建立并应用多重实时荧光定量PCR技术检测Tembusu病毒以及鹅星状病毒1型和2型基因型

《Poultry Science》：Establishment and application of multiplex real-time qPCR detection for Tembusu virus and goose astrovirus genotypes 1 and 2

肖兵金|李晓娟|贾明焕|傅成|潘涛|李炳新|曹楠|刘文军|田云波|卢守生|冯聪|廖明|傅新亮
中国广州中凯农业工程学院动物科学与技术学院

**摘要**
鹅星状病毒1型（GoAstV-1）、鹅星状病毒2型（GoAstV-2）和坦布苏病毒（TMUV）在鹅体内的同时感染和流行导致了鹅产业遭受了巨大的经济损失。因此，建立一种快速准确的诊断方法对于这些病毒至关重要。在本研究中，我们设计了针对GoAstV的Cap基因和TMUV的E基因的特异性引物，并开发了一种基于SYBR Green I的多重实时qPCR方法，用于同时检测GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV。结果表明，多重实时qPCR的标准曲线R2值分别为0.998、0.998和0.994。此外，GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV的检测限分别为1.08×10^2拷贝/μL、2.63×10^2拷贝/μL和3.07×10^2拷贝/μL。特异性测试结果显示，该多重实时qPCR系统对这些目标病原体具有高度特异性，未观察到与其他鹅源病毒（如新城疫病毒（NDV）、鹅呼肠孤病毒（GRV）、禽流感病毒（AIV）或鹅细小病毒（GPV）的交叉反应。此外，所建立的多重实时qPCR方法具有优异的重现性， intra-和inter-assay变异系数分别为0.23至0.91和0.71至1.75。本研究提供了一种快速高效、特异性强且灵敏度高的工具，有助于检测GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV，并有助于确定这些病毒在鹅体内的流行情况。

**引言**
自2016年11月以来，中国报告了一种由新型鹅星状病毒（GoAstV）引起的鹅内脏痛风爆发，给鹅产业带来了相当大的经济损失（Liu等人，2022年）。这种新型痛风爆发的特点是高发病率和死亡率、饲料转化率低以及肾脏和肝脏中的尿酸沉积，主要影响1至15日龄的鹅苗（An等人，2020年）。GoAstV是一种无包膜的单链RNA病毒，其基因组长度约为7,200个核苷酸，包含三个开放阅读框（ORF），即ORF1a、ORF1b和ORF2，以及一个短的5′非翻译区和一个3′非翻译区，还有一个多聚A尾（Xu等人，2023年）。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，其重叠区域含有保守序列，而ORF2编码与病毒形成相关的核衣壳蛋白。最近的研究进一步揭示了GoAstV的潜在垂直传播和跨物种传播途径，导致鸭子感染（Chen等人，2021年），反映了GoAstV具有多种传播途径和多种易感宿主的复杂流行情况。先前的研究报告称，中国鹅体内存在两种GoAstV基因型（GoAstV-1和GoAstV-2），其中GoAstV-2是主要基因型（Zhang等人，2018年；Wang等人，2021年；Wei等人，2024年）。然而，GoAstV-2的基因组仅与GoAstV-1有约58%的相似性，表明两者之间存在显著差异（Fu等人，2022年）。此外，已有报道显示临床样本中存在GoAstV-1与其他病原体的共感染（Liu等人，2020年；Zhang等人，2022年）。坦布苏病毒（TMUV）是另一种在鹅体内流行的重要病原体，属于黄病毒科和黄病毒属，会导致种鹅产蛋量突然下降和鹅苗出现神经症状（He等人，2017年；Zhu等人，2022年）。此外，TMUV具有广泛的宿主范围，能够感染多种鸟类，包括鸭子、鹅、鸡、麻雀和鸽子（Yu等人，2018年）。因此，迫切需要开发一种快速、灵敏且特异性的方法来检测GoAstV和TMUV。

目前，逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是一种可靠的定量工具，在临床实践中广泛用于病原体检测（Taylor等人，2019年）。此前已有几种GoAstV检测方法被报道，包括逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）、免疫层析条（ICS）检测和TaqMan探针-based qRT-qPCR（Ji等人，2020年；Yang等人，2021年；Li等人，2023年）。然而，尚未有同时检测GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV的多重RT-qPCR方法。本研究开发了一种高灵敏度、特异性强且可重复的多重RT-qPCR方法，有助于提高这些病毒在临床中的检测效率，并为研究这些病毒在鹅体内的流行情况提供了有效工具。

**材料与方法**
**病毒和临床样本**
GoAstV-2株GoAstV/Guangdong/QY1/2019（GenBank登录号ON049473）是从中国广东省患有痛风的鹅苗中分离得到的。GoAstV-1株AHDY（GenBank登录号MH4106）的衣壳（Cap）基因和TMUV株JS804（GenBank登录号JF895923）的包膜（E）基因被合成并用于构建模板质粒。禽流感病毒（AIV）、鹅细小病毒（GPV）、新城疫病毒（NDV）和鹅正呼肠孤病毒（GRV）保存在我们的实验室中，用于评估检测的特异性。
2023年1月至2025年1月期间，从中国广东和江苏不同地区的鹅场收集了113份具有临床特征的组织样本（包括肝脏、肾脏和脾脏样本）。所有样本均用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）匀浆至20%悬浮液（w/v），然后在4°C下以10,000 rpm/min离心10分钟。收集上清液用于RNA提取和进一步使用。

**基因组分析和引物设计**
使用MAFFT软件进行多序列比对，以识别已发表的GoAstV-1（n=5）和GoAstV-2（n=49）的Cap基因以及TMUV（n=41）的E基因中的保守区域。选择保守度超过95%的区域进行引物设计（图1）。使用Oligo 7.0软件设计GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV检测的特异性引物及重组质粒构建。本研究使用的引物列于表1中。所有引物均由BGI Biotech公司合成，并储存在-20°C直至使用。

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**图1.** 用于引物设计的GoAstV-1（A）和GoAstV-2（B）的Cap基因以及TMUV（C）的E基因的核苷酸同源性分析。

**表1.** 本研究中设计的引物序列。

| 引物名称 | 序列（5′–3′） | 目的 | 长度（bp） |
| --- | --- | --- | --- |
| GoAstV-1 SYBR-FTC | AAACTACACACCGAAACCC | GoAstV-1检测 | 79 |
| GoAstV-1 SYBR-RTG | TGTTATCCCTTGTGCAT | GoAstV-1检测 | 79 |
| GoAstV-2 SYBR-FAC | AGCCATACAACACTTAAACCC | GoAstV-2检测 | 104 |
| GoAstV-2 SYBR-FAG | CGCCATTCCTGAGTTCCGTT | TMUV检测 | 103 |
| TMUV SYBR-FAA | AGGAATGACCTACCCGATT | TMUV检测 | 103 |
| TMUV SYBR-RTA | CTCTGCATAAGACAATTCCAC | GoAstV-1-Cap FTG | 224 |
| GoAstV-1-Cap RCT | CTCTAGTACTTCTCGACATTAGTCACCTTGTCCAC | GoAstV-1/AHDY Cap基因重组质粒构建 | 224 |
| GoAstV-2-Cap | FACTCGACGAAGACTTGATGAATTCGCCACCATGGCAGACAGGGCG | GoAstV-2-Cap重组质粒构建 | 219 |
| GoAstV-2-Cap RC | ATGCTATGCATCAGCTGTCACTCATGTCCGC | TMUV-E FTTTGTTCGGAAAGGGGAGCATT | TMUV/JS804 E基因重组质粒构建 | 927 |

**病毒核酸提取和逆转录**
将-80°C保存的组织样本按1:10的比例加入磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在研钵中匀浆。经过多次冻融循环（3次）和10,000×g离心10分钟后，使用Viral RNA Kit（Omega Bio-Tek，Norcross，GA）从上清液中提取病毒RNA。根据制造商的说明，使用逆转录酶M-MLV（Takara，大连，中国）进行病毒RNA的逆转录，然后将cDNA储存在-20°C以供进一步使用。

**标准质粒生产**
使用表1中列出的引物通过PCR扩增GoAstV-1和GoAstV-2的Cap基因以及TMUV的E基因。PCR产物随后通过EZ-HIFI Seamless Cloning Kit（Genstar，北京）进行纯化，并克隆到pCMV-C-Flag质粒中。使用Plasmid Mini Kit（Omega Bio-Tek，Norcross，GA）提取重组质粒，使用NanoDrop ND-2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）测量质粒浓度。质粒拷贝数计算公式为：X拷贝/μL = [6.02×10^23（拷贝/摩尔）× RNA浓度（g/μL）× 基因的平均分子量（g/摩尔）× 模板长度]。质粒储存在-20°C以备后续使用。

**多重实时qPCR检测方法的优化**
使用ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）以标准重组质粒为模板开发多重qPCR检测方法。优化引物浓度和退火温度，以确保最低Ct值下的特异性和高荧光强度。根据不同条件下的检测结果，选择0.1 μM至1 μM的最佳浓度。评估了58°C至62°C之间的9个不同退火温度，间隔为0.5°C。根据测量结果选择最佳温度。

**标准曲线的建立**
将每个标准重组质粒连续稀释10倍，并使用优化的多重qPCR系统在1.0×10^1拷贝/μL至1.0×10^10拷贝/μL的浓度范围内进行扩增。根据Ct值和标准拷贝数的对数生成最终标准曲线。

**多重实时qPCR检测方法的特异性、灵敏度和重复性分析**
测试了TMUV、GoAstV-1、GoAstV-2以及其他常见病毒（包括GPV、NDV、GRV和AIV）的核酸，以评估优化程序和参数下的多重qPCR检测方法的特异性。使用GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。

**分析多重实时qPCR检测方法的灵敏度**
将上述制备的线性化标准质粒在无菌ddH2O中连续稀释10倍，用作多重qPCR扩增的模板。

**重复性测试**
使用稀释至10^2拷贝/μL、10^4拷贝/μL、10^6拷贝/μL和10^8拷贝/μL的GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV标准样本进行重复性测试。在不同时间点进行三次 intra-assay重复和三次 inter-assay重复。根据获得的Ct值计算平均值、标准偏差和变异系数（CV），以评估多重qPCR方法的重复性和稳定性。

**使用多重实时qPCR检测方法在临床样本中检测TMUV和GoAstV**
为了进一步验证该多重qPCR方法的临床意义，我们在2023年1月至2025年1月期间从中国广东和江苏不同地区的鹅场收集的113份临床样本（包括肝脏、肾脏和脾脏样本）中测试了该方法的检测能力。

**结果**
**多重实时qPCR检测方法的优化**
根据正交试验结果，0.2 μM的引物效率最高。多重实时荧光定量PCR的最佳总反应体积为20 μL，包括10 μL的2× RealStar Fast SYBR qPCR Mix（Takara，大连，中国）、GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV的上游和下游引物各0.4 μL、1 μL的质粒模板，剩余体积用ddH2O补足至20 μL。反应条件包括95°C下的初始变性步骤10分钟，随后是40个扩增循环，每个循环包括95°C下的变性1秒和60°C下的退火60秒，最后在4°C下结束。

**标准曲线的建立**
使用分光光度计测量重组质粒的浓度，计算每种病毒质粒的拷贝数：GoAstV-1为1.08×10^10拷贝/μL，GoAstV-2为2.63×10^10拷贝/μL，TMUV为3.07×10^11拷贝/μL。根据标准质粒拷贝数的对数和测量的Ct值构建标准曲线。所有标准曲线的横坐标为拷贝数的对数，纵坐标为Ct值。相关系数（R2）分别为0.998（GoAstV-1）、0.998（GoAstV-2）和0.994（TMUV）。GoAstV-1的标准曲线为y = -3.521x + 44.36（图2A），GoAstV-2的标准曲线为y = -3.551x + 40.48（图2B），TMUV的标准曲线为y = -3.014x + 38.29（图2C）。所有标准曲线均显示出良好的相关系数和扩增效果，循环阈值（Ct）与质粒拷贝数的对数之间具有良好的线性关系。

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**图2.** 多重实时qPCR检测的标准曲线。（A）GoAstV-1的标准曲线。（B）GoAstV-2的标准曲线。（C）TMUV的标准曲线。

**多重实时qPCR检测方法的灵敏度**
将GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV模板按相等比例混合，并通过优化的多重实时qPCR检测方法进行扩增，以评估该方法的灵敏度。如图3所示，GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV的最小检测灵敏度分别为1.08×10^2拷贝/μL、2.63×10^2拷贝/μL和3.07×10^2拷贝/μL。这些结果表明，所建立的多重实时qPCR方法对这些三种病原体具有很高的灵敏度（图3）。下载：下载高分辨率图像（716KB）下载：下载全尺寸图像图3. 多重实时qPCR检测的灵敏度。(A) GoAstV-1在浓度范围为1.08×10^9至1.08×10^2拷贝/μL时的灵敏度。(B) GoAstV-2在浓度范围为2.63×10^9至2.63×10^2拷贝/μL时的灵敏度。(C) TMUV在浓度范围为3.07×10^10至3.07×10^2拷贝/μL时的灵敏度。

多重实时qPCR检测的特异性
我们实验室中的GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV的核酸被用作阳性对照，反应中获得了强烈的扩增信号，qPCR产物的熔解温度（Tm）分别为79.2°C、80°C和81°C。然而，其他常见的鹅病毒，包括GPV、NDV、GRV和AIV，没有特异性扩增信号，且Ct值大于32（图4）。这些结果表明，本研究中建立的多重实时qPCR方法对GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV具有高度特异性，不会与其他鹅源病毒发生交叉反应。下载：下载高分辨率图像（356KB）下载：下载全尺寸图像图4. 多重实时qPCR方法检测GoAstV-2（标记为1）、GoAstV-1（标记为2）和TMUV（标记为3）的特异性分析；4至7表示NDV、GPV、GRV和AIV。

多重实时qPCR检测的重现性
进一步使用四种不同稀释度的GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV标准质粒来研究所建立的多重实时qPCR方法的重现性。如表2所示，GoAstV-1的扩增在实验内和实验间的变异系数（CVs）分别为0.39%至0.84%和0.71%至1.05%。GoAstV-2的扩增在实验内和实验间的CVs分别为0.23%至0.91%和0.96%至1.75%。TMUV的扩增在实验内和实验间的CVs分别为0.42%至0.87%和0.85%至1.44%。这些结果表明，本研究中建立的多重实时qPCR方法既可重复又可靠。（表3）表2. 多重实时qPCR检测的重现性分析。

质粒
浓度（拷贝/μL）
实验内Ct值
实验间Ct值
x?
CV(%)
x?
CV(%)
GoAstV-1
1.08×10^2
29.5
2
0.12
0.84
29.85
0.56
0.92
1.08×10^4
25.68
0.22
0.76
26.23
0.30
1.03
1.08×10^6
21.53
0.09
0.39
21.90
0.49
1.05
1.08×10^8
16.01
0.06
0.42
17.00
0.12
0.71
NC
ND
ND
ND
ND
ND
ND
GoAstV-2
2.63×10^2
28.89
0.18
0.91
29.16
0.37
1.35
2.63×10^4
24.79
0.08
0.35
25.23
0.44
1.75
2.63×10^6
18.08
0.04
0.23
18.21
0.17
0.96
2.63×10^8
10.36
0.09
0.88
11.18
0.16
1.49
NC
ND
ND
ND
ND
ND
ND
TMUV
3.07×10^2
29.51
0.19
0.42
29.14
0.24
0.85
3.07×10^4
25.48
0.11
0.46
25.26
0.22
0.90
3.07×10^6
18.82
0.01
0.58
18.82
0.39
1.07
3.07×10^8
12.03
0.10
0.87
12.21
0.17
1.44
NC
ND
ND
ND
ND
ND
ND
注：NC表示阴性对照；ND表示未检测到。

表3. 多重qPCR检测与常规PCR检测的临床样本比较
病毒
临床样本数量
阳性率
qPCR
常规PCR
GoAstV-1
113
16.8% (19/113)
9.7% (11/113)
GoAstV-2
113
67.3% (76/113)
48.7% (55/113)
TMUV
113
10.6% (12/113)
6.2% (7/113)
GoAstV-1与GoAstV-2共感染
113
7.1% (8/113)
(3/113)
GoAstV与TMUV共感染
113
00

临床样本应用与常规PCR的比较
为了进一步验证这种多重qPCR检测的临床潜力，我们使用从鹅场收集的113份临床样本（包括来自肾脏、肝脏和脾脏的样本）进行了测试，并将结果与常规PCR的结果进行了比较。使用所建立的多重qPCR检测方法，GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV的阳性率分别为16.8%（19/113）、67.3%（76/113）和10.6%（12/113）。GoAstV-1和GoAstV-2的共感染率为7.1%（8/113），未检测到GoAstV与TMUV的共感染。

讨论
目前GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV的流行已经蔓延到中国的大多数省份，并且没有下降的迹象（Liu等人，2020；Fu等人，2022）。尽管某些临床症状，如GoAstV感染引起的关节肿胀和尿酸沉积或TMUV引起的神经系统疾病，可以作为初步诊断的可靠指标（Liu等人，2022；Cheng等人，2024；Ren等人，2025），但通过临床观察和病理检查进行准确鉴定仍然具有挑战性。因此，建立针对TMUV和不同GoAstV基因型的多重检测系统对于家禽行业的日常病原体监测将非常有价值。到目前为止，已经开发了几种检测这些病毒的方法，包括常规PCR、环介导等温扩增（LAMP）和胶体金试纸条（Ji等人，2020；Yang等人，2021；Li等人，2023；Ren等人，2023）。然而，这些方法通常劳动密集且耗时，并且缺乏准确的定量和高灵敏度。相比之下，qPCR具有高特异性、灵敏度、重现性和效率，同时能够在单次反应中检测多种病原体；因此，它已被广泛用于基因检测（Taylor等人，2019）。在本研究中，我们分析了最近发表的TMUV和GoAstV的基因组。结果与先前的报告高度一致，表明这两种病毒都存在多个保守区域和基因组稳定性（Chen等人，2020；Zhu等人，2022；Cheng等人，2024）。此外，序列比较显示TMUV和GoAstV之间的相似性较低，表明分子检测方法可以有效区分这些病原体。基于TMUV的保守E基因和GoAstV的Cap基因，我们设计了三对特异性引物并优化了反应条件，建立了一种基于SYBR Green I的多重qPCR检测方法，用于同时检测TMUV、GoAstV-1和GoAstV-2。该方法的最小检测限分别为GoAstV-1为1.08×10^2拷贝/μL、GoAstV-2为2.63×10^2拷贝/μL和TMUV为3.07×10^2拷贝/μL。此外，该检测方法对常见的鹅源病毒如AIV、NDV、GRV和GPV具有高特异性，并且根据实验内和实验间的CV值表现出优异的重现性。目前，已经开发了多种检测这些病毒的方法。与这些现有方法相比，本研究中建立的多重实时qPCR检测方法在实际应用中显示出显著潜力。例如，与我们的方法相比，新型多酶等温快速扩增（MIRA）和侧向流动试纸条（LFD）联合检测GoAstV-2的方法（Zhu等人，2024）虽然灵敏度稍高，但无法提供准确的定量结果。此外，结果的视觉解释可能引入主观性。另外，间接ELISA用于检测鹅星状病毒1型和2型的抗体无法在单次反应系统中同时检测两种基因型（Zhang等人，2023）。此外，由于它主要针对宿主产生的抗体，这种方法本质上存在延迟，不适合早期诊断。此外，与现有的GoAstV-2和TMUV检测方法（Li等人，2023）相比，我们的方法保持了相当的灵敏度，同时具有成本效益和操作简便性。总体而言，我们报告了第一个具有高灵敏度和特异性的GoAstV-1、GoAstV-2和TMUV多重检测系统。该检测方法为研究家禽行业中TMUV和不同GoAstV基因型感染的分子流行病学提供了有用的工具，并具有广泛的应用前景。

作者贡献声明
Jin Shaobing：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、项目管理、方法学、调查、数据管理。
Li Xiaojuan：项目管理、方法学、调查、数据管理。
Jia Minghuan：软件、项目管理、方法学、调查、正式分析。
Fu Cheng：撰写 – 审稿与编辑、软件、方法学、调查。
Tao Pan：撰写 – 审稿与编辑、软件、方法学、调查。
Li Bingxin：监督、软件、方法学。
Cao Nan：监督、软件、方法学。
Liu Wenjun：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学、调查。
Tian Yunbo：撰写 – 审稿与编辑、监督。
Lu Shousheng：监督、资源、调查。
Cong Feng：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件。
Liao Ming：撰写 – 审稿与编辑、监督。
Fu Xinliang：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、项目管理、资金获取。