基于普鲁兰包覆的纳米等离子体的光热PCR技术，可在6分钟内实现超快速核酸分析

《Analytica Chimica Acta》：Photothermal PCR within 6 minutes based on pullulan-coated nanoplasmas for ultrafast nucleic acid analysis

朱圆圆|马思涵|杜俊刚|杨天一|陈彦菊|何向翔|于晓萍|周清丽|吴健
浙江大学生物系统工程与食品科学学院及浙江大学-杭州全球科技创新中心，中国杭州310058/311215

**摘要**
基于特定纳米材料的光热PCR技术因其高效的光热转换能力而受到关注。然而，这些纳米材料可能会吸附聚合酶，从而抑制PCR反应。由于纳米材料体积小且表面原子活性高，它们容易发生聚集和沉淀，导致反应体系内加热不均匀。此外，用于检测的荧光基团在激发光下容易发生光漂白现象。因此，需要开发稳定的光热纳米材料及与之兼容的光热PCR检测策略。

**结果**
本文提出了一种基于封闭型纳米等离子体的光热PCR方法与平台，用于超快核酸分析。引入了普鲁兰包覆的金纳米粒子（AuNRs），制备了普鲁兰-AuNRs纳米等离子体以防止AuNRs聚集和聚合酶吸附。构建了一个用于超快光热PCR的光电平台。红外激光激发AuNRs的光热效应，使PCR溶液迅速升温。通过温度反馈调节激发光源和风扇的开关周期，实现AuNRs的光热转换，从而在6分钟内完成超快光热PCR。将CRISPR/Cas检测技术与光热PCR结合，可在4分钟内检测到扩增产物并输出荧光信号，最低可检测到38个拷贝/反应的沙门氏菌DNA。

**意义**
普鲁兰包覆的光热纳米材料解决了稳定性问题和与PCR系统的兼容性问题。这种一体式光热PCR-CRISPR检测方法在密闭条件下进行，避免了激发光源与检测光源之间的干扰。该方法简单、快速、准确且无污染，可在10分钟内实现超快检测。

**引言**
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、沙门氏菌（Salmonella）和大肠杆菌（Escherichia coli）等病原菌是主要的致病因子。它们的高繁殖率和易传播性可能导致食源性疾病爆发。因此，检测食源性病原菌对于保障食品安全至关重要，开发高效检测方法具有重要意义。传统的实验室检测方法依赖于培养技术，但该过程包括细菌富集、选择性培养、纯化和生化鉴定等多个步骤，耗时费力，不适合快速检测[1]。基于特异性抗原-抗体相互作用的检测方法往往灵敏度不足，容易出现假阴性结果[2]。核酸是病原菌的遗传物质，是核酸检测技术的直接目标。核酸分析通过碱基配对直接检测遗传序列信息，是一种广泛应用的技术[3]–[7]。自聚合酶链反应（PCR）技术问世以来，它已成为临床实验室、农业科学、环境科学和法医学领域的重要工具[8]–[11]。由于其能够检测微量目标核酸，基于PCR的核酸扩增被视为标准方法。PCR需要在两个或三个不同温度之间进行热循环以扩增特定核酸序列。传统PCR热循环仪通常采用珀尔帖（Peltier）温度控制模块[12]，但仪器成本高、体积大且扩增时间较长（约1-2小时），限制了其在超市、零售店等现场的应用。便携式检测仪器和快速检测方法在现场核酸检测中具有巨大潜力[13]–[15]，相关研究也在不断进展[16]–[17]。为实现快速PCR，研究人员提出了快速PCR的概念，旨在几分钟内扩增DNA目标。基于特定纳米材料光热效应的光热循环技术因非接触式能量转换而受到关注，由此产生了光热PCR技术[18]–[23]。纳米材料的光热效应依赖于等离子体激发产生的热能，通过非辐射弛豫途径将光子能量转化为热能[24]。这种能量可用于快速加热溶液，加快温度上升（PCR变性过程），缩短核酸扩增时间。每个纳米粒子都充当加热元件，因此这些材料也被称为纳米加热器。与传统PCR系统相比，光热PCR的加热过程从非接触式转变为接触式加热，热源与溶液之间的接触面积更大，加热更均匀、速度更快[25]。此外，纳米材料优异的热导率增强了热传递效率，使得光热PCR的加热速度优于传统PCR。

然而，基于光热效应的光热PCR仍存在局限性：首先，光热纳米材料（尤其是重金属纳米材料）可能吸附DNA或聚合酶，抑制PCR反应；其次，纳米材料因体积小和表面原子活性高而容易聚集或沉淀，导致反应体系内加热不均匀。例如，在激光照射和光热转换过程中，金纳米棒（AuNRs）可能聚集或失稳，从高长径比棒状变为低长径比棒状，最终形成球形纳米粒子[29]。一些研究通过用氧化石墨烯或二氧化硅等材料包覆金纳米粒子来提高其稳定性，但这些材料在生物相容性方面仍有改进空间[30]–[32]。此外，还存在光路干扰（光热PCR光源与荧光检测光源之间的干扰）或光漂白（光热PCR光源可能淬灭检测系统中的荧光基团）等问题。

**CRISPR/Cas系统**
CRISPR/Cas系统由规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）组成。具有转切裂活性的Cas蛋白在CRISPR RNA（crRNA）的引导下可特异性结合目标DNA链并随机切割单链DNA[33]。这种转切裂效率高，由于是酶促反应，可实现信号放大，检测灵敏度极高。Cas蛋白在crRNA引导下识别目标DNA链，确保高度特异性。因此，CRISPR/Cas系统可作为核酸检测工具，检测结果可通过荧光检测仪器观察[34]。目前，定量PCR（qPCR）被公认为核酸扩增的金标准，常用于病原菌检测。但qPCR需要昂贵的荧光模块，且易发生非特异性扩增。相比之下，基于CRISPR的诊断技术具有高特异性，可实现扩增产物的终点检测，从而降低检测成本。将PCR扩增与CRISPR诊断结合，可开发出高特异性和荧光可视化的分子诊断方法。已有大量研究建立了基于PCR-CRISPR的病原菌检测平台，如幽门螺杆菌[35]、沙门氏菌[36]和大肠杆菌[37]。

**方法与平台**
本文提出了一种基于普鲁兰包覆纳米等离子体的超快核酸分析方法与平台：首先用普鲁兰包覆不稳定的AuNRs，制备出普鲁兰包覆的纳米等离子体系统，保护AuNRs表面的活性原子和电荷位点，防止其聚集和吸附DNA聚合酶；其次建立光电平台实现超快光热PCR；最后结合CRISPR系统特异性检测扩增产物并输出荧光信号。光热PCR与CRISPR系统的空间分离避免了两者之间的干扰，实现简单、快速、准确的可视化检测，从而实现食源性病原菌的快速检测。

**材料**
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、氯金酸（HAuCl4）、硝酸银（AgNO3）、溴化钾（KBr）和抗坏血酸购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）；普鲁兰购自Solarbio上海生物科技有限公司；新鲜虾来自当地超市；SpeedSTAR HS DNA聚合酶、10× Fast Buffer I、dNTPs和RNase抑制剂购自Takara Biotechnology有限公司（中国大连）。

**基于普鲁兰包覆纳米等离子体的光热PCR核酸分析策略**
图2展示了基于普鲁兰包覆纳米等离子体的核酸分析策略示意图：首先用普鲁兰包覆不稳定的AuNRs，制备稳定的纳米等离子体系统，防止其聚集和吸附DNA聚合酶；然后利用光电平台的红外激光激发AuNRs的光热效应，快速升温；通过温度反馈调节光源和风扇的开关，实现AuNRs的光热转换。

**结论**
本研究通过用普鲁兰包覆不稳定的AuNRs，制备出普鲁兰包覆的纳米等离子体复合材料，有效解决了酶吸附和AuNRs加热聚集问题。这些纳米加热器均匀分散在PCR反应体系中，直接参与反应过程。

**作者贡献声明**
朱圆圆：撰写初稿、方法学设计、实验研究；
杨天一：实验研究；
陈彦菊：实验研究；
马思涵：方法学设计、实验研究；
杜俊刚：实验研究；
周清丽：指导、方法学设计、概念构思；
吴健：撰写修订稿、指导、方法学设计、资金申请；
何向翔：实验研究；
于晓萍：撰写修订稿、概念构思；

**利益冲突声明**
作者声明无已知可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

**致谢**
本研究得到浙江省重点研发计划（2025C02125）和浙江省农业农村厅项目（2025SNJF021）的支持。