CRISPR/Cas9系统在体外和体内均能抑制大口黑鲈病毒的感染

《Aquaculture》：CRISPR/Cas9 system inhibits largemouth bass virus infection in vitro and in vivo

何瑞龙|何茂生|姜新元|王毅旺|郝亮|卜向义|徐坤|凌飞|王高学|江海峰

中国海南省三亚市西北农林科技大学海南研究院，邮编572024

摘要

大口黑鲈病毒（LMBV）是一种大型双链DNA病毒，可引发大口黑鲈（Micropterus salmoides）的急性且致命的疾病，对水产养殖业构成严重威胁。近年来，CRISPR/Cas9系统在抗病毒应用中展现出巨大潜力。在本研究中，我们首先在EPC细胞中建立了基于GFP的报告系统，以验证CRISPR/Cas9系统针对LMBV基因组的特异性。随后，我们设计了18条针对六个关键LMBV基因的sgRNA，构建了相应的CRISPR/Cas9构建体，并在体外评估了其抗病毒活性。结果显示，针对DNA聚合酶样蛋白（DNAPol）和AAA-ATP酶（ATPase）基因的Cas9系统能够有效抑制病毒复制，抑制率分别为94.25%和95.12%，病毒滴度降低了约600倍。CRISPR/Cas9系统在感染后24、48、72和96小时仍保持显著的病毒抑制效果，并显著减轻了病毒引起的细胞病变。在体内实验中，针对DNApol和ATPase的CRISPR/Cas9系统使存活率分别提高到34%和42%，优于感染对照组。总之，CRISPR/Cas9系统干扰了LMBV的复制，为水产养殖中预防和控制LMBV提供了有前景的新策略。

引言

大口黑鲈（Micropterus salmoides）是一种具有经济价值的鱼类，在全球范围内广泛养殖。在中国，大口黑鲈的水产养殖业正在迅速发展，2024年的产量约为940万吨（渔业管理局，2025年数据）。然而，近年来由大口黑鲈病毒（LMBV）引起的疾病爆发频率不断增加，死亡率高达60-100%，对大口黑鲈产业构成了严重威胁（Deng等人，2011年；Li等人，2024年）。目前，缺乏高效且特异的LMBV预防和控制措施，迫切需要开发有效的靶向抗病毒策略。

LMBV是一种属于Iridoviridae科、Ranavirus属的包膜双链DNA病毒（Chinchar等人，2017年）。该病毒基因组长度约为100 kb，编码至少86个假定的开放阅读框（ORFs），尽管不同菌株之间的具体数量存在差异（Zhang等人，2024年）。这些ORFs的大部分功能尚未明确，其中许多是Iridoviridae科特有的（Grayfer等人，2012年；Zhao等人，2023年）。传统的抗病毒方法，如常规疫苗和化学治疗药物，主要通过刺激或依赖宿主免疫反应来抑制病毒复制，往往无法直接作用于病毒基因组本身。相比之下，基于CRISPR的可编程核酸靶向系统通过直接靶向并降解感染细胞内的病毒基因组，提供了高效的抗病毒效果（Baddeley和Isalan，2021年）。CRISPR技术相比漫长且成本高昂的传统药物开发方法的一个关键优势在于，它能够仅根据病毒序列信息快速设计引导RNA（gRNAs）。通过将gRNAs导向保守区域或同时导向多个基因组位点，可以显著降低病毒逃逸的风险（Bagchi等人，2022年；Hussein等人，2023年；Stone等人，2021年；Wang等人，2015a，Wang等人，2015b）。此外，CRISPR介导的抗病毒干预即使在感染后使用也显示出有效性，提供了更宽的治疗窗口（Blanchard等人，2021年；Chaves等人，2024年；Keng等人，2023年）。

CRISPR/Cas系统在多种抗病毒应用中显示出广泛的前景。针对DNA的CRISPR/Cas9已成功应用于多种DNA病毒，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）（McLaurin等人，2024年）、乙型肝炎病毒（HBV）（Yao等人，2024年）、Epstein–Barr病毒（EBV）（Sugiokto和Li，2024年）以及多种植物DNA病毒（Ali等人，2015年；Tripathi等人，2019年）、非洲猪瘟病毒（ASFV）（Hübner等人，2018年）和马立克病病毒（MDV）（Zhang等人，2018年）。同样，针对RNA的Cas13系统在对抗RNA病毒方面也取得了显著效果，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）（Blanchard等人，2021年；Hussein等人，2023年；Zeng等人，2022年）、流感病毒（IV）（Freije等人，2019年）、甲型流感病毒（IAV）（Challagulla等人，2021年）和登革热病毒（DENV）（Basu等人，2024年），显示出强大的广谱抗病毒潜力。在水产养殖领域，CRISPR技术也被越来越多地用于病毒控制。例如，据报道，Cas9介导的对鲤疱疹病毒3（CyHV-3）关键基因的编辑可减少约90%的病毒复制并显著提高细胞存活率（Zhao等人，2015年）；针对虾的白斑综合征病毒（WSSV）的关键基因的编辑同样抑制了病毒增殖并激活了宿主免疫反应（Pudgerd等人，2024年），从而延长了宿主存活时间。此外，Cas13d/CasRx系统对水生RNA病毒（如神经坏死病毒（NNV）（Wang等人，2021年）、Micropterus salmoides弹状病毒（MSRV）（Yang等人，2025年）和Siniperca chuatsi弹状病毒（SCRV）（Yu等人，2025年）也显示出有效性，降低了病毒载量并减轻了细胞病变效应，这表明RNA靶向CRISPR抗病毒方法在水产养殖中的可行性。尽管取得了这些进展，但LMBV基因组相对较大且组成复杂，目前尚不清楚基于CRISPR的策略是否能够有效应用于LMBV的控制。

为了解决这一问题，本研究旨在探讨CRISPR/Cas9系统针对LMBV的潜力。我们从LMBV基因组中选择了六个与复制相关的基因来设计靶向sgRNA，这些基因包括拟肉豆蔻酰化膜蛋白（MMP）、DNA依赖性RNA聚合酶α亚基（DnRp-a）、DNA聚合酶样蛋白（DNAPol）、DNA修复蛋白RAD2（RAD2）、AAA-ATP酶（ATPase）和主要衣壳蛋白（MCP）（Chinchar等人，2017年；Grayfer等人，2012年；Zhao等人，2023年）。首先使用荧光报告系统在鱼细胞中验证了这些sgRNA的靶向效率。随后，通过测量相对LMBV基因组表达水平和病毒拷贝数、观察细胞病变效应（CPE）以及进行病毒滴度测定，评估了候选sgRNA及其相应靶点的抗病毒效果。最后，研究了CRISPR/Cas9系统对LMBV的体内效果。这些结果为开发针对LMBV和其他鱼类DNA病毒的具体抗病毒干预措施提供了理论基础和技术支持。

章节片段

病毒、细胞系和鱼类

本研究中使用的大口黑鲈病毒（LMBV）菌株（NCBI登录号：ON936874.1）最初是从自然感染的大口黑鲈中分离、鉴定并纯化的（Yang等人，2024年）。Epithelioma papulosum cyprini（EPC）细胞由Zeng Lingbing教授（中国武汉长江渔业研究所）提供。EPC细胞在M199培养基（Gibco，美国）中培养，补充了10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL...

CRISPR/Cas9系统能够特异性地靶向EPC细胞中的病毒基因组

为了验证所设计sgRNA的靶向特异性和CRISPR/Cas9系统的功能，我们开发了一种基于同源重组的荧光报告实验（图2B）。对于每个选定的目标基因，选择了一个代表性的sgRNA来构建sgRNA-Cas9表达载体及其相应的报告质粒。EPC细胞同时转染了单个sgRNA-Cas9表达载体及其匹配的报告质粒。

讨论

CRISPR/Cas系统是一种能够特异性识别和切割基因组的适应性基因编辑工具，已成为研究病毒感染机制和开发抗病毒策略的强大平台。通过指导序列特异性的病毒基因组切割，CRISPR系统可以阻止复制、抑制转录或切除整合的proviral DNA，这在针对多种病毒的研究中得到了证实（Ali等人，2015年；Blanchard等人，2021年；Freije等人，2019年；

结论

总之，本研究开发了一种针对LMBV的CRISPR/Cas9系统，在体外显著抑制了病毒复制并减少了病毒引起的细胞病变。我们的数据强调了...

目标选择的重要性，表明破坏关键复制酶比靶向结构基因具有更强的病毒抑制效果。体内实验显示疾病进展延缓，宿主存活率有所提高，尽管保护效果较为温和，

CRediT作者贡献声明

何瑞龙：撰写——原始草稿，研究，数据分析。何茂生：撰写——原始草稿，概念构思。姜新元：验证，方法学。王毅旺：软件，资源准备。郝亮：数据整理。卜向义：可视化，研究。徐坤：方法学，研究。凌飞：撰写——审稿与编辑，概念构思。王高学：监督，概念构思。江海峰：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：U24A20464）和甘肃省农业农村厅种子产业突破项目（项目编号：ZYGG-2025-18）的联合支持。

Barrangou等人，2015年

Jinek等人，2012年

Karpov等人，2022年

Luther等人，2018年

Makarova等人，2011年

Qin等人，2023年

Yao等人，2024年

Zhao等人，2020年

作者声明与本研究工作无关的任何商业或关联利益冲突。

致谢

我们感谢西北农林科技大学的水生动物疾病预防和控制实验室团队在动物饲养方面提供的宝贵支持。