酶介导的“一对一多”PAM独立且无需扩增的CRISPR/Cas12a技术，用于快速检测受污染的食品中的细菌

《Biosensors and Bioelectronics》：Enzyme-mediated “one to more” PAM- independent and amplification free CRISPR/Cas12a for one-pot rapid detection of food contaminated bacteria

石一恒|高培|吴迪|吴永宁|李国亮

陕西科技大学食品科学与工程学院，中国西安710021

摘要

原间隔序列相邻基序（PAM）的要求以及核酸扩增的限制，阻碍了CRISPR/Cas12a系统在细菌检测中的应用。本文提出了一种基于限制性内切酶的、“一个或多个”基因拷贝、不依赖PAM且无需扩增的CRISPR/Cas12a策略用于细菌检测。细菌基因组DNA可以被特定的内切酶切割，产生大量的粘性末端。这些粘性末端与短链单链DNA（ssDNA）结合后，可以有效激活Cas12a的切割活性，从而破坏荧光报告探针，实现检测目的。该方法不仅克服了对PAM序列的依赖性，而且能够在60分钟内完成目标细菌的检测，无需核酸扩增。对于两种典型的食品污染菌株Alicyclobacillus acidocaldaris和Cronobacter sakazakii，检测灵敏度分别为13.38 CFU/mL和18.67 CFU/mL。总之，这项工作为细菌分析和分子诊断提供了一种新的策略和有力工具。

引言

细菌污染是全球食品安全和质量问题的主要原因。虽然某些细菌污染会导致明显的变质现象，如颜色、质地和异味的改变，但其他细菌可能看起来仍然正常（Karanth等人，2023；Odeyemi等人，2020；Veld，1996）。食用这些受污染的食品可能导致腹泻和呕吐等多种疾病，严重情况下甚至会导致死亡（Heredia和García，2018；Kirk等人，2015）。快速准确地识别目标细菌对于污染监测和质量控制至关重要，进而保障食品安全和公共健康。目前的检测方法，包括基于培养的方法、核酸扩增技术和免疫学检测，存在周转时间长、设备成本高等问题，因此不适用于现场检测（Foddai和Grant，2020；Law等人，2014）。这些局限性凸显了开发快速且用户友好的现场检测方法的紧迫性（Chen等人，2021）。

成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas）系统在核酸检测领域展现出巨大潜力，因为它具有独特的顺式和逆式切割能力。当CRISPR RNA（crRNA）与目标DNA结合时，首先激活Cas的顺式切割活性以切割目标DNA，然后通过非特异性单链脱氧核糖核酸酶（ssDNase）的切割活性水解荧光探针，这一过程称为逆式切割（Chen等人，2018）。这一双重功能特性促进了核酸检测技术的发展，催生了诸如DETECTR（DNA内切酶靶向逆式CRISPR报告系统）、HOLMES（低成本多功能高效系统）和SHERLOCK（高灵敏度酶报告解锁系统）等核酸检测平台（Chen等人，2018；Gootenberg等人，2017；Kellner等人，2019；L. Li等人，2019；Li等人，2018）。尽管基于CRISPR/Cas的核酸检测方法被广泛使用，但它们通常需要与PCR、RPA或LAMP等核酸扩增技术结合才能达到足够的灵敏度（Broughton等人，2020；Joung等人，2020；Swarts和Jinek，2019）。这不仅引入了额外的操作步骤，还延长了反应时间并增加了总体检测成本（Hu等人，2022；Liu等人，2025；Yang等人，2024）。此外，使用这些扩增步骤还存在气溶胶污染的风险，可能导致交叉污染并影响检测结果的可靠性。另外，Cas对双链DNA（dsDNA）的切割能力受到原间隔序列（PAM）的要求限制。虽然这一特性提高了检测的特异性，但也限制了CRISPR/Cas的灵活性和适用范围（Chen等人，2018；Y. Li等人，2019）。

本文提出了一种无需扩增、不依赖PAM的CRISPR/Cas12a单步检测策略，用于食品污染细菌的分析。通常，细菌基因组DNA含有丰富的限制性内切酶识别位点，如EcoR I等。通过酶消化，一个基因拷贝可以产生大量粘性末端，即“一个或多个”效应。加入一段无法激活Cas12a的短链ssDNA后，它会与粘性末端结合形成完整的激活剂链。完整的激活剂链可以与crRNA杂交，从而有效激活CRISPR/Cas12a的逆式切割活性。最终，一个分子信标被切割，产生强烈的荧光信号以实现目标检测。该方法使用两种典型的食品污染菌株A. acidocaldaris和C. sakazakii>进行了验证，检测限分别达到13.38 CFU/mL和18.67 CFU/mL。该方法无需核酸扩增，并且整个反应在单个试管中60分钟内完成。这一策略在环境监测、医学诊断和食品分析等实际应用中具有很大潜力。

章节片段

材料

实验中使用的A. acidoterrestris及其他菌株购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国）。本研究使用的所有DNA寡核苷酸和CRISPR RNA（crRNA）均由Primer Premier 5.0软件设计，并由南京基因斯克生物技术有限公司（中国）合成。详细序列信息见表S1。EcoR I购自Takara Bio Inc.（日本）。LbCas12a、10×NEBuffer r2.1（10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、100

检测原理

如广泛报道的，CRISPR/Cas12a可以被带有PAM位点的双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）激活。此外，将全长ssDNA切割成两段短链ssDNA也可以激活CRISPR/Cas12a的逆式切割活性（两种ssDNA激活剂的协同作用增强了CRISPR/Cas12a的逆式切割）。同时，细菌基因组DNA含有多种限制性内切酶识别位点，其中许多位点的拷贝数很高（图1A）。

结论

总之，我们建立了一种基于限制性内切酶的、不依赖PAM且无需扩增的CRISPR/Cas12a系统，用于高度敏感、快速和准确的食品污染细菌检测。该系统的显著优势体现在三个方面：首先，多个识别位点使得一个基因拷贝能够产生大量粘性末端，从而实现无需核酸扩增的信号放大，即“一个或多个”效应。

作者贡献声明

吴永宁：撰写 – 审稿与编辑。李国亮：撰写 – 审稿与编辑、监督。高培：撰写 – 初稿撰写、可视化、实验设计、数据分析、数据管理。吴迪：撰写 – 审稿与编辑。石一恒：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理

Foddai和Grant，2020；Li等人，2019；Liu等人，2025。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32022069、32402263）、陕西省科学技术协会青年人才支持计划（项目编号：20250212）以及陕西省教育厅的一般专项项目（项目编号：25JK0361）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。