani（2024）报告称， star anise精油中的anetholes是主要成分，该植物精油对A. galli具有剂量依赖性的效果。

在本研究中，MLS提取物含有多种具有驱虫潜力的植物化学物质，如生物碱、皂苷、黄酮类和萜类化合物，这些物质在较高浓度下会损伤A. galli的表皮完整性、生殖周期，并破坏其pH值平衡。与一些先前的研究类似，本文发现其中含有具有驱虫活性的次级代谢物，如酚类（生物碱和单宁）、萜类（苷类和皂苷）以及含氮代谢物（生物碱、释放氰化物的苷类和非蛋白质氨基酸），这些代谢物展示了多样的潜在作用机制和研究方向。这些代谢物的主要作用机制包括破坏黏多糖膜，从而影响虫子的运动能力；阻断虫子的产卵；以及损害虫子的角质层结构（Zaman等人，2020年）。在实际的线虫控制中，角质层通常是驱虫的重点。然而，这些代谢物对这些复杂细胞外结构的作用取决于其具体性质，因此不同种类线虫（包括幼虫和成虫）的形态结构存在差异（Tiuria等人，2024年）。一种特殊的胶原蛋白和不溶性蛋白质——角质素对角质层的组成和功能至关重要。角质层由三层主要结构构成：最外层的表皮含有不溶性蛋白质；中间的基质层进一步分为含有芳香氨基酸的纤维层和厚厚的白蛋白蛋白层；最后的纤维蛋白层类似于纤维蛋白或弹性蛋白，含有碳水化合物、脂质和酯酶催化剂（Betschart等人，2022年）。M. laxiflora Robyns的提取物能够破坏这些角质层结构。对MLS甲醇提取物的GCMS分析显示，其中含有大量非还原性甜味剂蜜三糖（51.88%），这种物质在昆虫学研究中常被用作标记物。有趣的是，在Corallopus epigaeus的乙酸乙酯提取物中检测到了n-十六烷酸（0.88%），这是一种已知具有显著体外驱虫活性的生物活性脂肪酸（Ishnava和Konar，2020年）。先前的研究已经证明多种脂肪酸（如十四烷酸、n-十六烷酸、十八烷酸和二十四烷酸）具有驱虫和减轻氧化应激的作用（Agim等人，2017年；Gideon，2015年；Khan等人，2024年）。十八烷酸2-羟基-1-(羟甲基)乙基酯（0.98%，也称为2-硬脂酰甘油）与n-十六烷酸一起表现出驱虫作用（Francis等人，2021年）。MLS提取物中的生物碱类物质，如1,2-辛二羧酸（2.50%）和1,6-二甲基-8-[羟甲基]-1,2,3,4-四氢喹啉（0.64%），也显著降低了A. galli的死亡率。正如Roy等人（2010年）和Badarina等人（2017年）所提到的，富含生物碱的植物可以通过作用于中枢神经系统来抑制虫子的糖分吸收，从而发挥强大的驱虫效果。此外，两种萜类衍生物——三氟乙酸、八氢-4-羟基-1,5-甲基-1H乙酸酯（1.93%）和环戊烷羧酸（1.93%）及其乙酸乙酯（1.93%）通过作用于角质层表面，破坏pH平衡导致虫体分解，这也与之前的研究结果一致（Zaman等人，2020年）。在雄性和雌性A. galli中，通过植物显微观察到的组织学变化证明了MLS提取物的驱虫效果。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，该植物提取物从虫子的口部到尾部整个角质层都引发了形态学改变，甚至最外层的表皮也发生了脱屑现象，这与Challam等人（2010年）的研究结果相似。接受ABZ处理的虫子也出现了类似的畸形和结构紊乱，这与Lalcchandama等人（2009年）的研究结果一致。Roy等人（2012年）也发现从Acasia oxyphylla中分离出的化合物F5-2d具有类似的体外驱虫效果。图8和图9表明，该提取物不仅影响外部层，还导致肠道和其他生殖器官的脱屑、变形和萎缩，甚至整个卵细胞也因子宫壁破裂而缩小和分解。这些结果与一些相关文献中关于A. galli受到植物提取物处理的报道具有相似性（Balqis等人，2017a, 2017b；Lalchhandama，2008年）。本研究的目的是提出使用M. laxiflora Robyns的甲醇提取物作为驱虫植物的替代控制策略，以应对Ascaridia galli的防控问题。为了降低广谱药物的抗药性，草药类驱虫产品在禽类寄生虫防治中的应用可能具有重要意义。然而，需要通过体内实验来验证M. laxiflora Robyns作为禽类感染A. galli的驱虫效果。

**结论**

本实验使用Meyna laxiflora Robyns的甲醇提取物对成年A. galli表现出显著的驱虫效果，且这种效果具有明显的剂量依赖性。MLS提取物引起了虫体全方位的形态学损伤，包括角质层和内部组织的变形、分解和脱屑，这些变化通过SEM和组织学观察得到了证实。这种结构损伤严重削弱了虫子的运动能力，最终导致其麻痹和死亡。因此，研究结果强调了该提取物在开发新型高效驱虫制剂方面的巨大潜力。未来，结合体内验证以及对M. laxiflora Robyns中活性植物化学物质的分离和鉴定，对于阐明该植物对抗寄生虫的具体药理机制以及克服现有驱虫药物的抗药性具有重要意义。

**作者贡献声明**

Thoudam Bishaya Devi：撰写 – 审稿与编辑、撰写原始稿件、数据可视化、验证、软件使用、资源管理、项目协调、方法设计、数据分析、数据整理、概念构思。
N. Mohilal：数据可视化、验证、监督、资金筹集、概念构思。
Chingakham Brajakishor Singh：数据可视化、验证、监督、资金筹集、概念构思。