CRISPR/Cas介导的基于DNA模板的纳米簇用于铅离子的比率荧光检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：CRISPR/Cas-mediated DNA-templated nanoclusters for ratiometric fluorescence detection of lead ions

刘正|王玉萌|冯玉凡|孙春燕|李红霞|闫旭

吉林大学食品科学与工程学院食品质量与安全系，长春130062，中国

摘要

铅离子（Pb2?）对生态系统和人类健康构成严重威胁，因此迫切需要开发可靠且便捷的检测方法。在荧光生物传感器领域，基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光团-淬灭剂对是最常用的信号报告分子。然而，它们依赖于单一荧光信号，这存在固有的缺点。本文制备了以DNA为模板的银纳米簇信标（NCBs）作为生物传感器的荧光信号报告分子。其信号响应机制是由于银纳米簇的转变过程，而非FRET。当DNA模板被切割时，可以观察到100纳米的发射红移，这与传统的荧光团-淬灭剂报告分子不同。通过利用NCBs的独特荧光特性和CRISPR/Cas12a的信号放大能力，开发了一种用于检测Pb2?的比率荧光生物传感器。该生物传感器的检测范围为0.1至20纳摩尔（nM），检测限（LOD）为21皮摩尔（pM）。此外，通过将水凝胶与智能手机结合，成功开发了一种便携式平台，用于现场检测（POCT）。这项工作为荧光生物传感器的开发提供了宝贵的见解，对环境监测、食品安全和临床诊断具有重要意义。

引言

铅离子（Pb2?）对生态系统和人类健康构成重大威胁[1]。世界卫生组织（WHO）规定饮用水中的Pb2?浓度不应超过0.01毫克/升（mg/L）[2] [3]。由于原子吸收光谱（AAS）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等传统分析方法具有高精度、优异的灵敏度和良好的重复性，已成为Pb2?定量的标准实验室技术，在精密分析应用中发挥着不可替代的作用。然而，这些标准方法仍存在某些局限性，包括成本较高以及便携式现场检测受到限制。基于DNA的生物传感器作为一种有前景的技术，能够满足现场应用的需求[4] [5]。

由于具有可编程的目标识别能力和强大的信号增强能力，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统彻底改变了生物传感领域[6] [7]。随后提出了基于CRISPR的诊断方法（CRISPR-Dx）。CRISPR-Dx发展了多种信号读取策略，包括拉曼光谱、化学发光和电化学[8] [9]。尽管这些方法具有良好的检测性能，但它们要么需要复杂的操作程序，要么需要专业设备，要么与现有的现场检测系统（POCT）不兼容[10] [11] [12]。因此，专门为基于CRISPR/Cas的生物传感器开发先进的信号读取策略是一个紧迫且被广泛认可的挑战。

荧光信号读取策略非常适合用于构建基于CRISPR/Cas的生物传感器，因为它易于使用且响应迅速[13]。传统的报告分子通常使用基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光团-淬灭剂对，并通过短单链DNA（ssDNA）连接[14] [15]。然而，这种单一荧光信号读取策略存在固有的缺点[16]。例如，它对环境因素、仪器波动甚至实验程序的差异非常敏感。通过量化两种荧光信号的变化，可以大大减少干扰，从而提高分析的可靠性。贵金属纳米簇（NCs）是一类独特的荧光纳米材料，非常适合作为生物传感器的信号转换元件[17] [18]。其中，以DNA为模板的银纳米簇（DNA/AgNCs）具有多个优点，如优异的光稳定性、易于合成和可调节的光物理性质[19] [20]。尽管目前有一些关于CRISPR/Cas技术与DNA/AgNCs结合的研究，但这些通常是单荧光传感器[21] [22]。因此，它们被视为传统荧光染料的有希望的替代品。通过调整DNA模板的序列、长度和结构，可以控制荧光发射波长范围，使其适用于比率荧光生物传感器的开发[23] [24]。

在本研究中，构建了一种基于DNA模板银纳米簇信标（NCBs）和CRISPR/Cas技术的比率荧光生物传感器，用于检测Pb2?。当DNA模板被切割时，其荧光发射从530纳米（nm）变为630纳米（nm）。信号转换机制是由DNA模板切割引起的纳米簇转变过程。这种机制是纳米簇转变过程，而非FRET。与传统基于FRET的报告分子相比，NCBs作为一种更简单的单步信号转换报告分子。它们的非FRET机制不仅避免了FRET依赖的能量转移复杂性，还实现了100纳米的发射红移以及更大的斯托克斯位移和更好的光漂白抗性。利用NCBs的独特光学特性，开发了一种用于高灵敏度检测Pb2?的比率荧光生物传感器，该传感器集成了GR5 DNA酶和CRISPR/Cas12a。在此基础上，通过将水凝胶与智能手机结合，实现了Pb2?的便携式检测。

章节片段

NCBs的合成

将DNA寡核苷酸溶解在无核酸酶的水中，最终浓度为500微摩尔（μM）。溶液在95°C下加热5分钟，然后缓慢冷却至室温。将20微摩尔（μL）的500微摩尔（μM）DNA溶液加入25微摩尔（μL）的200毫摩尔（mM）磷酸钠缓冲液（pH 6.2）中，然后加入187微摩尔（μL）的无核酸酶水。向混合液中加入12微摩尔（μL）的10毫摩尔（mM）硝酸银溶液，混合后离心1分钟。经过20分钟的平衡阶段后，加入6微摩尔（μL）

NCBs的特性

使用合理设计的发夹结构寡核苷酸通过一步还原法合成NCBs（图1a）。截短DNA变体的荧光强度测量证实，只有全长发夹结构（5'和3'臂均完整）才表现出强荧光（图S1）。这是因为完整的DNA骨架为AgNCs的成核提供了必要的空间限制。NCBs中成功形成了AgNCs

结论

总之，本研究中开发的NCB报告分子提供了一种非FRET的比率传感替代方案。此外，调控NCBs荧光信号转换的潜在机制已得到系统阐明，为它们在CRISPR/Cas介导的生物传感器中的应用奠定了理论基础。通过将GR5 DNA酶与CRISPR/Cas12a结合，构建了一种用于高灵敏度检测Pb2?的比率荧光生物传感器。该生物传感器协同作用

CRediT作者贡献声明

孙春燕：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。李红霞：监督，概念构思。闫旭：监督，资金获取。刘正：软件，方法学，概念构思。王玉萌：方法学，正式分析。冯玉凡：验证，数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（32472427）、中国国家重点研发计划（2023YFB3208301）和吉林大学研究生创新基金（2026CX185）的财政支持。