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背景：内耳对于维持人体感知功能的正常运作至关重要。然而，目前的感知功能重建大多局限于症状缓解，对于不可逆损伤缺乏根治手段。发展治疗内耳疾病的新策略已成为生物医学领域的重大挑战。内耳类器官是一种新兴的研究内耳疾病的新平台，这得益于其高度的仿生特性、个性化潜力、高
背景：内耳对于维持人体感知功能的正常运作至关重要。然而，目前的感知功能重建大多局限于症状缓解，对于不可逆损伤缺乏根治手段。发展治疗内耳疾病的新策略已成为生物医学领域的重大挑战。内耳类器官是一种新兴的研究内耳疾病的新平台，这得益于其高度的仿生特性、个性化潜力、高通量筛选能力和标准化生产。构建仿生的内耳类器官对于理解生理机制和开发新疗法至关重要。然而，目前的内耳类器官构建方法缺乏形态保真度，导致毛细胞（HCs）和螺旋神经节神经元（SGNs）在功能上仍不成熟，无法准确再现正常的内耳生理。因此，探索构建高仿生内耳类器官的策略迫在眉睫。
技术：先进的3D生物打印技术有望实现高保真内耳类器官的构建。与现有方法相比，3D生物打印通过将负载细胞的生物墨水进行精确的空间组装，实现了内耳类器官的高保真构建。
结果：本文探讨了3D生物打印与内耳类器官构建之间的联系。提出了一种用于构建内耳类器官的3D生物打印策略。之后，展望了3D生物打印内耳类器官的未来应用。最后，讨论了使用3D生物打印构建内耳类器官面临的挑战与机遇。
论文主体部分内容总结如下：
1. 引言
内耳功能完整性对生命活动至关重要。感音神经性听力损失（HL）和平衡障碍影响全球大量人口，亟需开发针对内耳的靶向基础研究和治疗工具。当前对内耳的理解主要基于细胞模型和动物模型，但细胞模型常简化结构，缺乏关键的细胞间相互作用和微环境线索；动物模型则存在种属差异，阻碍临床转化，且复杂的动物反应不利于机制阐释。此外，伦理限制也制约了人体内耳样本的获取。作为一种新兴研究模型，内耳类器官有望弥补这些缺陷。它们部分保留了天然内耳的结构和功能，避免了种属差异，并为个性化治疗提供了潜力。内耳类器官已在疾病建模、机制研究、药物筛选、基因治疗开发和内耳发育研究等领域得到探索。
然而，当前的内耳类器官培养方法（如在Matrigel或甲基丙烯酰化明胶水凝胶中直接培养形成细胞团）难以复制内耳复杂的拓扑结构，缺乏天然组织中的几何限制。微流控芯片和旋转细胞培养系统（RCCS）等技术也被用于内耳类器官构建，前者在模拟生理功能（如血-迷路屏障）和特定应用（高通量药物筛选）方面有优势，后者旨在通过持续物质交换促进内耳类器官生理功能成熟，但这些方法均无法模拟内耳的形态结构，未能实现高度仿生。3D生物打印技术作为一种新型器官芯片构建技术，能够精确构建3D空间结构，通过计算机辅助转移过程组装生物和非生物材料，生产具有指定3D结构的生物工程结构。该技术结合定制化的生物墨水和打印方案，可实现打印模型的标准化、规模化生产，已在类器官工程、实质性器官（如肝、肾）模型构建、血管模拟以及临床治疗研究中展现出巨大潜力。3D生物打印技术能够按照预定义的内耳模型程序化沉积负载细胞的生物墨水，首次将形态学影响纳入类器官培养，有潜力推动内耳类器官模型进入新的发展阶段。
2. 构建内耳类器官的基本要素
2.1. 内耳类器官的来源
当前内耳类器官来源于多能干细胞（PSCs，包括诱导多能干细胞iPSCs和胚胎干细胞ESCs）或耳蜗祖细胞（CPCs）。PSC来源的类器官构建利用精确的细胞因子、生长因子和小分子组合，通过时空特异性调控WNT、BMP、FGF等信号通路，诱导多能干细胞逐步分化为非神经外胚层、耳基板、耳囊泡，最终形成包含HCs和支持细胞（SCs）的内耳类器官。已有研究成功从人PSCs诱导出表达PAX8和PAX2的耳基板祖细胞，并进一步分化为耳上皮祖细胞（OEP）和耳神经祖细胞（ONP），但二维培养限制了其HCs分化效率和组织化。另有研究通过精确调控SHH和WNT通路促进了耳蜗HCs的生成，但模型仍缺乏耳蜗结构和中枢神经元。内耳干细胞（如表达Lgr5的细胞）是另一重要细胞来源，通过在体外培养基中添加生长因子（如表皮生长因子EGF， 成纤维细胞生长因子FGF）和小分子构建仿生微环境，可促进其增殖和分化为仅包含感觉上皮（SCs和功能HCs）的类器官，但缺乏其他功能单元，且与人螺旋神经节神经元的突触连接研究尚不充分。
2.2. 内耳类器官的材料
目前内耳类器官的培养体系主要基于Matrigel构建。Matrigel是一种细胞外基质凝胶，可为细胞生长提供有利微环境。研究人员通过将Ti3C2TxMXene、氧化石墨烯（GO）等材料掺杂到Matrigel中，形成了增强机械强度、导电性和生物活性负载能力的复合水凝胶体系，提升了HCs的再生效率和电生理成熟度。然而，Matrigel成分复杂，实验可重复性受限。相比之下，甲基丙烯酰化明胶水凝胶成分明确、刚度可调、稳定性好。研究表明，基于GelMA水凝胶的培养方案证明了ECM的机械力是触发细胞内信号级联并直接产生感觉上皮细胞的驱动力。此外，通过“点击化学”制备的GelNB-CH水凝胶也被证明在促进HCs分化方面可完全替代Matrigel。丝素蛋白、海藻酸钠、壳聚糖等材料也具有应用于内耳类器官构建的潜力。
2.3. 内耳类器官的构建技术
为满足内耳特定生物学需求，发展了多种3D构建技术，主要包括微流控芯片系统和RCCS。微流控芯片在模拟内耳生理功能（如血-迷路屏障）和实现特定应用（如高通量药物筛选）方面具有独特优势，但其设计受限于传统血脑屏障芯片框架，难以复制内耳所需的特定离子微环境，且难以实现内耳类器官与原位机械响应模块的整合，无法忠实地再现内耳的生理机械振动。RCCS通过提供持续流体流动，促进物质交换，旨在促进类器官成熟。已有研究利用RCCS成功将人PSCs分化为前庭组织类器官，其表面甚至形成了类似耳石的结构，并诱导出了感觉上皮和神经元。但RCCS的持续流体流动导致离子快速交换，难以维持内耳功能所需的局部稳定离子梯度，其均匀旋转的流体也无法模拟内耳中定向的、频率依赖的机械振动，且对类器官尺寸的控制存在局限。这些技术均未能满足内耳在离子微环境维持、机械振动传导和长程神经连接建立等方面的特定生物学需求。内耳类器官领域的发展轨迹正从“尺寸小、分化比例低”向“更大尺寸、更广细胞类型覆盖、更高分化效率”演进，反映了其功能和复杂性的增强。
2.4. 3D打印内耳模型
3D打印最初被应用于开发针对内耳疾病的定制化原位治疗方案，如基于计算机断层扫描CT和磁共振成像MRI数据重建患者内耳模型，用于设计个性化人工耳蜗植入方案，或开发圆窗龛植入物、微针、微泵等用于内耳给药。另一类研究是构建体外模型以研究内耳给药系统的功效，例如设计3D打印的双腔桌面装置集成豚鼠圆窗膜以研究磁性纳米颗粒的跨膜转运机制，或设计受内耳启发的神经营养生长室结合微渗透泵进行长期给药。这些模型可以部分解决耳蜗植入物移植和局部给药策略优化问题，但无法为靶细胞提供合适的3D生长微环境，从而限制了对感音神经性听力损失中HCs损伤和SGNs退化贡献，以及内耳发育调控机制的深入研究。
3. 3D生物打印内耳类器官的核心构建理论
3D生物打印通常涉及两个主要阶段：将医学影像数据处理为高分辨率组织或器官级3D模型；将这些模型转换为机器可读代码以指导生物墨水的逐层沉积，从而复制复杂的生物结构。与3D打印内耳模型相比，3D生物打印内耳类器官在材料、技术和应用层面实现了3D水平的生物学技术进步。在材料选择上更注重生物相容性，同时可通过调整交联方案控制水凝胶基质的机械强度；先进技术提供了保留形态和功能高保真度的温和打印方法，进一步拓展了其在生物医学领域的应用范围。
目前，3D生物打印内耳类器官的研究多处于概念验证阶段。已有研究将新生小鼠的Corti器官外植体接种到3D打印的聚乙烯醇PVA/明胶Gel/海藻酸钠SA支架上进行培养，或将内耳干细胞培养在3D生物打印的GelMA/SA支架上，初步模拟了内耳器官内的细胞生长微环境，显示HCs分化效率高于二维培养，但3D模型简单，空间分布模拟不佳，且细胞特征表征不足。另一研究使用GelMA-透明质酸HA-RGD凝胶作为生物墨水，开发了用于打印稳定螺旋微球的3D生物打印技术，构建的耳蜗类器官显示出高活力并包含HC样细胞，但仍缺乏紧密连接的上皮细胞和促进多重细胞相互作用的微环境。
下一代内耳类器官的发展将由3D生物打印技术推动，其优势体现在：可高度复制内耳天然的3D解剖结构和多细胞有序排列，且这种空间排列是可编程的；数字模型显著减少批次差异，增强可重复性和标准化；能够与患者来源的多能干细胞兼容，便于构建个性化内耳类器官。为实现其全部潜力，需克服在高保真体外再现复杂结构和生理功能方面的挑战。为此，本文提出了3D生物打印内耳类器官的核心构建理论，包含三个关键维度：“细胞微环境”、“组织与器官的宏观环境”和“功能组织单元”。
3.1. 细胞微环境
细胞微环境提供的生化和物理线索在干细胞命运决定中起关键作用，生物墨水的设计是调控这些线索的关键。首先，水凝胶生物墨水的发展最有前景，目前已有基于天然聚合物水凝胶（如Matrigel, GelMA, 海藻酸钠, 透明质酸）、合成聚合物水凝胶（如聚乙二醇PEG, 泊洛沙姆Pluronic）和复合水凝胶生物墨水成功构建的类器官模型。例如，GelMA水凝胶成分明确、生物相容性好、具有光交联特性，是替代Matrigel的理想材料。基于两亲性软GelMA纳米颗粒的生物墨水可精确模拟组织力学特性。丝基生物材料，特别是丝素蛋白，具有良好的机械稳定性、可调的理化性质、良好的生物相容性和低免疫原性，是用于体积增材制造VAM打印内耳类器官的有前景的材料。其次，脱细胞基质dECM是未来构建内耳类器官最有前景的替代材料。dECM生物墨水保留了天然的ECM成分和纳米纤维结构，可为再现内耳微环境（高钾低钠离子环境、低氧分压、机械振动传导）提供仿生平台。结合VAM技术，可实现快速组织打印。生物材料的选择需综合考虑生物相容性、可打印性、机械适应性和生物功能。最后，功能化生物墨水的刺激响应设计对于研究内耳发育和功能至关重要。物理刺激响应材料（如超顺磁性氧化铁纳米粒子SPION, MXene, 金属有机框架MOF）允许3D生物打印集成物理刺激信号，探索物理刺激对内耳发育和功能的影响。构建3D生物打印内耳类器官需要高度模拟的生理微环境，在机械性能、生物相容性、仿生保真度和降解特性方面均有具体要求。
3.2. 组织与器官的宏观环境
宏观环境建模利用高分辨率3D生物打印精确复制内耳形态。组织与器官构建的空间精度、模型复杂性和仿生程度取决于3D生物打印技术的进步。应用初期集中于喷墨、挤出和还原光聚合三种基本技术，但早期模型只能构建结构简单、仿生保真度低的类器官模型，难以再现体内组织复杂的微观结构、机械梯度。针对内耳等具有精确螺旋结构和复杂机械梯度的组织，这些简单模型不足。在研究和需求驱动下，从基础技术衍生出先进技术：喷墨生物打印发展为声学、微阀、电流体动力生物打印，提高了细胞定位精度和通量；挤出生物打印发展出悬浮打印、同轴挤出等技术，实现了多材料分层沉积和机械梯度调控；还原光聚合发展出双光子聚合TPP和体积增材制造VAM，将打印精度提升至亚微米级，能够精确复制复杂的3D微观结构。
同轴打印、支持浴嵌入式生物打印和还原光聚合等先进3D生物打印技术有望打印高度模拟内耳形态的3D模型。SPIRIT是一种基于可逆墨水模板的连续打印技术，可利用新型淀粉水凝胶生物墨水作为支撑介质打印内耳，然后通过打印牺牲墨水在界面形成仿生血管网络，最终实现血管化
