利用单链M13噬菌体DNA生成HBV cccDNA以模拟其微型染色体功能

《Journal of Virology》：Generation of HBV cccDNA using single-stranded M13 phage DNA for authentic minichromosome functionality

　　

： 乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）在肝细胞核内以微型染色体形式持续存在，并作为病毒RNA的转录模板。由于其拷贝数极低，稳定的cccDNA池在研究其分子特性和开发靶向疗法方面面临挑战。为了准确模拟HBV cccDNA的全长序列和结构，研究人员开发了一种利用基于M13噬菌体的系统和脱氧核酶来生产与cccDNA正链和负链相对应的全长单链DNA（ssDNA）的新方法。该方法涉及将ssDNA环化，然后添加T4 DNA连接酶，从而产生cccDNA。由M13噬菌体来源的单链DNA体外环化形成的cccDNA（McccDNA）能够在瞬时转染的肝细胞内形成微型染色体，重现了HBV生命周期的关键阶段，并能有效响应多种抗病毒药物。此外，由于不含外源序列，McccDNA被证明能够精确转录主要病毒RNA，并以序列特异性方式组织核小体。此外，McccDNA模型允许靶向删除病毒蛋白，产生可用于进一步微型染色体研究的功能缺失表型。总之，从单链M13噬菌体DNA生成的McccDNA重现了HBV cccDNA的天然特性，可作为研究cccDNA微型染色体功能的真实模型。 重要性： HBV仍然是全球主要的健康负担，其中cccDNA作为维持持续性感染的病毒RNA的转录模板。cccDNA在细胞核中的低拷贝数以及缺乏真实的体外模型阻碍了对其的研究和疗法开发。本研究建立了一种基于M13噬菌体来源的单链DNA的方法，可在体外高效生成序列真实的HBV cccDNA。转染后，cccDNA分子组装成微型染色体并被证明具有生物活性，与重组cccDNA相比，其产生的病毒RNA能更真实地重现感染来源的转录本。该系统还允许进行靶向诱变用于功能缺失研究以及位点特异性标记。这些结果为HBV cccDNA微型染色体的核小体组织和转录特性提供了见解，为研究微型染色体功能和宿主-病毒相互作用提供了一个真实的平台。

研究背景、问题与研究动因

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的重大公共卫生问题。HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）是病毒在感染肝细胞核内形成的一种微型染色体结构，作为病毒转录和复制的持久性模板，是导致慢性乙型肝炎难以治愈的关键障碍。然而，天然感染肝细胞中cccDNA拷贝数极低（通常每个细胞仅1-10个拷贝），这严重阻碍了对其分子特性、核小体组织、与宿主因子相互作用以及靶向药物开发的深入研究。现有的研究模型，如基于重组酶系统环化HBV基因组产生的重组cccDNA（rcccDNA），虽然提升了cccDNA的检测水平，但其在环化过程中引入了外源序列，可能破坏HBV基因组重叠开放阅读框的表达，影响病毒蛋白水平和复制活性，降低了模型的保真度。因此，开发一种不含有外源序列、能更真实模拟天然cccDNA序列与结构的体外模型，对于深入理解cccDNA微型染色体的功能、评估抗病毒疗法以及探索cccDNA清除机制至关重要。基于此，研究人员在《Journal of Virology》上发表了此项研究，旨在建立一种基于M13噬菌体单链DNA系统的高保真HBV cccDNA生成和功能研究平台。

主要关键技术方法概述

本研究采用的核心方法可概括为以下几点：

1. 1.
   M13噬菌体单链DNA生产系统：研究人员构建了分别含有HBV cccDNA正链和负链序列的噬菌体质粒（phagemid），序列两端侧翼为I类和II类脱氧核酶序列。将质粒转化至JM109感受态细胞，用M13辅助噬菌体感染，扩增后收集重组M13噬菌体颗粒，裂解并提取其单链DNA基因组。
2. 2.
   体外cccDNA（McccDNA）的生成与验证：在锌离子存在下，利用脱氧核酶切割，从噬菌体基因组中分离出目标HBV单链DNA。将纯化后的正、负链单链DNA以等摩尔比退火，形成带缺口的双链环状DNA，再通过T4 DNA连接酶两步连接，最终生成共价闭合环状DNA（McccDNA）。通过琼脂糖凝胶电泳、Southern blot、T5核酸外切酶和限制性内切酶消化验证其结构与超螺旋形态。
3. 3.
   细胞转染与功能验证：将生成的McccDNA转染至HepG2-NTCP肝细胞系。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBsAg和HBeAg分泌，免疫荧光检测HBsAg和HBc表达，Northern blot检测病毒RNA转录，Southern blot检测病毒衣壳DNA复制水平，染色质免疫沉淀（ChIP）验证组蛋白结合以证明微型染色体形成。此外，还评估了抗病毒药物（如恩替卡韦、GLS-4、siRNA、干扰素-α）在McccDNA模型中的药效。
4. 4.
   比较分析与结构研究：将McccDNA与含有外源序列的rcccDNA模型在抗原表达、RNA转录（包括5‘RACE分析剪接变异）等方面进行比较。通过微球菌核酸酶测序（MNase-seq）分析McccDNA转染细胞中cccDNA微型染色体的核小体结合位点，并与已发表的天然感染系统数据进行比对，评估其核小体组织相似性。
5. 5.
   功能缺失模型构建：通过定点突变技术，构建了HBc蛋白和HBx蛋白编码区功能缺失的McccDNA突变体（McccDNA_ΔC和McccDNA_ΔX），用于研究这些关键病毒蛋白对cccDNA转录活性的调控作用。

研究结果

1. Construction of HBV cccDNA from M13 phage-derived ssDNA

研究人员成功利用M13噬菌体系统生产出与HBV cccDNA正、负链对应的单链DNA。通过脱氧核酶切割、单链DNA退火和T4 DNA连接酶连接，在体外合成了共价闭合环状的McccDNA。凝胶电泳和Southern blot分析证实，生成的产物具有与超螺旋cccDNA一致的迁移率，并能抵抗T5核酸外切酶消化，经EcoRI酶切后线性化为3.2 kb片段，验证了其cccDNA结构。此外，还成功演示了利用截短ssDNA与生物素化寡核苷酸退火连接生成生物素标记McccDNA的方法。

2. Characterization of McccDNA model

将McccDNA转染至HepG2-NTCP细胞后，该模型展现出强大的生物学活性。它能有效表达HBsAg、HBeAg和HBc等病毒蛋白，转录产生主要的HBV RNA（如前基因组RNA），并进行病毒DNA复制，组装成具有感染性的成熟病毒颗粒。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，转染后的McccDNA在细胞核内与组蛋白结合，成功形成了cccDNA微型染色体结构。这些结果表明McccDNA模型能够支持HBV生命周期的关键步骤。

3. Efficacy of anti-HBV therapies in McccDNA model

McccDNA模型对不同作用机制的抗HBV药物均表现出预期的敏感性。核苷类似物恩替卡韦和衣壳组装调节剂GLS-4能显著抑制病毒DNA复制，但不影响RNA水平。靶向HBV X蛋白开放阅读框的小干扰RNA能有效降低病毒RNA和DNA水平。干扰素-α处理，特别是IFN-α14亚型，可同时降低病毒RNA和DNA水平，并伴随转录激活标记组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）的减少。这表明McccDNA模型适用于抗病毒药物的疗效评估和作用机制研究。

4. Impact of exogenous sequences on HBV cccDNA activity

与不含外源序列的McccDNA相比，含有重组酶识别位点的rcccDNA模型表现出较低的抗原表达和较弱的病毒DNA复制信号。Northern blot分析发现rcccDNA系统产生了一条迁移较慢的异常RNA条带。通过5‘端快速扩增cDNA（5’ RACE）和测序分析，研究人员发现这是由于外源序列的插入增加了HBV preC RNA和前基因组RNA在特定位点发生异常剪接的可能性，产生了截短的转录本，从而可能影响HBV聚合酶和核心蛋白的表达与功能。这突显了不含外源序列的McccDNA在研究cccDNA精确转录活性方面的优势。

5. MNase-seq mapping of nucleosome binding on HBV cccDNA minichromosome

利用MNase-seq技术对McccDNA转染细胞中的核小体结合位点进行图谱绘制，并与已发表的天然HBV感染系统数据（Mono-seq）进行比较。分析显示，McccDNA系统与感染系统的核小体结合信号高度相似，核小体主要富集在HBV基因组的基因间区，在启动子和增强子区域也观察到特定的富集模式。围绕HBx和preS1转录起始位点（TSS）的核小体定位模式在两个系统中也基本一致。这些结果证实，McccDNA形成的微型染色体在核小体组织层面与天然cccDNA具有高度相似性。

6. Characterization of the key viral protein-deficient cccDNA by generated McccDNA model

研究人员成功构建了HBc缺陷型（McccDNA_ΔC）和HBx缺陷型（McccDNA_ΔX）McccDNA。与野生型McccDNA相比，两种突变体转染细胞后，病毒抗原分泌、RNA转录和DNA复制水平均显著降低。将对应的病毒蛋白表达质粒与突变体共转染，可部分恢复抗原表达。定量分析显示，每个McccDNA分子的相对转录活性在突变体中下降。这证明了McccDNA平台可用于研究特定病毒蛋白对cccDNA转录活性的调控，并便于进行病毒基因组操作。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员阐述了HBV cccDNA作为微型染色体的复杂性，并指出现有模型（如天然感染和rcccDNA）在研究其分子结构和功能方面的局限性。rcccDNA模型中残留的外源序列会影响其复制活性和抗原表达，并可能诱导异常的RNA剪接。相比之下，本研究建立的McccDNA系统利用M13噬菌体高效生产单链DNA，通过体外环化生成不含外源序列的全长cccDNA。该模型不仅产量可达微克级，避免了DNA甲基化，更重要的是，它能准确模拟天然cccDNA的多种特性：在细胞核内组装成微型染色体，具有活跃的转录、复制和抗原表达能力，并能响应各类抗病毒药物。MNase-seq分析进一步从结构上证实了McccDNA微型染色体的核小体排布与天然感染系统高度相似。此外，该系统易于进行遗传操作（如功能缺失突变、生物素标记），为cccDNA相关宿主因子筛选、染色质结构分析和药物靶点发现提供了强大且高保真的平台。尽管McccDNA通过转染进入细胞，与天然感染的cccDNA形成途径和初始拷贝数不同，且会随着细胞分裂而稀释，但这些特性恰恰使其成为研究cccDNA在有丝分裂中丢失动态及稳定性调控机制的独特工具。

研究结论：综上所述，从单链M13噬菌体DNA生成的McccDNA重现了HBV cccDNA的天然特性，可作为研究cccDNA微型染色体功能的真实模型。本研究建立的这一新系统有效解决了现有cccDNA研究模型的关键局限，为深入探索cccDNA微型染色体的结构和功能，以及支持针对cccDNA的新治疗策略的开发和评估提供了一个合适且高效的平台。