数字PCR检测方法可用于量化鲑鱼养殖沉积物中不同环境质量梯度下的细菌生物指标

《Aquaculture》：Digital PCR assays quantify bacterial bioindicators across environmental quality gradients in salmon aquaculture sediments

马什希德·奥拉迪 | 托尔斯滕·斯托克
莱茵兰-普法尔茨凯泽斯劳滕-兰道工业大学，生态学小组，德国凯泽斯劳滕

**摘要**
海洋鱼类养殖设施下有机物质的富集改变了底栖生态系统结构和沉积物生物地球化学特性，形成了明显的环境梯度，这需要有效且可扩展的监测工具。高通量测序揭示了鲑鱼养殖场下方底栖细菌群落与有机富集之间的关联，但监管实施仍受到测序数据组成特性的限制。相对读数丰度并不能直接证明候选指示菌类是否沿影响梯度发生绝对数量变化，从而限制了它们作为定量决策支持工具的应用。本文测试了基于测序的细菌生物指示物是否能在实际养殖条件下反映可测量的丰度变化。我们使用针对特定细菌扩增子序列变体（ASVs）的数字PCR（dPCR）方法，在多个苏格兰鲑鱼养殖场进行了研究，这些养殖场的生态质量由底栖生物质量指数（Infaunal Quality Index）定义。随着有机富集程度的降低，与富集相关的菌类数量显著减少，而与参考菌类相关的指示特征则在较不富集的环境中增加。这些丰度-质量关系在各个养殖场中一致，并与氧化还原结构化的沉积物演替过程相符，表明基于测序的指示物反映了真实的种群变化，而不仅仅是相对的群落动态。因此，靶向dPCR为微生物群落分析与定量海洋养殖影响评估之间提供了实用的桥梁。

**1. 引言**
海洋鱼类养殖，尤其是鲑鱼养殖，通过持续向生产笼子下方和周围沉积有机物质及相关营养物质，对底栖生态系统施加了强烈的空间压力。这些输入导致沉积物中形成了明显的富集梯度，进而驱动底栖生态系统结构和沉积物生物地球化学特性的可预测变化（Brooks和Mahnken，2003；Hargrave等人，2008；Cranford等人，2022）。随着有机负荷的增加，微生物呼吸作用加剧，减少了氧气渗透深度，促使表层沉积物从氧化状态逐渐转变为亚氧化甚至硫化状态，从根本上重新组织了底栖群落和氧化还原敏感的生物地球化学过程（Holmer等人，2005）。鉴于这种氧化还原重构的生态后果，许多国家的监管框架要求对鲑鱼养殖场周围的沉积物进行常规生物监测，以评估环境状况、确保符合环境质量标准并减轻生态退化（Wilson等人，2009）。

传统上，鲑鱼养殖场周围的底栖生物监测基于宏观动物群落指数，这些指数量化了沿有机富集梯度的沉积物条件变化（例如，Mirto等人，2012；Stojanovi?等人，2017；Bouchet等人，2020）。其中心是AZTI海洋生物指数（AMBI），该指数根据物种对有机干扰的敏感性对菌类进行分类（Borja等人，2000）。结合物种丰富度和均匀性测量，AMBI构成了评估海洋底栖环境生态状况的综合指数的基础（Muxika等人，2007）。这些综合指数可以进一步整合到底栖生物质量指数（IQI）中，后者是确定鲑鱼养殖场生态质量（EQ）状态的主要监管指标，并支持常规的环境合规性评估（Culhane等人，2014）。尽管这些指数被广泛使用且具有悠久的监管记录，但在集约化鲑鱼养殖背景下，它们存在实际限制，包括高昂的分析成本、劳动密集型处理过程以及较长的周转时间，这些因素限制了时间分辨率（Pawlowski等人，2018）。此外，这些指数基于存在-丰度数据，可能对微妙或早期的群落变化不够敏感。在这种情况下，环境DNA（eDNA）宏条形码技术的最新进展作为一种补充方法出现，能够直接从沉积物DNA中快速、高通量地表征底栖群落，包括那些难以通过形态学方法检测到的菌类（Pochon等人，2015；Pawlowski等人，2016；Stoeck等人，2018；Pearman等人，2020；He等人，2021）。其中，通常从16S rRNA基因获得的细菌宏条形码对养殖沉积物中的有机富集梯度表现出特别强且可重复的反应，支持比其他生物群体更准确的生态质量推断（Dowle等人，2015；Keeley等人，2018；Stoeck等人，2018；Verhoeven等人，2018；Aylagas等人，2021；Frühe等人，2021b；Wilding等人，2023；Oladi等人，2024）。结合回归样条分析（Keeley等人，2018）或监督机器学习（Leontidou等人，2023；Rubel等人，2025；Wyness等人，2026）等统计方法的细菌宏条形码分析已成功用于推断已建立的宏观动物群落指数，并分类生态质量状态。

除了相对丰度模式外，靶向细菌指示物还为加强底栖海洋监测框架提供了一种可转移的、基于机制的方法。

**2. 材料与方法**
2.1. 引物和dPCR检测设计
用于检测鲑鱼养殖引起的底栖有机物质富集的候选细菌指示ASVs选自之前的研究（Rubel等人，2025）。选择这项研究是因为它结合了宏基因组学和宏条形码技术，识别了苏格兰近场和远场鲑鱼养殖设施中的细菌指示物，从而提供了一组与本研究系统相关的稳健且经过交叉验证的候选菌类。根据包括指示值分析和随机森林分类在内的多种统计方法的一致排名，选择了这些指示ASVs（详见Rubel等人，2025）。从候选列表中，我们选择了与高影响（高有机富集）条件持续相关的最高排名菌类（补充表S1）。这些菌类被鉴定为Sulfurovum sp.和Cytophaga sp.（分别为ASVs 04和22，见Rubel等人，2025）。此外，作为对照，我们还包括了一种对有机富集高度敏感的指示菌，即Desulfuromonadaceae科的未鉴定细菌物种（ASV 24，见Rubel等人，2025）。这些目标菌类被用作概念验证的ASV集，以评估基于测序的细菌指示物是否可以通过dPCR转化为定量、绝对的丰度测量，而不仅仅是一个提议的最小监测面板。

对于PCR引物设计，首先使用NCBI BLAST网络界面（访问于2025年8月）通过基本局部比对搜索工具（BLAST）分析（Camacho等人，2009）来识别与目标ASVs具有≥99%序列相似性的密切相关参考序列。然后使用NCBI Primer-BLAST（Ye等人，2012）将这些完整参考序列作为模板设计引物，该工具结合Primer3生成引物和BLAST进行计算机模拟特异性评估（Untergasser等人，2012）。设计参数包括目标引物长度约为20 bp（范围18–24 bp）、熔解温度60 ± 3°C、GC含量40–60%，以及适合dPCR分析的预期扩增子大小100–180 bp。引物特异性针对NCBI核心核苷酸数据库进行评估，搜索范围限制在细菌序列内，并排除了可能在目标分类群外扩增的引物对。对于每个ASV，我们根据预测的最高特异性、低自我互补性、覆盖目标序列的不同区域以及适合dPCR的最佳PCR产物大小选择了引物对（表1）。引物由Biomers GmbH（德国乌尔姆）合成。

**表1. 三种指示细菌ASV的设计引物对及其检测特性**
| 目标 | 正向引物（5′- > 3′） | 反向引物（5′- > 3′） | Tm (F/R) | GC % (F/R) | 扩增子长度 (bp) |
|------|--------------|--------------|-----------|-----------|------------|
| ASV04 | TAAACATTCCGCCTGGGGAGGCACCTCTCCATCTCTGGTG | 59.75/59.82 | 55/60 | 158 |
| ASV22 | GCGTTTGTAACCTACCCTTTAACTAGCCGTTACCTCACCAACTA | 59.24/58.36 | 41.67/50 | 151 |
| ASV24 | AGAACGAACGTTGGCGGTATGAGGGCGTAGGCTTATCAGG | 60.04/59.68 | 50/60 | 165 |

2.2. 引物验证和特异性测试
首先使用终点PCR评估候选引物对的扩增性能和特异性。PCR反应使用OneTaq? DNA聚合酶（New England Biolabs，美国）进行，模板材料为使用DNeasy PowerSoil Kit（Qiagen）从苏格兰鲑鱼养殖场沉积物样本中分离的环境DNA提取物。每个反应包含10 μl 5× Standard Taq-Polymerase Buffer、2 μl正向引物（4 μM）、2 μl反向引物（4 μM）、0.25 μl 5 U Taq聚合酶和1 μl dNTPs，总反应体积为50 μL。所有反应都包含无模板DNA的阴性对照。热循环条件包括初始变性步骤94°C 30秒，随后是30个循环：94°C 30秒、52°C 30秒、68°C 30秒，最后在68°C下延伸5分钟。为了确定后续dPCR分析的最佳退火条件，在51–67°C的温度范围内进行了梯度PCR。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳（1.5% w/v琼脂糖，1× TAE缓冲液，90 V下20分钟）进行可视化，使用100 bp DNA梯子（New England Biolabs，美国）作为大小标准，以确认预期的扩增子大小并评估特异性。成功扩增的产物（在琼脂糖凝胶上呈现清晰且大小正确的目标条带）使用MinElute PCR Purification Kit（Qiagen，德国）进行纯化，以进一步验证引物性能。

为了验证候选引物对的特异性，将PCR扩增产物克隆并使用Sanger测序。扩增产物连接到pGEM?-T Easy载体（Promega，美国）中，并按照制造商的说明转化到感受态大肠杆菌细胞中。阳性克隆通过使用通用M13正向（5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′）和M13反向（5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）引物的菌落PCR进行筛选。PCR反应使用OneTaq? DNA聚合酶（New England Biolabs，美国）按照上述制造商的协议和热循环条件进行，产物通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。选择产生单个与预期插入片段大小相符的菌落的克隆，使用Monarch's Plasmid Miniprep Kit（NEB，马萨诸塞州伊普斯威奇）进行质粒纯化。获得的序列通过Sanger测序（StarSEQ，美因茨，德国）进行确认，并与目标ASV序列比对以验证身份，代表性序列还使用BLAST与NCBI核苷酸数据库进行比较，以评估目标特异性。

2.3. 数字PCR检测优化
dPCR分析使用QIAcuity Nanoplate Digital PCR系统（Qiagen，德国）进行，每个26孔纳米板大约产生26,000个分区。dPCR反应使用含有ASV特异性引物的QIAcuity EvaGreen Mastermix（最终浓度0.4 μM）进行，并按照制造商的说明进行分析。所有实验中都包括非模板对照，以监测潜在污染。

使用合成DNA模板和环境DNA提取物进行了退火温度优化。含有目标扩增子序列的合成双链DNA片段（gBlocks；Integrated DNA Technologies，美国）用于在受控条件下建立检测性能。用于检测优化和分析验证的合成DNA模板的序列和特性见补充表S2。评估了52至64°C的温度梯度，以最大化扩增效率并实现阳性与阴性分区之间的清晰分离。58.5°C的退火温度为所有三个保留的检测提供了最佳的扩增效率和清晰的分区分离。这些条件随后通过使用代表性的eDNA提取物进行了验证，以确保在沉积物来源的基质中检测性能的稳健性。同样，使用合成目标DNA（gBlocks）评估了经过验证的引物的分析性能。gBlocks按照制造商的说明重新配制，并制备了系列稀释液，以生成覆盖广泛目标浓度的模板。预期拷贝数是根据片段长度和DNA质量使用阿伏伽德罗常数（6.022 × 10^23 mol^-1）计算得出的。检测限（LOD）和定量限（LOQ）是使用合成目标DNA的重复稀释系列经验性地确定的。在优化的检测条件下分析了系列稀释液（1:5），每个稀释液进行十次技术重复。拷贝数从仪器输出中获得，并表示为每次反应的拷贝数。对于每个稀释水平，检测率计算为至少产生一个阳性分区的技术重复的比例。LOD定义为在至少一次技术重复中检测到的最低目标浓度（Klymus等人，2019年）。通过计算每个稀释水平下测量拷贝数的变异系数（CV）来评估定量精度。LOQ定义为定量精度满足预定义的接受标准CV ≤35%的最低浓度，这与常用的dPCR检测验证阈值一致（Klymus等人，2019年）。

2.4. dPCR检测在环境样本中的应用
2.4.1. 本研究中使用的样本
本研究的沉积物样本来源于苏格兰鲑鱼养殖场的合规性调查，之前在Wyness等人（2026年）中有描述。采样遵循苏格兰环境保护局（SEPA，2023年）发布的标准化操作协议。使用Van Veen抓斗在相对于生产笼子的近场和远场位置进行采样。对于每次抓取，将六个表面沉积物刮取物（每个抓斗两侧各三个）合并到一个无菌试管中，用于eDNA分析。本研究中使用的样本来自单个调查时间点，每个抓取样本在后续分析中被视为一个独立的观察值。
在这个案例研究中，选择了高地地方当局内的三个养殖场的样本，以覆盖基于底栖动物质量指数（IQI）值的EQ梯度（表2）。样本涵盖了低（<0.44）、中等（~0.64）和高（>0.75）的IQI值，代表了用于分析目的的聚合监管EQ状态类别（Culhane等人，2014年），分别对应于高、中等和低水平的底栖有机富集。对于每个养殖场，从每个EQ类别中选择了两个独立样本，总共得到18个样本。IQI分数来自Wyness等人（2026年），其中IQI作为EQ状态的衡量标准是根据这些样本的底栖大型动物清单和沉积物特征通过标准监管程序确定的（Phillips等人，2014年；UKTAG，2014年）。

表2. 用于苏格兰鲑鱼养殖场ASV指标数字PCR验证的沉积物样本概述。显示了采样日期、环境质量（EQ）类别和相应的底栖动物质量指数（IQI）值。IQI值来自Wyness等人（2026年），其中EQ状态是根据这些样本的底栖大型动物群落和沉积物特征确定的。

Loch Torridon
Loch Kishorn
Loch Sunart
采样日期
EQ类别
IQI
采样日期
EQ类别
IQI
采样日期
EQ类别
IQI
2023年1月
低
0.17
2023年9月
低
0.30
2022年3月
低
0.13
0.21
0.38
0.18
中等
0.50
中等
0.66
中等
0.55
0.67
0.62
高
0.81
高
0.85
高
0.77
0.86
0.90
0.86

Rubel等人（2025年）和Wyness等人（2026年）使用的数据集是可比的，因为它们都来源于苏格兰大西洋鲑鱼养殖场下方和周围的海洋沉积物，并代表了类似的有机富集和生态质量梯度。虽然各个地点的局部沉积物特征、水动力条件和农场管理方式可能有所不同，但两项研究都突出了与有机负荷相关的相同的基本生态过程，包括氧化还原驱动的沉积物重构。因此，使用独立的数据集进行验证可以稳健地测试Rubel等人（2025年）识别的基于测序的细菌指标是否可以在不同地点和环境背景下转移。

2.4.2. 环境样本中细菌目标的数字PCR定量
使用在优化过程中确定的特定检测条件对环境DNA提取物中的指示性ASVs进行了定量（见2.3节）。环境样本在三个技术重复中进行分析，并在所有运行中包括非模板对照以监测污染。DNA模板浓度标准化为1 ng μL^-1，使用Quantus荧光计（Promega，美国）进行定量，以确保反应间DNA输入的一致性并最小化与沉积物来源DNA提取物相关的变异性。反应的最终体积为40 μL，包含QIAcuity EvaGreen Mastermix（13.3 μL）、ASV特异性引物（最终浓度0.4 μM）、模板DNA（1 μL，浓度为1 ng μL^-1）以及补足体积的无核酸酶水。然后将纳米板密封并在QIAcuity One平台上运行，热循环条件包括初始酶激活步骤95°C 2分钟，随后是40个循环的变性95°C 15秒，退火58.5°C 15秒，最终延伸步骤72°C 15秒，以及最终冷却40°C 5分钟。在数据处理过程中评估了重复一致性及分区聚类，以评估扩增性能并识别潜在的抑制效应。扩增后，使用250 ms的曝光时间和3的增益设置，在绿色荧光通道中对纳米板进行成像，以检测EvaGreen?信号。

扩增后，使用QIAcuity分析软件和自动阈值识别阳性和阴性分区。目标浓度通过平台的标准分析流程使用泊松统计计算得出。结果表示为每次反应的基因拷贝数（对应于1 ng输入DNA），以便在样本和环境质量类别之间进行后续比较。

2.5. 统计分析
在分析之前，dPCR技术重复在样本水平上进行了平均。没有观察到失败的反应。基于重复拷贝数估计的离散度评估了重复变异性，这在样本间通常较低，表明扩增是一致的。在平均之前没有应用系统的异常值去除。目标拷贝数表示为每次反应的基因拷贝数，并进行了log10转换（log10[x + 1]）以改善正态性和方差同质性。使用Spearman等级相关性评估了ASV拷贝数与连续IQI值之间的关联。为了量化ASV丰度与环境质量之间的关系，同时考虑了地点效应，拟合了以log转换后的拷贝数为响应变量、IQI和农场为固定因素的线性模型。为了评估不同农场之间的ASV–IQI关系是否不同，通过F检验（ANOVA）比较了包含和不包含交互作用的模型。使用Jonckheere–Terpstra趋势检验（Jonckheere，1954年；Terpstra，1952年）评估了有序环境质量类别之间的差异。类别间的效应大小总结为低质量和高质量沉积物之间ASV拷贝数的中位数倍数变化。当分析多个ASV时，使用Holm方法（Holm，1979年）调整了p值，以考虑多重检验并控制由于测试的假设数量较少而导致的家族错误率。

所有统计分析均在R v.4.3.1（R Core Team，2023年）中进行。数据处理和可视化使用tidyverse（Wickham等人，2019年）和ggplot2（Wickham等人，2016年）包完成。Spearman相关性和线性模型使用base R（stats包）实现，有序趋势分析使用DescTools包（Signorell，2025年）完成。p值调整使用stats中实现的Holm方法进行。

3. 结果
3.1. dPCR检测的分析性能（LOD，LOQ）
所有三个经过验证的检测方法在动态范围内都显示出了可靠的检测能力，检测限（LOD）根据目标的不同，范围从10.93到29.27拷贝/反应（表3）。定量限（LOQ），定义为产生定量精度且变异系数（CV）≤35%的最低浓度，范围从10.94到44.41拷贝/反应。

表3. 经过验证的dPCR检测的分析性能特征。
目标
LOD（拷贝/反应）
LOQ（拷贝/反应）
LOQ CV
Sulfurovum sp.
10.93
44.41
0.21
Cytophaga sp.
10.94
10.94
0.26
Desulfuromonadaceae
29.27
29.27
0.06

随着目标浓度的增加，定量精度提高，变异系数（CV）在超过LOQ后急剧下降，并在较高拷贝数时稳定（图1）。对于每个检测方法，LOQ定义了可靠定量的下限，低于此限的变异性增加，检测变得不那么一致。因此，从相关性分析中排除了产生低于检测方法特定LOQ的拷贝数的环境样本，以确保在经过验证的动态范围内评估统计关系。经过基于LOQ的过滤后，Sulfurovum sp.和Cytophaga sp.的所有样本都被保留（n = 18），而Desulfuromonadaceae有四个样本低于LOQ，导致该目标的样本量减少（n = 14）。在这个范围内，所有保留的检测方法在代表现场样本的浓度范围内显示出稳定和可重复的定量。

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图1. 经过验证的dPCR检测在稀释系列中的分析精度。变异系数（CV）与每次反应的预期目标拷贝数（log10刻度）相对应。点代表个别稀释水平（技术重复的平均值），实线表示拟合的平滑曲线。水平虚线标记了预定义的LOQ阈值（CV = 0.35）。垂直虚线表示每个检测方法确定的LOQ对应的浓度。

3.2. 环境样本中ASV拷贝数的定量
所有三个经过验证的检测方法成功地在分析的大多数环境沉积物样本中定量了目标ASVs。在排除了低于检测方法特定LOQ阈值的测量值后，几乎所有样本的拷贝数都保持在经过验证的动态范围内。拷贝数跨越了几个数量级，Sulfurovum sp.的范围是从61.9到16,272.6拷贝/反应，Cytophaga sp.的范围是从94.9到13,247.5拷贝/反应，Desulfuromonadaceae的范围是从3.4到2682.6拷贝/反应。
在不同的EQ类别中观察到了不同的丰度模式。Sulfurovum sp.的拷贝数在低质量沉积物中最高（中位数：6554拷贝/反应，范围：2671–16,273），并向中等（1365；554–2509）和高质量条件（185；62–318）逐渐减少。Cytophaga sp.也观察到了类似的趋势，其中中位数拷贝数从低质量沉积物中的5250拷贝/反应（范围：1662–13,248）下降到中等和质量高质量沉积物中的886（327–1205）和164（94.9–292）。相比之下，参考相关的Desulfuromonadaceae表现出相反的模式，在受影响的沉积物中拷贝数最低（中位数：12.7；范围：3.41–139），在中等条件下增加到654（33.1–1144），在高质量沉积物中达到最高丰度（中位数：2082；范围：464–2683）。图2以log10刻度显示了EQ类别间的拷贝数分布，以便于观察动态范围。

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图2. 不同环境质量类别（低、中等、高EQ）中log10转换后的ASV拷贝数分布。点代表按农场着色的单个样本。箱形图总结了中位数和四分位数范围。这些模式对应于Jonckheere–Terpstra检验检测到的显著单调趋势。

在不同的EQ类别中观察到了不同的效应大小。Sulfurovum sp.的中位数拷贝数在低质量沉积物中大约是高质量沉积物的35倍（6554对比185拷贝/反应）。同样，Cytophaga sp.在低IQI条件下增加了约32倍（5250对比164拷贝）。相比之下，Desulfuromonadaceae显示出相反的模式，在高质量沉积物中的中位数丰度大约是受影响地点的160倍（2082对比12.7拷贝）。

3.3. ASV丰度与环境质量之间的关系
使用dPCR对指示性ASVs的绝对定量显示了与所有研究地点的IQI值之间存在强烈且高度显著的关系（图3）。使用所有样本（每个ASV n = 18），经过Holm校正后，Spearman等级相关性显示了所有三个目标的所有显著单调关系（Sulfurovum sp.：ρ = ?0.920，pHolm < 0.0001；Cytophaga sp.：ρ = ?0.930，pHolm < 0.0001；Desulfuromonadaceae：ρ = 0.874，pHolm < 0.0001）。为了评估这些关系是否受到接近定量限的测量值的影响，在排除了低于检测方法特定LOQ的环境测量值后重复了相关性分析。LOQ过滤并没有显著改变富集相关关系的强度（Sulfurovum sp.：ρ = ?0.920，pHolm < 0.0001；Cytophaga sp.：ρ = ?0.930，pHolm < 0.001；n = 18）。对于Desulfuromonadaceae，与IQI的正相关在LOQ过滤后仍然显著，但强度降低（ρ = 0.758，pHolm = 0.001；n = 14）。

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图3. log10转换后的ASV拷贝数与IQI值之间的关系。点代表按农场着色的单个沉积物样本。所有量化的样本都显示出来以便可视化。线条表示带有95%置信区间的线性回归拟合。线性模型拟合到log转换后的拷贝数，证实了这些模式。IQI解释了ASV丰度的大部分方差（R2 = 0.899–0.945）。Sulfurovum sp.和Cytophaga sp.显示出随着IQI增加的显著负斜率（β = ?2.629和?2.337；pHolm = 2.66 × 10^-8和1.24 × 10^-8），而Desulfuromonadaceae显示出显著的正斜率（β = 3.160；pHolm = 1.66 × 10^-9）。将农场作为固定因素并未显著改变模型的拟合度，且IQI与农场之间的交互作用项对任何ASV均不显著（pHolm ≥ 0.392），表明没有检测到特定地点的斜率差异。与这些模式一致，ASV的拷贝数在不同EQ类别间存在显著差异。Jonckheere–Terpstra检验发现所有三种ASV均存在显著的有序趋势（pHolm ≤ 0.001），证实了ASV丰度与EQ类别之间的单调关系。

4. 讨论
4.1. 与富集和参考相关的细菌ASV的生态合理性
鲑鱼养殖网箱下的有机富集不仅增加了微生物生物量（Dowle等人，2015年），还沿着可预测的生物地球化学轨迹重新组织了底栖群落。持续沉积的有机物加剧了微生物的呼吸作用，逐渐耗尽氧气，改变了电子受体的可用性，并使沉积物从氧化状态转变为亚氧化状态，最终变为硫化状态（Holmer等人，2005年；Frühe等人，2021b年；Johansen等人，2024年）。这种氧化还原演替重新组织了微生物功能群落，有利于适应电子受体级联中特定位置的物种（Dowle等人，2015年；Vasquez-Cardenas等人，2022年）。此处验证的ASV占据了这一连续体中的不同生态位，为它们在EQ梯度上的指示行为提供了机制解释。
与Sulfurovum属（Campylobacterota，以前属于Epsilonproteobacteria；Waite等人，2017年）相关的细菌ASV在低IQI条件下明显富集，并且随着EQ的升高而相对丰度下降。Sulfurovum成员是化能自养的硫氧化细菌（Pettersen等人，2022年），能够利用氧气或硝酸盐作为最终电子受体来氧化硫化物和硫代硫酸盐等还原性硫化合物（Hamilton等人，2014年；Aranda等人，2015年）。与这种生态特征一致，据报道Sulfurovum及其相关的Sulfurovaceae在鱼类养殖设施下以及其他富含有机物的沿海环境中大量繁殖，这些环境的特点是有机负荷高且还原性硫物种积累（Aranda等人，2015年；Choi等人，2018年；Choi等人，2022年；Pettersen等人，2022年）。它们与动态氧化还原界面和耦合的铁-硫循环的关联使它们成为富集驱动的地球化学梯度的特征性居民（Choi等人，2022年）。与这些生态预期一致，Rubel等人（2025年）检查的几乎所有宏基因组和代谢组测序数据集中，Sulfurovaceae都作为富集相关的指示菌出现，这强调了这一分类群作为有机影响信号的稳健性。这些观察表明，在低IQI条件下，Sulfurovum属的富集相关反应与有机输入增加、厌氧矿化增强以及受影响养殖场沉积物中硫化物产生增加在生态上是连贯的。
同样，被归类为Cytophaga属的ASV在低质量沉积物中的拷贝数明显较高，并且随着生态状态的提高而减少。Cytophaga成员是分解溶解性和颗粒有机物的异养菌，包括几丁质和蛋白质等聚合物（Cottrell和Kirchman，2000年；W?rner和Pester，2019年）。它们在鱼类养殖场下和富含有机物的沿海系统中的富集已有充分记录（Vezzulli等人，2002年；Danovaro等人，2003年；Bissett，2004年；Kawahara等人，2009年；Verhoeven等人，2018年）。因此，它们在低IQI条件下的增殖与来自未食用饲料和粪便沉积物的易分解有机底物的增加是一致的，这些底物已知会刺激富集沉积物中的异养微生物活动（Hargrave等人，2008年；Holmer等人，2005年）。结合之前关于鱼类养殖场下Cytophaga富集的观察，Cytophaga属拷贝数与EQ之间的负相关关系支持其作为富集响应细菌指示菌的适用性。
相比之下，与Desulfuromonadaceae科相关的细菌ASV在分类为高EQ的沉积物中丰度较高，并且随着受影响程度增加和IQI降低而减少。该科成员通常与在亚氧化到缺氧条件下运行的铁和硫还原代谢相关，其分布受到替代电子受体可用性的强烈影响（Guo等人，2021年；Soares等人，2024年）。实验和现场研究表明，这类物种通常占据在完全由硫酸盐还原菌主导的硫化条件建立之前的中间氧化还原生态位（Cord-Ruwisch等人，1988年；Nguyen-tiêt等人，2025年）。在养殖场富集梯度内，参考沉积物可能维持更广泛的亚氧化区域，支持铁和硫还原群落，而靠近网箱的沉积物则倾向于向硫化主导的地球化学状态发展。在这种条件下，典型的硫酸盐还原菌往往会成为主导，可能限制Desulfuromonadaceae种群的发展。因此，此处观察到的Desulfuromonadaceae与IQI之间的正相关性与有机负荷强度相关的氧化还原分层一致，而不是与干扰本身相关。这种依赖于环境的行为有助于解释文献中的矛盾报告，即在某些系统中Desulfuromonadaceae在未受干扰的沉积物中被富集（Dowle等人，2015年；Aylagas等人，2017年；Frühe等人，2021b年），但在其他有机影响的环境中也被检测到（Elsabé等人，2012年；Aranda等人，2015年）。总体而言，这些发现表明，Desulfuromonadaceae应谨慎解释为参考相关的指示菌，因为它们的方向性似乎取决于局部沉积物的生物地球化学和氧化还原分区。
基于此处评估的三种指示菌的已建立生态特性，以及它们之前在与鲑鱼养殖相关的近场和远场沉积物中的分布，可以得出结论，使用我们定制的dPCR检测方法量化的绝对16S rRNA基因丰度与这些指示菌的预期相对丰度分布完全一致。这些结果证实了观察到的定量信号与已知的生态行为一致，从而验证了（i）dPCR检测方法的有效性，以及（ii）这些ASV作为底栖环境中有机富集的稳健指示菌的适用性。

4.2. 从相对信号到定量生态指示菌
鉴于这些ASV在氧化还原连续体上占据明确的生态位置，它们的指示价值应表现为超出比例测序信号可检测的绝对种群变化。尽管高通量测序从根本上重塑了水产养殖的生物监测（例如，Dowle等人，2015年；Keeley等人，2018年；Laroche等人，2018年；Stoeck等人，2018年；Cordier，2020年；Wilding等人，2023年；Oladi等人，2024年；Wyness等人，2026年），并且代谢组测序和宏基因组衍生的ASV反复作为EQ的强预测因子出现（Verhoeven等人，2018年；Frühe等人，2021a年；Rubel等人，2025年），但这些关联本质上是组成性的（Gloor等人，2017年）。通过将dPCR应用于序列衍生的候选菌，本研究提供了直接证据，证明这些基于序列的信号对应于细菌丰度的定量变化。与富集相关的物种随着沉积物质量的改善而绝对拷贝数减少，而与参考相关的ASV则随着IQI条件的提高而增加。这些单调关系在整个梯度上都很强，并解释了沉积物状况的很大一部分变异。关键的是，这些反应的方向和幅度在各个养殖场之间是一致的，表明观察到的模式不是特定地点群落结构的产物，而是反映了与有机富集相关的更广泛的生态过程。
绝对量化加强了细菌指示菌的生态解释。它证实了在代谢组测序和宏基因组框架中识别的预测性ASV（Rubel等人，2025年）不仅仅是受相对丰度限制的统计相关性，而是代表响应富集驱动的生物地球化学演替而扩张或收缩的种群。dPCR并不取代测序作为发现平台；相反，它将基于序列的候选菌转化为标准化的、可转移的测量值，这些测量值不受文库大小变化和扩增偏差的影响（Borchardt等人，2021年）。通过这种方式，它在生态理解和监管应用之间建立了直接桥梁。

4.3. 生态背景和方法学考虑
尽管此处观察到的定量关系在各个养殖场之间是一致的，但细菌指示菌本质上嵌入在沉积物的生物地球化学中。有机富集不会产生一个统一的终点；相反，它沿着由水动力、沉积物颗粒大小、氧气渗透深度和生产阶段决定的轨迹驱动系统（Robinson等人，2016年；Shi等人，2021年；Oladi等人，2026年）。因此，指示菌不仅对富集强度作出反应，还对氧化还原区的空间配置作出反应（Robinson等人，2016年；Shi等人，2021年）。对于像Desulfuromonadaceae这样具有多种代谢能力的群体来说，这种依赖性尤为明显，因为它们能够进行细胞外电子转移并使用不溶性电子受体，从而占据多个氧化还原生态位（Guo等人，2021年；Soares等人，2024年）。绝对量化澄清了种群水平的反应，但并不消除在它们的地球化学环境中解释指示菌的必要性。
除了生态变异性之外，还有几个方法学问题需要考虑。dPCR量化的是基因拷贝数而不是细胞计数，基因组之间的拷贝数变化可能会引入与生物量无关的比例差异。此外，细胞外DNA的持久性和提取效率的变化可能会影响测量浓度，特别是在细粒或富含有机物的沉积物中（Corinaldesi等人，2005年）。尽管标准化的DNA输入和基于稀释的检测验证减少了分析变异性，但它们不能完全解决这些不确定性来源。因此，定量细菌指示菌应被视为稳健的生态代理指标，而不是微生物生物量的直接测量。
除了这些方法学考虑之外，在解释结果的更广泛适用性时还应考虑本研究的范围。该研究集中在相对较少的目标ASV和来自单一地理区域内多个养殖场的样本上，允许在一致的环境框架下进行稳健的概念验证，但在更广泛的环境设置和生产系统中进一步评估将有助于评估其普遍性。虽然选定的指示菌与生态质量显示出一致的定量关系，但它们的生态解释仍然依赖于特定环境背景和局部沉积物的生物地球化学及氧化还原结构。此外，由于dPCR量化的是基因拷贝数而不是直接微生物生物量，定量变化应解释为与富集相关的群落重组的生态代理指标。最后，本研究代表了一种横断面评估，未来的时间序列分析将跨越生产周期和休耕期，这对于评估这些指示菌在动态养殖条件下的时间稳定性和预测稳健性至关重要。

5. 结论
通过从相对序列信号转向绝对量化，本研究证明了选定的细菌ASV可以作为鲑鱼养殖场沉积物中有机富集的可测量生态指示菌。经过验证的目标在独立养殖场中表现出一致的、与梯度对齐的丰度响应，表明基于测序的指示菌反映了与有机富集沉积物的氧化还原重组相关的真实种群变化，而不仅仅是组成上的伪影。通过这种方式，这项工作在高分辨率微生物群落分析和操作生物监测之间建立了实用的桥梁，表明目标dPCR检测方法可以将生态知识转化为标准化、可转移的测量值，以评估受养殖影响下的底栖条件。
除了概念验证之外，这些发现为扩展指示菌面板和将定量细菌指标整合到结构化的水产养殖影响评估工作流程中提供了可扩展的基础。随着在不同环境设置和生产周期中的持续验证，这些方法为快速、经济高效地评估底栖条件提供了现实途径，这种评估基于生态过程。在这种情况下，定量细菌指标有潜力加强受养殖影响的沉积物的海洋环境监测框架。

作者贡献：
CRediTMahshid Oladi：数据管理、正式分析、调查、方法学、可视化、初稿撰写、审稿和编辑；
Thorsten Stoeck：概念化、资金获取、方法学、项目管理、监督、资源管理、验证、审稿和编辑。

关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明：
在准备这项工作时，M.O.使用了ChatGPT-5.5来提高可读性和语言表达。使用该工具后，她根据需要审查和编辑了内容，并对最终出版物负全责。

资金：
该项目获得了德国研究基金会（grant STO414/15-2）的财政支持，该资助授予了TS。

未引用的参考文献：
Dully等人，2021年