基于咪唑的化学传感器用于检测Ag+离子：抗菌活性、密度泛函理论（DFT）分析及分子对接建模

《Results in Chemistry》：Imidazole-based chemosensor for the detection of ag+ ions: Antimicrobial activity, DFT insight, and molecular docking modeling

　　穆罕默德·古达尔齐（Mohammad Goodarzi）| 戈德西·穆罕默迪·齐亚拉尼（Ghodsi Mohammadi Ziarani）| 扎赫拉·帕纳汉德（Zahra Panahande）| 索马耶·雷伊西（Somayeh Reiisi）| 梅赫兰·费伊齐-德赫纳耶比（Mehran Feizi-Dehnayebi）
伊朗德黑兰阿尔扎赫拉大学（Alzahra University）化学系有机化学专业

**摘要**
由于咪唑结构中含有氮原子，它可以与金属离子形成稳定的复合物，因此成为设计选择性化学传感器的高度合适的配体。此外，咪唑传感器通常对目标离子表现出高灵敏度和良好的选择性。本文制备了一种基于咪唑的化学传感器，并研究了其光致发光特性。为此，将2-甲基咪唑硝化生成2-甲基-4(5)-硝基咪唑，并在多种金属离子存在下对其荧光活性进行了研究。结果表明，该化合物能够以高选择性检测银离子（Ag+），检测限（LOD）约为2.38 × 10^-7 M。根据Job图测试的结果，配体与Ag+离子的化学计量比为1:1。密度泛函理论（DFT）计算确定N3原子是Ag+离子的优先结合位点，这一结论得到了分子电势（MEP）分析和优化几何结构的支持。进一步的研究表明，该化合物具有对抗革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抗菌活性，尤其是对大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌效果显著（最小抑菌浓度MIC < 1 mg/mL）。细胞毒性实验显示，在浓度低于256 μg/mL时，该化合物对正常人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的毒性极低，表明其具有良好的安全性。与大肠杆菌蛋白的分子对接分析显示，化合物2具有很强的结合亲和力（-6.05 kcal/mol），进一步证实了其抗菌潜力。综上所述，化合物2作为一种有前景的抗菌剂，具有进一步开发的潜力。

**1. 引言**
咪唑及其取代形式是一类非常重要的杂环结构，在天然产物、药物化学和合成化学活动中得到广泛应用[1]。这些稳定的五元环由于其两性特性，既可以作为碱、酸，也可以作为中性有机分子。咪唑骨架具有响应性和适应性，能够适应多种化学环境，并因其易于质子转移、显著的极性、多种弱相互作用的形成以及多个结合位点的存在而成为生物分子中的有用成分[2]。咪唑核心骨架是许多已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物类别的结构基础。它还存在于多种重要天然物质中，如生物素、组胺、组氨酸、某些生物碱、嘌呤以及基于核酸的结构（如DNA）[3][4]。咪唑衍生物具有广泛的药理作用，包括抗菌[5]、抗结核[6]、抗氧化[7]、抗真菌[8]、抗癌[9]、抗炎[10]和抗疟疾[11]等。总体而言，咪唑环是一种由三个碳原子、四个氢原子和两个氮原子组成的五元杂芳香结构，由于其独特的环排列方式，同时具有缺电子和富电子的特性。这种有趣的二元性源于其两个N2原子：一个作为电子供体，另一个作为电子受体（图1）[12][13][14]。因此，从电子学角度来看，它们具有不同的性质，并在制备深蓝色发光体（具有轻微的分子内电荷转移[15]）、发光[16]、非线性光学[17]、磷光[18]、荧光[19][20]和光致变色[21]等方面有广泛的应用。这些特性使其在工业和学术界受到了广泛关注。

**2. 材料与方法**
所有使用的试剂和溶剂均为商业级高质量产品。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）数据是通过RAY-LEIGH WQF-510 A型FT-IR光谱仪在400–4000 cm^-1范围内获得的。荧光响应数据记录在荧光分光光度计（Cary Eclipse）上。

**2.1. 实验部分**
**2.1.1. 化合物2的制备**
向冰浴中加入2 H2O（1 mL）和浓H2SO4溶液（0.4 mL，7 mmol），然后加入2-甲基咪唑（0.164 g，2 mmol），搅拌至温度升至100 °C。接着逐渐加入NaNO3（0.4 g，4 mmol），继续搅拌3小时直至形成透明黄色溶液。将此溶液倒入装有碎冰的烧瓶中，用NH3溶液（1 mL）调节pH至8，形成白色沉淀，过滤后溶解于H2O（6 mL）中，再通过布滤器过滤。冷却至25 °C后，溶液中形成白色晶体，过滤、用蒸馏水洗涤并干燥。
**2-甲基-4(5)-硝基咪唑**：熔点= 249–252 °C；FT-IR（KBr）谱线：3442, 3161, 3043, 2898, 1572, 1537, 1453, 1289, 1243, 1103, 1026, 1003, 952, 876, 827, 752, 701, 673, 604, 442；1H NMR（400 MHz，DMSO）：δ(ppm)：12.95 (s, 1H, NH环)，8.22 (s, 2-甲基咪唑的C4环)，3.36 (H2O)，2.52 (DMSO)，2.33 (s, CH3)；13C NMR（400 MHz，DMSO）：δ(ppm)：149.46 (C5环)，147.36 (C2环)，121.7 (C4环)，42 (DMSO)，16.41 (CH3)。

**2.2. 抗菌活性**
采用Kade?ábková等人[38]描述的方法的改良版本，通过肉汤稀释试验评估了化合物2对两种革兰氏阳性细菌（枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus）以及两种革兰氏阴性菌株（大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）的最小抑菌浓度（MIC）。每个试管含有5 mL细菌悬液（4–5 Log CFU/mL），培养基为双倍浓度的Mueller–Hinton肉汤。将细菌悬液与化合物2或无菌去离子水混合至总体积为10 mL，化合物2的最终浓度在100–2000 μg/mL之间。设置适当的对照组：阳性对照为不含化合物2的培养基中的细菌接种物；阴性对照为含有化合物2但不含细菌接种物的培养基；空白对照为仅含MHB的试管。接种后，将试管在37 °C下孵育24小时，通过观察浊度来确定MIC值。每个实验重复三次以确保结果的可重复性。MIC定义为完全阻止试管中细菌生长的最低化合物2浓度。

**2.2.1.2. 细胞活力评估**
使用MTT试验评估化合物2对正常人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞毒性。细胞系购自伊朗生物资源中心（Iran）。细胞在含有10% FBS（BioIdea）和1%抗生素溶液（Gibco）的RPMI-1640培养基（Gibco, USA）中培养，并在含有5% CO2的湿润环境中孵育以促进细胞增殖。将8000个细胞接种到96孔板的每个孔中，在37 °C下孵育24小时以促进细胞贴壁。随后向孔中加入不同浓度的化合物2（范围0–1024 μg/mL），处理24和48小时后测量细胞活力。实验重复三次以确保一致性。细胞活力计算公式为：
**存活细胞百分比 = （处理样本的平均吸光度 / 对照样本的平均吸光度）× 100**

**2.3. 密度泛函理论（DFT）分析**
使用GaussView 6.0和Gaussian 09 W软件[39]进行DFT计算，预测Ag+离子与化合物2之间的相互作用机制。在这些计算中，对Ag+离子使用LANL2DZ基组，对其他原子（H、N、O和C）使用6-311 g (d,p)基组。通过分析分子电势（MEP）图谱确定可能参与离子相互作用的化合物活性位点。此外，还通过分析HOMO和LUMO轨道评估了化合物的稳定性和化学反应性。

**2.4. 分子对接建模**
为了评估化合物2的抗菌潜力，使用AutoDock 4.2[40]和AutoDock Tools 1.5.6[41]进行了分子对接模拟，评估了其与大肠杆菌的结合自由能和相互作用模式。大肠杆菌的晶体结构（PDB ID: 2VF5）来自PDB（https://www.rcsb.org/）。选择PDB ID: 2VF5是因为它代表了一种分辨率较高的大肠杆菌蛋白结构，常用于抗菌对接研究。该蛋白在细菌存活和代谢调节中起关键作用，是评估抗菌剂的生物学相关靶点。从蛋白结构中移除了额外的水分子和配体。在蛋白活性位点周围设置了一个尺寸为88 × 88 × 80 ?、间距为0.375 ?的网格框以进行对接。Lamarckian遗传算法（LGA）参数根据先前文献[42]进行设置。使用Chimera软件识别化合物与2VF5靶点的最佳结合构象，并通过Discovery Studio Visualizer 4.1进一步分析。

**3. 结果与讨论**
**3.1. 化合物2的合成**
在严格控制温度下，使用H2SO4和NaNO3对2-甲基咪唑（1）进行硝化反应，纯化后得到白色晶体。通过熔点测定、FT-IR和NMR光谱对其进行了全面表征（图2）。

**3.2. Ag+的检测**
研究了2-甲基-4(5)-硝基咪唑（10^-4 M，2.5 mL）在H2O中的传感活性，激发波长为355 nm，同时存在多种阳离子（Cr3+、Al3+、Cd2+、Mn2+、Pb2+、Mg2+、Co2+、Hg2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Cu2+、Ag+、K+和Na+，浓度为200 μL，10^-2 M）。加入200 μL阳离子后，当加入Ag+时，在388 nm波长下荧光强度增加（图1A）。**化学传感器2的荧光响应**（2.5 mL，10^-4 M水溶液）在各种金属离子（200 μL，10^-2 M）存在下的情况（λex = 355 nm，λem = 388 nm），(B) 化合物2的选择性测试（2.5 mL，10^-4 M H2O溶液）在加入各种阳离子（200 μL，10^-2 M）后的情况（λex = 355 nm，λem = 388 nm），(C) 在加入不同浓度Ag+离子（200 μL，10^-2 M）后化合物2的荧光响应（λex = 355 nm，λem = 388 nm），(D) 配体2和Ag+离子的Job图，(E)。配体（a）和配体+Ag+（b）的红外光谱。

**3.2.1 竞争性测试**
荧光选择性测试对于检测Ag+非常重要，因为它确保设计的传感器仅对Ag+产生响应，而不受样品中其他离子的影响。选择性测试是在355 nm的激发波长下进行的。在本研究中，将Ag+离子和每种干扰阳离子加入到化合物2的水溶液中。根据图1B所示的结果，化合物2能够选择性地检测Ag+离子，并增加所有金属离子的荧光发射强度。

**3.2.2 滴定测试和LOD计算**
为了更好地了解检测限并研究Ag+离子浓度对化学传感器发射强度的影响，在355 nm的激发波长下进行了滴定测试。根据图1c的结果，随着Ag+浓度的增加（从1 μL到200 μL），荧光发射强度也随之增加。此外，图1C（插图）展示了化学传感器的荧光发射强度与不同Ag+离子浓度之间的线性关系。进一步使用公式DL = KSd/m（K：标准偏差，Sd：空白值的标准差，m：吸收强度的斜率）[43]来估计化学传感器的检测限，得到的结果为2.38 × 10^-7 M。

**3.2.3 Ag+离子的Job图测试**
为了计算配体2和Ag+离子之间的化学计量比，进行了Job图测试。根据测试结果，得到了1:1的比率（图1d）。

**3.2.4 红外光谱比较**
为了阐明化学传感器与Ag+离子之间的作用机制，进行了离子测试。在光谱b中，吸收带的强度降低并发生了变化（图1E）。图1E的插图展示了这种作用机制。

**3.2.5 实际样品测试**
为了评估所提出的荧光化学传感器2在环境分析中的实际应用性和可靠性，使用真实水样对其性能进行了验证。选择了井水和自来水作为代表性的环境基质，并从Alzahra大学采集了样品。样品收集在用去离子水冲洗过的干净聚乙烯容器中，以避免任何外部污染。分析前，所有水样都通过0.45 μm膜过滤器过滤，以去除可能干扰荧光测量的悬浮固体和颗粒物。过滤后的样品在4°C下储存，并直接进行分析，无需任何额外的化学预处理或酸化。在测量前，让样品达到室温并轻轻混合以确保均匀性。为了验证传感方法的分析性能，向水样中添加了已知浓度的Ag+离子，并记录了相应的荧光响应。分析结果总结在表1中，显示出优异的准确性和重复性。井水的回收率范围为97.81%至103.50%，而自来水的回收率在97.12%至102.31%之间，证实了该方法的高可靠性。重要的是，井水和自来水中共存的常见离子和基质成分并未显著影响Ag+离子的检测，表明该化学传感器具有很强的选择性。这些发现清楚地表明，开发的荧光传感平台能够准确量化复杂实际水样中的Ag+离子。因此，化学传感器2在真实环境样品中的成功应用及其高回收率，证实了其适用于实际环境监测和常规水分析。

**表1. 实际样品中的Ag+检测**
| 样品 | 加入的Ag+浓度（μM） | 检测到的Ag+浓度（μM） | 回收率（%） |
| --- | --- | --- | --- |
| 井水 | 88.28 | 103.50 | 97.81 |
| 井水 | 87.77 | 97.12 | 99.41 |
| 井水 | 121 | 161 | 97.81 |
| 自来水 | 87.77 | 121 | 99.41 |
| 自来水 | 161 | 163 | 102.31 |

**3.2.7 化学传感器的比较**
合成的化学传感器2与其他荧光化学传感器在检测Ag+离子方面进行了比较（表2）。观察到该传感器可以在绿色溶剂H2O中检测Ag+离子，并且其检测限比其他传感器更可接受。

**表2. 化学传感器2与其他荧光化学传感器的比较**
| 结构 | 溶剂 | LOD | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- |
| DMF/H2O（9:1, V/V） | 1.99 × 10^-5 M | [44] |
| DMSO | 3.82 × 10^-6 M | [45] |
| MeOH/H2O（1:1, V/V） | 8.54 × 10^-6 M | [46] |
| MeCN/H2O（1:1, V/V） | 6.20 × 10^-6 M | [47] |
| H2O | 2.38 × 10^-7 M | 本工作 |

**3.3 抗微生物活性**
评估了化合物2对一系列细菌菌株的抗菌活性，包括两种革兰氏阳性和两种革兰氏阴性菌种。计算了MIC值以评估该化合物抑制细菌生长的能力。如图2a所示，革兰氏阳性菌的MIC值为1 mg/mL，而革兰氏阴性菌的MIC值低于1 mg/mL，表明其对后者具有更强的抑制作用。在测试的细菌菌株中，大肠杆菌对化合物2表现出最高的敏感性，表明其对这种革兰氏阴性菌具有显著的抗菌效果。相比之下，枯草芽孢杆菌表现出部分抗性，需要更高浓度的化合物才能有效抑制。这种敏感性差异可能归因于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌之间细胞壁结构和通透性的差异，这些差异影响了抗菌剂的吸收和效果。进一步研究化合物2的作用机制，包括其与细菌膜或酶途径的潜在相互作用，可以提供对其抗菌机制的更深入理解。

**3.3.1 细胞毒性评估**
使用形态学评估和比色MTT活力测定法评估了化合物2的细胞毒性潜力。在暴露24小时和48小时后检查了细胞形态，如图2b所示。在低于256 μg/mL的浓度下，化合物2表现出最小的细胞毒性效应，细胞保持正常形态，活力约为80%，表明在较低剂量下具有良好的生物相容性。在较高浓度下，观察到细胞活力随剂量增加而降低。在256 μg/mL以上，细胞活力明显下降；在最高测试浓度（1024 μg/mL）下，48小时后的细胞活力降至约55%（图2c）。这些结果表明，细胞毒性随浓度逐渐增加，但在中等剂量下没有突然的毒性。化合物2的IC50值是根据MTT测定法在48小时培养后获得的剂量-响应曲线计算得出的，确定为约1024 μg/mL，证实了化合物2对正常内皮细胞的低毒性。这一相对较高的IC50值表明其具有良好的安全边际。因此，这些发现表明化合物2在生物学相关浓度下具有可接受的生物相容性，支持其作为抗菌剂的进一步开发潜力。

**图2. 条形图显示了化合物2对测试细菌菌株的MIC值（a）。**

**3.4 DFT机制**
在气相中进行了基态DFT计算。使用GaussView 6.0构建了化合物2的初始分子结构，随后使用Gaussian 09 W软件进行了基础计算。通过DFT方法优化了化合物2及其Ag+复合物的基态几何结构。优化后的结构仅显示正的振动频率，证实达到了真正的能量最小值。通过DFT分析，确定了Ag+离子在化合物2上的精确结合位点。此外，通过检查MEP图以及各种优化配置的总能量，获得了有关化合物2框架上最有利Ag+结合位点的宝贵信息。MEP表面可用于预测化合物2上易受亲电和亲核攻击的位点。这些突出区域有助于确定参与生物活性、催化功能、氢键形成和离子相互作用的区域。MEP可视化使用从红色到蓝色的颜色渐变：蓝色区域表示具有正静电势的亲核位点（电子密度较低的区域），而红色区域对应于具有负静电势的亲电位点（电子密度较高的区域）[48]。化合物2的MEP表面使用DFT方法生成，结果如图3a所示。在化合物2的MEP图中，观察到N2连接的氢原子周围具有正静电势。这些区域表明可能与受体大分子形成配位键，从而增强化合物的生物活性。此外，电子密度较高的区域位于O1、O2和N3原子周围。这些区域显示出负静电势，有利于与亲电物种的相互作用。因此，这些红色区域表明与带正电的物种（如Ag+）的结合亲和力更强。

**图3. 从DFT计算生成的化合物2的MEP图（a）和化合物2+Ag+的优化几何结构（b和c）**
基于MEP表示，发现O1、O2和N3原子周围有明显的红色区域，这些区域被认为是Ag+离子放置的最有利位置。因此，我们将Ag+离子放置在化合物2结构的不同位置，并进行了几何优化。DFT计算显示，Ag+离子位于N3原子附近，能量为-616.76 Hartree的2+Ag+结构比其他配置更稳定。这表明N3原子附近是最有利的Ag+离子结合位点。化合物2和2+Ag+的优化结构分别如图3(b)和(c)所示。

**3.4 分子对接建模**
鉴于化合物2在体外研究中表现出的强抗菌活性，我们使用对接建模来验证这些结果。该方法使我们能够验证该化合物的生物活性并识别其结合位点内的关键相互作用。使用分子对接研究针对大肠杆菌调查了化合物2的抗菌潜力。探索了十种不同的结合构象，每种构象都基于其结合自由能进行评估，以阐明其与细菌蛋白靶标的相互作用性质和强度。值得注意的是，化合物2表现出-6.05 kcal/mol的结合亲和力，表明其在蛋白活性位点内的相互作用强烈且有利。这些发现支持化合物2对大肠杆菌的抗菌效果。图5提供了对接结果的全面视觉表示，包括配体-蛋白复合物的详细三维和二维相互作用图。进一步分析对接结果强调了范德华力、疏水相互作用和氢键在稳定配体在活性位点中的关键作用，突出了结合机制的多方面性质。化合物2与关键残基形成了相互作用网络，与LYS 487和ALA 496建立了两个氢键。此外，它还与ALA 496、LEU 480、LEU 484和ALA 483发生了五次疏水相互作用，这些相互作用有助于其结构稳定性。化合物还通过三个范德华力与ALA 494、GLU 495和ASN 305相互作用，进一步增强了其结合亲和力和特异性。这些多样化的相互作用类型共同提高了化合物的整体分子参与度。对接协议通过重新对接程序进行了验证。两种构象之间的均方根偏差（RMSD）计算为0.66 ?，表明它们非常吻合，从而证实了对接协议的可靠性和准确性。

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图5. 化合物2与大肠杆菌的对接示意图

化合物2的抗菌活性可以通过已知的基于咪唑的支架的多方面机制来解释，这类支架可以通过干扰微生物膜、抑制关键酶途径以及破坏氧化还原平衡来影响微生物的生存[51][52][53][54]。据报道，在细菌中，咪唑衍生物会损害膜完整性并抑制黄素血红蛋白介导的一氧化氮解毒作用，从而增加细菌对氧化应激和亚硝化应激的敏感性[54]。在本研究中，分子对接进一步支持了基于靶点的机制，化合物2表现出对大肠杆菌蛋白（PDB ID：2VF5）的良好结合亲和力，这种亲和力通过与LYS487和ALA496的氢键以及疏水力和范德华力的相互作用得以稳定。这些相互作用表明，除了可能的膜相关效应外，化合物2还可能通过抑制细菌的关键蛋白来发挥抗菌活性，为观察到的实验抗菌活性提供了合理的机制基础。

4. 结论

总之，成功合成了一种基于咪唑的荧光化学传感器2-甲基-4(5)-硝基咪唑，并对其金属离子传感和生物活性进行了研究。该化学传感器在纯水介质中对Ag+离子表现出高选择性和敏感性，检测限低至2.38×10^-7 M，并且具有明确的1:1结合化学计量比。重要的是，该传感性能在真实水样中得到了验证，实现了优异的回收率（97–104%），且没有显著的基质干扰，证明了该传感器在环境监测和常规水分析中的实际应用价值。从机制角度来看，密度泛函理论（DFT）计算显示Ag+与咪唑环的N3原子配位，这种配位增强了配体的电子反应性。除了传感功能外，化合物2还显示出显著的抗菌活性，特别是对革兰氏阴性菌如大肠杆菌，这得到了低MIC值和有利分子对接相互作用的支持。该化合物对正常HUVEC细胞的细胞毒性较低，IC50值较高，表明在生物学相关浓度下具有良好的安全性。这些发现表明该化合物具有作为化学传感器和生物活性剂的双重功能潜力。尽管结果令人鼓舞，但仍需承认一些局限性。目前的传感研究是在受控实验室条件下进行的，尚未评估其长期稳定性和可回收性。此外，虽然对接研究支持了抗菌发现，但还需要进行体内生物学评估和机制研究以完全确定该化合物的治疗相关性。未来的工作将致力于改进结构设计，以进一步降低检测限，扩大可检测金属离子的范围，并开发便携式或固态传感平台以用于现场应用。此外，还将进行详细的生物学研究以进一步探索这类化合物的抗菌潜力。总体而言，这项研究表明2-甲基-4(5)-硝基咪唑是一种多功能且有前景的环境传感和抗菌研究候选物，为这两个领域的未来发展提供了有价值的框架。

CRediT作者贡献声明：
Mohammad Goodarzi：撰写——原始草稿、验证、正式分析。
Ghodsi Mohammadi Ziarani：可视化、监督、数据管理。
Zahra Panahande：撰写——审阅与编辑、软件、资源管理。
Somayeh Reiisi：软件、正式分析、数据管理。
Mehran Feizi-Dehnayebi：软件、资源管理、正式分析、数据管理、概念化。

出版同意：
所有作者均已阅读并批准了最终手稿。

伦理批准：
不适用。

资金：
本研究未获得任何资助。