磁场对超氧化物歧化酶活性的影响：从酶学层面进行的研究

《RSC Advances》：Effect of a magnetic field on the activity of superoxide dismutase studied at the enzyme level

　　尹尚宇（Sangwoo Yoon）| 张承哲（Seung-Cheol Chang）| 格雷戈里·F·佩恩（Gregory F. Payne）| 李承勋（Seunghun Lee）| 姜光硕（Kwangseuk Kyhm）| 朴成圭（Sung-Gyu Park）| 康美贞（Mijeong Kang）
釜山国立大学（PNU）认知机电工程系，韩国釜山46241
邮箱：[e-mail]

活性氧种类的调节对于维持细胞稳态至关重要，超氧化物歧化酶（SOD）是一种关键的抗氧化酶，负责清除超氧化物。在这项研究中，我们使用纯化的酶基反应系统在分子水平上分析了静态磁场对SOD活性的影响。通过黄嘌呤氧化酶（XOD）-黄嘌呤反应生成超氧化物，并利用光学方法评估了磁场的效果。磁场促进了超氧化物的生成以及SOD介导的超氧化物清除过程。为了进一步了解这种增强的清除能力，我们将SOD固定在金电极表面，电化学分析证实，在磁场作用下，SOD中的铜中心与电极之间的电子转移特性发生了变化。这些结果表明，在单一酶系统中，磁场可以影响抗氧化酶的电子转移行为及其催化活性，为磁场与生物氧化还原反应之间的相互作用提供了基础见解。

**引言**
活性氧（ROS）在各种代谢过程中不断产生，细胞通过抗氧化系统将其清除以维持氧化还原平衡。当这种平衡被打破时，过量的ROS会损害蛋白质、脂质和核酸，导致细胞功能受损、炎症以及退行性疾病的发展。因此，ROS的生成与清除之间的适当调节对细胞稳态至关重要。在ROS中，超氧化物被认为是多种ROS的前体，而超氧化物歧化酶（SOD）作为催化超氧化物清除的抗氧化酶，在这一调节系统中起着关键作用。最近的研究表明，外部物理刺激（如磁场刺激）可以影响细胞的氧化还原平衡。在本研究中，我们探讨了磁场是否能够调节SOD的酶活性。

**以往研究**
以往的研究主要关注细胞或生物体水平上磁场对SOD活性的影响。在这些研究中，细胞或生物系统被暴露在磁场中，并评估了SOD活性的变化以及其他与氧化应激相关的指标作为更广泛的生理反应的一部分。尽管这些方法提供了宝贵的生物学见解，但它们没有将酶与复杂的生物因素分离出来，因此无法提供关于磁场如何直接在分子水平上影响SOD催化活性的详细信息。使用纯化SOD在明确系统中的研究仍然非常有限。

**实验方法**
我们报告了静态磁场对含有纯化SOD的简化反应系统的影响（图1）。超氧化物（SOD的底物）是通过黄嘌呤氧化酶（XOD）-黄嘌呤反应系统生成的。在评估磁场对SOD清除超氧化物活性的影响之前，我们首先使用标准光学方法研究了磁场对XOD–黄嘌呤反应系统的影响。然后使用相同的光学方法量化了磁场对SOD活性的影响。最后，为了直接验证磁场如何影响SOD中铜中心的氧化还原行为（这是其催化活性的核心），进行了电化学测量。通过避免细胞或生物系统的复杂性，这种分子水平的分析为解释磁场对抗氧化系统的影响提供了更基础的理论依据，并可能有助于阐明基于磁场刺激的临床技术的机制。

**实验配置**
XOD、黄嘌呤、水溶性四唑盐8（WST-8）、SOD和半胱氨酸均从Sigma-Aldrich购买，按原样使用，无需进一步纯化。所有溶液均在磷酸盐缓冲液（pH约7.18，0.1 M，去离子水）中配制。

**磁场应用**
使用圆柱形永磁体施加磁场。三个磁体垂直堆叠并对齐。进行吸光度测量时，磁体放置在反应溶液的上方和下方；进行电化学测量时，磁体放置在反应溶液的下方。使用自制的磁体支架稳定固定磁体位置。使用高斯计（HGM09 s，MAGSYS Magnet Systeme，德国）测量施加到系统上的磁通密度。在吸光度实验中，溶液施加了约700 mT的磁场；在电化学测量中施加了约560 mT的磁场；这些值是根据每种实验设置的安全考虑选定的。为了直接比较光学和电化学结果，在560 mT下进行了额外的吸光度测量，相关数据见补充信息（见下文）。

**超氧化物生成与清除**
记录了400–540 nm范围内的UV-Vis吸收光谱（SpectraMax M5，Molecular Devices，美国），以评估XOD–黄嘌呤系统生成的超氧化物以及SOD对其的清除作用。为了观察SOD的氧化还原行为，进行了循环伏安法测量（CHI 600E，CH Instruments，美国）。使用由金工作电极、Ag/AgCl（3 M KCl）参比电极和铂丝对电极组成的三电极配置，以磷酸盐缓冲液作为支持电解质。电位从+0.4 V扫描到?0.3 V，扫描速率为100 mV s?1。为了监测SOD在金工作电极上的吸附行为，使用了带有耗散监测功能的石英晶体微天平（QCM-D，QSense OMNI，Biolin Scientific，瑞典）。除QCM-D测量外，所有实验均在有磁场和无磁场的情况下进行。

**金电极表面自组装单层半胱氨酸**
首先对金电极表面进行机械和电化学抛光，然后向电极表面滴加10 mM的半胱氨酸溶液。随后用去离子水冲洗电极，以去除物理吸附的半胱氨酸。

**结果与讨论**
**反应系统的磁场响应特性**
本研究中使用的反应系统包括通过XOD与黄嘌呤和O2的酶促反应生成超氧化物，随后由SOD介导超氧化物的清除。XOD、O2和SOD都具有顺磁性，表明它们可能对外部磁场作出反应。本研究中使用的SOD1在其活性中心含有铜阳离子复合物，铜在该复合物中在+2和+1氧化态之间交替，从而分别氧化和还原超氧化物。当铜处于+2态（电子构型d9）时，它具有一个未配对的电子自旋，因此表现出顺磁性。在XOD反应中，从黄嘌呤提取的电子通过Mo中心、Fe–S簇和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）传递给O2，过程中形成的自由基中间体也表现出顺磁性。溶解在溶液中的O2也因其三重态基态而表现出顺磁性。这些属性共同构成了我们的实验系统对磁场作出反应的必要条件。

**磁场对超氧化物生成的影响**
要研究磁场对SOD活性的影响，首先需要确定磁场如何影响其底物超氧化物的量。在没有SOD的情况下，仅在含有XOD、黄嘌呤和水溶性四唑盐8（WST-8）的缓冲溶液中检测了超氧化物的生成。WST-8被超氧化物还原成WST-8甲酚兰，使溶液颜色从粉红色变为橙色。首先将黄嘌呤和WST-8加入缓冲溶液中，并暴露于静态磁场（700 mT）30分钟。作为阴性对照，准备了未暴露于磁场的相同溶液。随后同时向两种溶液中加入XOD，以在有磁场和无磁场的情况下启动超氧化物的生成。图2A显示了用于评估磁场对超氧化物生成影响的吸收光谱。黄嘌呤溶液中的WST-8在400–550 nm范围内没有吸收峰，而WST-8与超氧化物反应生成的WST-8甲酚兰在约460 nm处有吸收峰。在有无磁场的情况下，加入XOD后10分钟收集了光谱。在两种条件下都观察到了WST-8甲酚兰的吸收峰，表明超氧化物是通过XOD–黄嘌呤反应生成的。在磁场存在的情况下，峰强度比无磁场时高约30%（图2B）。使用学生t检验对每组10个样本进行统计分析，结果表明两组之间存在显著差异（p < 0.01），表明磁场增强了基于XOD的超氧化物生成。为了解释这一结果，我们关注XOD中FAD的反应，FAD直接将电子传递给O2。FAD与O2的反应根据XOD的整体还原状态分为单电子路径或双电子路径：当XOD完全还原时，还原的FAD（FADH2）通过单电子路径与O2反应生成FADH˙和超氧化物；而在XOD部分还原的情况下，FADH2-O2转化为FADH˙–超氧化物，最终通过双电子路径生成H2O2。如果单电子路径更受青睐，则超氧化物的生成会增加。从热力学的角度来看，本研究中使用的磁场不太可能显著改变XOD的固有氧化还原性质，因为亚特斯拉磁场下的塞曼能量远小于室温下的热能。相反，磁场可能通过影响O2在黄素位点的可接近性来调节反应动力学。由于O2具有顺磁性，磁场可能会影响其在溶液中的局部可接近性，而不会显著改变本研究条件下的平衡溶解度。这可能会改变黄素反应界面的相遇动态。在O2可接近性增强的条件下，FADH2向O2的单电子转移预计会更频繁发生。相比之下，完成双电子路径需要中间体足够长时间存在以便进行第二次电子转移，这取决于XOD内的电子重分布。如果O2的相遇变得更频繁但持续时间更短，则反应更可能在第一次电子转移后终止，从而导致超氧化物生成增加。在这个框架下，磁场被认为通过调节XOD中的路径分支来微妙地增强超氧化物的生成。

**磁场对SOD清除超氧化物的影响**
在确认磁场增强了超氧化物的生成后，我们研究了其对SOD清除超氧化物活性的影响。首先准备了含有黄嘌呤、SOD和WST-8的缓冲溶液，并将其暴露于磁场（560 mT）30分钟。作为阴性对照，准备了未暴露于磁场的相同溶液。随后同时向两种溶液中加入XOD，以在有磁场和无磁场的情况下启动超氧化物生成反应。图3显示，SOD介导的WST-8甲酚兰抑制反映了超氧化物的清除，这取决于磁场的存在。通过XOD–黄嘌呤反应生成的超氧化物要么将WST-8还原成WST-8甲酚兰，要么与SOD反应（图3A）。当超氧化物被SOD清除时，WST-8甲酚兰的生成被抑制，吸收信号减弱。在磁场存在的情况下，SOD将WST-8甲酚兰的峰强度抑制了69.0%（图3B）；而在无磁场的情况下，抑制率为57.8%（图3C）。图3D显示，磁场使抑制比率增加了约11.2%。t检验比较了两组之间的抑制比率（每组N = 10），结果显示存在统计学上的显著差异（p < 0.05）。因此，我们得出结论：在磁场存在的情况下，SOD的超氧化物清除活性增强。为了进一步研究磁场对SOD行为的影响，我们进行了如下所述的电化学分析。下载：下载高分辨率图像（587KB）下载：下载全尺寸图像图3. 磁场对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响。(A) 黄嘌呤氧化酶（XOD）生成的超氧化物的反应途径示意图。超氧化物与SOD或水溶性四唑盐8（WST-8）反应，生成WST-8甲瓒，其在460 nm处有强烈的吸收。(B和C) 含有黄嘌呤、XOD和WST-8的溶液（虚线）以及额外含有SOD的溶液（实线）的吸收光谱，在有（B）和无（C）磁场的情况下记录（磁通密度：700 mT）。所有光谱都是在向含有黄嘌呤和WST-8的溶液中加入XOD后10分钟获得的，无论是否含有SOD。线条和阴影区域分别表示平均值和标准差（每组N = 10）。(D) B（红色）和C（黑色）中观察到的460 nm处的吸收抑制。使用Student's t检验评估统计显著性（p < 0.05）。MF：磁场。尽管主要的光学吸收数据是在700 mT的磁场下获得的，但也在560 mT下检查了光学吸收响应（见SI中的图S1），该磁场对应于电化学测量中使用的磁通密度，以便直接比较光学和电化学结果。在560 mT下观察到了相同的总体趋势，尽管磁场诱导的效果幅度略小。

对SOD在磁场下的氧化还原行为进行了电化学研究。上述光学实验表明，磁场在显色测定中增强了SOD的活性。为了从氧化还原行为的角度分析这一现象，采用了电化学测量方法。由于SOD中的Cu中心必须能够与Au电极进行电接触，因此将SOD固定在电极表面上。我们尝试使用未经改性的Au电极观察自由扩散的SOD的氧化还原信号；然而，在我们的实验条件下没有观察到特征性的氧化还原峰（详见下文）。因此，使用SOD固定化来实现对Cu氧化还原中心的电化学访问。虽然这种配置不能完全再现生物流体中自由扩散的SOD，但它提供了一个受控的界面模型，用于研究磁场依赖的SOD氧化还原行为。为了将SOD固定在Au电极表面，首先使用半胱氨酸在Au表面形成自组装单层（SAM）。在中性缓冲溶液中，半胱氨酸的羧基和氨基分别带有负电荷和正电荷，从而能够与SOD的氨基酸残基发生静电相互作用，而氢键和疏水相互作用也可能有助于吸附，从而促进SOD在电极表面的固定。已知这种通过半胱氨酸的固定化有助于SOD保持其超氧化物歧化的活性。使用半胱氨酸改性的Au电极，首先在空白缓冲溶液中获得了循环伏安图（CVs），然后在同一溶液中加入SOD后进行了测量。图4显示了在存在和不存在半胱氨酸SAM的情况下SOD信号的差异。在裸露的Au电极上，仅在含有溶解O2的空白和含SOD的缓冲溶液中观察到来自氧还原反应（ORR，起始电位：约0 V vs. Ag/AgCl）的电流。相比之下，在空白缓冲液中用半胱氨酸涂层的Au电极记录的CVs没有ORR，表明SAM形成了一个紧凑的涂层，阻碍了ORR。当向该溶液中加入SOD并沿负方向扫描电位时，在大约?0.0 V处出现了一个还原峰。反向扫描电位时，在0.2 V附近出现了一个氧化峰。这些峰归因于SOD中Cu中心的还原和氧化。通过用半胱氨酸涂覆电极，实现了SOD氧化还原信号的稳定测量，所有后续的电化学实验都是使用半胱氨酸涂层的电极进行的。

研究了磁场对SOD中Cu中心氧化还原行为的影响。图5A显示了在磁场存在的情况下，将半胱氨酸涂层电极浸入仅含有SOD的缓冲液中后记录的时间依赖性CVs。在这个实验中，溶液中既没有XOD也没有黄嘌呤；因此，没有生成超氧化物。测得的电流完全归因于SOD中的Cu中心与电极之间的电子交换，其中电子隧穿被认为是主要途径。测量在10分钟间隔下进行了120分钟。随着时间的推移，电流有所增加（图5C）。在没有磁场的情况下进行的QCM-D测量（见SI中的图S2）证实了SOD逐渐吸附到半胱氨酸涂层的Au表面上。因此，电流的增加至少部分归因于SOD的逐渐吸附。然而，伴随的峰分离增加（图5D）表明吸附的SOD群体对电子转移的贡献并不均匀，可能反映了包括具有较慢表观电子转移动力学的弱耦合物种在内的分布。

磁场对SOD中Cu中心氧化还原行为的影响进行了研究。图5A和B显示了在磁场存在（A）和不存在（B）的情况下记录的SOD的循环伏安图（CVs）（每组N = 5，磁通密度：560 mT）。在向电解质溶液中加入SOD之前和之后，每隔10分钟记录一次CVs。图5C和D显示了A和B中观察到的SOD的还原和氧化峰的电流密度（C）和峰峰分离（D）的时间依赖性变化。在磁场存在（图5A）和不存在（图5B）的情况下进行的测量中，SOD的氧化还原信号存在时间依赖性差异。图5C和D总结了每组五个电极的平均峰电流密度和峰电位分离。在磁场下观察到更高的峰电流密度和更宽的峰分离。在上述SOD信号的时间依赖性演变背景下，这些结果表明，磁场增加了可电化学访问的SOD的表观表面密度，而不仅仅是加速了Cu中心的固有电子转移动力学。这种行为的一个可能原因是界面电化学环境的扰动。先前的磁电化学研究表明，静态磁场可以改变含有界面顺磁物种的系统的电化学双层，并移动外亥姆霍兹平面，从而改变表观电化学响应，而不一定改变固有的氧化还原动力学。在我们的SOD-半胱氨酸改性的Au系统中，这种界面电位分布的变化可能使之前电活性较低的SOD物种能够贡献到测得的电流中。这种解释解释了峰电流密度的增加，而更宽的峰分离反映了这种额外SOD群体与电极的耦合效率较低或更加不均匀。

可以考虑的一个因素是磁场下的磁流体动力学（MHD）对流。尽管MHD对流原则上可以由洛伦兹力（J × B，其中J是电流密度，B是磁通密度）引起，但在我们的系统中，磁场和电流都大致沿着表面法线方向排列，大大减少了洛伦兹力的影响。此外，电流密度仅为几mA m?2，磁通密度低于1 T，进一步限制了单位体积的洛伦兹力大小。使用大约100 μm的扩散层厚度的近似估计，得到的流速（估计为JBL2/μ，其中L是电极附近的特征长度尺度，μ是溶液的动态粘度）预计为10?2 μm s?1。这个值显著小于由扩散主导的传输速度。因此，MHD驱动的质量传输不太可能显著影响观察到的电化学响应。另一个需要考虑的因素是磁场诱导的SOD在电极表面的重新定向。尽管SOD中的Cu中心是顺磁性的，但相关的磁能尺度（估计为gμBB，在0.5 T时约为10?23 J，其中g是朗德g因子，μB是玻尔磁子）远小于热能（kBT ≈ 10?21 J，在室温下，其中kB是玻尔兹曼常数，T是温度），表明任何磁场诱导的定向偏差都非常弱。此外，酶通过静电、氢键和疏水相互作用吸附在电极表面上，这些作用力的界面结合能通常达到10 kBT或更多。因此，重新定向需要克服热波动和界面结合作用，不太可能显著影响观察到的响应。

在这项研究中，使用纯化的酶反应系统在分子水平上分析了静态磁场对SOD活性的影响。通过XOD–黄嘌呤系统生成的超氧化物的光学定量显示，磁场增强了超氧化物的生成，更重要的是，增强了SOD介导的超氧化物去除。电化学分析进一步表明，在磁场下，SOD中的Cu中心与电极之间的电子转移特性发生了变化，证明了在这种受控界面系统中SOD的氧化还原行为对磁场具有响应性。这些发现表明，磁场可以影响抗氧化酶的催化作用。总体而言，这项单酶水平的研究提供了关于磁场与生物氧化还原反应之间相互作用的基本见解。

作者贡献：概念化，K. K. 和 M. K.；方法学，S. Y. 和 M. K.；形式分析，S. Y., S. L. 和 M. K.；研究，S. Y.；资源，S.-G. P. 和 M. K.；写作—原始草稿准备，S. Y. 和 M. K.；写作—审阅和编辑，所有作者；可视化，S. Y. 和 M. K.；监督，M. K.；项目管理，M. K.；资金获取，K. K. 和 M. K. 所有作者都阅读并同意了发表的手稿版本。

没有需要声明的利益冲突。

支持本研究发现的数据可以在文章中找到。根据合理请求，可以从通讯作者处获得支持本研究发现的额外数据。补充信息（SI）也可获取。请参阅DOI：https://doi.org/10.1039/d5ra10059c。