用于增强抗菌性能的3D打印聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）/羧甲基纤维素（CMC）水凝胶的设计与优化

《Case Studies in Chemical and Environmental Engineering》：Design and Optimization of 3D Printable Polyethylene Glycol Diacrylate (PEGDA)/Carboxy Methyl Cellulose (CMC) Hydrogels for Antibacterial Property Enhancement

　　帕维娜·帕塔拉乌多姆乔克（Paweena Pattaraudomchok）、李胜·通（Lih-Sheng Turng）、马尼特·尼蒂塔纳库尔（Manit Nititanakul）、春乔姆·奥姆纳特（Chuanchom Aumnate）
泰国曼谷朱拉隆功大学冶金与材料科学研究所，邮编10330

**摘要**
本研究报道了由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和羧甲基纤维素（CMC）制成的水凝胶微图案贴片的制备及其功能评估，其中添加了黑孜然籽油（B-EO）作为抗菌活性剂。采用液晶显示器（LCD）3D打印技术结合田口实验设计（Taguchi Design of Experiments, DOE）方法优化了打印参数，并精确控制了微图案的几何形状，包括圆锥形、六边形金字塔形和方形金字塔形。对打印出的结构进行了形状保真度、机械性能、膨胀行为、释放动力学、抗菌活性和细胞相容性的评估。优化后的设计中，基底尺寸为800 μm，高度为900 μm，层厚为40 μm，显示出较高的结构保真度，而曝光时间对结果没有显著影响。圆锥形微图案表现出最高的机械强度，证实几何形状是决定承载性能的关键因素。膨胀研究表明，在35°C和50°C下表现为Fickian扩散，而在65°C时转变为非Fickian扩散，表明存在温度依赖性的传输过程。B-EO的控释有效抑制了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）的生长。使用L929成纤维细胞进行的细胞相容性测试未发现毒性作用。本工作表明，基于LCD的3D打印技术能够实现机械和功能特性的几何驱动调节，支持了载有B-EO的PEGDA/CMC微图案贴片在抗菌应用中的潜力。

**1. 引言**
水凝胶因其可调的物理化学性质以及在药物递送、组织工程和伤口管理等应用中的多功能性而在生物医学领域受到了广泛关注。在各种水凝胶形成聚合物中，聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）因其优异的生物相容性、可调的机械性能以及通过光聚合易于交联而得到广泛应用。为了进一步提高PEGDA基水凝胶的性能，通常会加入天然聚合物如羧甲基纤维素（CMC），后者可以改善吸水性和机械强度，同时保持复合水凝胶的生物相容性。三维（3D）打印技术的进步，特别是液晶显示器（LCD）技术的发展，使得能够精确制造包括微针贴片在内的水凝胶微结构，这种贴片提供了微创的经皮药物递送途径，能够有效穿透角质层，且疼痛和组织损伤最小。微针的几何形状对维持结构完整性和药物递送效果至关重要。形状、基底直径和高度的变化显著影响微针在插入过程中的结构稳定性及药物递送效果。

一般来说，用于药物递送的微针需要具备尖锐的尖端、足够的断裂强度和可靠的插入能力；而用于伤口愈合的微结构水凝胶贴片则侧重于与伤口表面的接触和抗菌或抗炎剂的持续释放。尽管在3D打印水凝胶微结构方面取得了显著进展，但在基于PEGDA/CMC的微地形优化方面仍存在关键空白，尤其是微几何形状对打印保真度、机械性能、传输和释放行为以及抗菌效果的影响尚未得到系统研究。为解决这些问题，可以采用田口实验设计（Taguchi Design of Experiments, DOE）方法。这种稳健的统计方法能够在较少的实验次数下识别出关键影响因素。与传统的全因子实验设计相比，田口正交阵列允许高效筛选多个几何和打印参数，尤其是在每次3D打印试验耗时且材料成本较高的情况下更为有利。此外，田口的信噪比分析为确定最小化过程变异性和提高微结构制备可重复性的参数设置提供了实用框架。

将生物活性剂掺入水凝胶微针中可以扩展其治疗潜力。黑孜然籽油（B-EO）从黑孜然（Nigella sativa）种子中提取，具有强大的抗菌、抗炎和抗氧化作用，是生物医学应用中的有希望的候选物质。通常采用机械冷压提取方法来保留其关键生物活性成分，尤其是百里酚醌。将B-EO掺入水凝胶中可实现双重功能：机械穿透和局部治疗作用。这些水凝胶具有足够的机械强度，能够穿透角质层，实现有效的经皮药物递送，同时不会引起显著疼痛或组织损伤。一旦释放，B-EO通过抑制细菌生长、调节炎症反应和促进胶原蛋白合成来发挥治疗效果，这些过程对组织再生和伤口愈合至关重要。当B-EO被掺入水凝胶微针中时，可以直接作用于伤口部位，绕过角质层，实现持续、局部的药物释放。这种B-EO的治疗潜力与微针的先进递送能力的结合，为开发下一代促进愈合、减少疤痕形成的伤口敷料提供了有前景的策略。为确保B-EO在水凝胶基质中的稳定性和有效分散，使用了卵磷脂和聚山梨酯80作为乳化剂。

**2. 材料与方法**
2.1 **材料**
聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），平均分子量Mn为700，购自Sigma-Aldrich（美国）。羧甲基纤维素（CMC）钠盐，粘度范围为250-350 cps（20°C下1 wt.%溶液，干基），由Loba Chemi（印度）提供。用于水凝胶聚合的水溶性I型光引发剂——苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂（LAP），同样来自Sigma-Aldrich（美国）。作为抗菌剂的黑孜然籽油（B-EO）在泰国通过机械方法从黑孜然种子中提取。卵磷脂和聚山梨酯80（Tween 80）用作乳化剂。磷酸盐缓冲盐水（PBS）是生物研究中常用的缓冲溶液，由Sigma（日本）提供。

2.2 **PEGDA/CMC水凝胶微图案贴片的几何设计**
为了制备微图案水凝胶贴片，开发了基于PEGDA/CMC的水凝胶配方。这些配方在有无抗菌剂B-EO的情况下均进行了制备（见图1）。对于基础水凝胶，将PEGDA（10 wt.%）溶解在去离子水中，在室温下以300 rpm的速度搅拌2小时。同时，将CMC（相对于PEGDA的量为2.5 phr）在80°C下溶解在去离子水中，持续搅拌1小时直至获得均匀溶液。随后将PEGDA和CMC溶液混合，并继续以300 rpm的速度搅拌24小时以确保完全混合，从而得到均匀的PEGDA/CMC水凝胶前体。

2.3 **水凝胶微图案贴片的3D打印**
将制备好的水凝胶前体溶液倒入基于液晶显示器（LCD）的3D光聚合打印机（Phrozen Mighty 8K，台湾）的打印槽中，该打印机使用405 nm光源，XY像素分辨率为28 μm。打印参数设置为正常曝光时间60秒、底部曝光时间35秒、10层底部层厚40 μm。进行了初步的预筛选校准，以确定PEGDA/CMC树脂的稳定打印窗口，随后用于确定田口实验设计的因素范围。使用CAD软件创建了多种微图案设计，转换为STL文件后进行3D打印。虽然每次打印的曝光时间有所不同，但光强度始终保持3 mW/cm2。为了优化打印参数和针状微图案的几何形状，采用了基于田口方法的实验设计（DOE）方法。研究的微针几何形状包括圆锥形、六边形金字塔形和方形金字塔形（见图1b-d）。此外，通过改变405 nm光源下的固化时间（0分钟、1分钟和2分钟）来评估固化过程的影响。

2.4 **实验设计与优化**
田口实验设计（Taguchi Design of Experiments, DOE）是一种有效的实验设计技术，可在减少实验次数的同时高效评估多个因素对结果的影响。通过使用结构化的实验阵列，田口方法确保了系统化、无偏倚和高效的数据收集。在本研究中，初始的水凝胶微针制备采用了田口方法，共进行了九次实验。表1和表2分别展示了所使用的设计参数和实验次数。表1中的因素范围和水平基于（i）LCD打印机的实际操作窗口（硬件分辨率和曝光控制）以及（ii）初步校准打印结果，这些校准打印确定了能够一致产生自支撑微结构且不会过度固化或不完全固化的条件。这些初步试验定义了一个可行的“可打印窗口”，随后应用田口L9正交阵列，在此窗口内高效筛选选定因素的主要效应。研究的参数包括微针直径（600 μm、700 μm和800 μm）、微针高度（700 μm、800 μm和900 μm）以及3D打印层厚（30 μm、35 μm和40 μm），微针采用常见的圆锥形设计。

2.5 **微针贴片的形态学表征**
使用扫描电子显微镜（SEM）检查了3D打印微针贴片在机械测试前后的形态。样品制备过程中，将微针贴片从基部切割下来并固定在金属支架上，然后用溅射镀膜仪在样品表面镀上一层薄金（Au）（60秒）。SEM成像使用的是配备场发射枪的SU3500-Horiba X-maxN系统（Hitachi，日本），工作电压为2.5 kV。此外，还使用共聚焦激光显微镜（LEXT OLS5000，Olympus，日本）测量了微针水凝胶的3D轮廓。所有测量结果均重复三次（n ≥ 3）。微针的体积精度百分比（%）通过公式1计算：

**2.6 **失效性能**
使用3D打印技术制备了直径9 mm、厚度3 mm的圆形水凝胶样品。打印样品储存在含有干燥硅胶的铝塑复合包装中，以保持干燥状态，直至进一步测试。机械性能是使用HAAKE MARS流变仪（Thermo Fisher Scientific，美国）进行评估的，其中以0.5毫米/分钟的恒定速度对样品表面施加压缩力。在压缩过程中连续记录力-位移曲线，直到样品达到其原始高度的25%。随后分析了样品的形态、表面轮廓和抗压强度。

2.7. 膨胀比和膨胀速率
水凝胶微针贴片制备了三种不同的几何形状：圆锥形、六角锥形和方形基锥形。每个贴片的尺寸为10毫米×10毫米。打印好的贴片在60°C的烤箱中干燥3天。之后，将干燥的样品浸入PBS（pH 7.4）中，并在预定的时间间隔取出。使用滤纸轻轻擦去表面的多余PBS，然后称量样品。时间t时的膨胀比S(t)使用公式2[28]通过重量法计算。公式2中，W(t)表示时间t时样品的重量，W0是水凝胶的初始干重。平衡膨胀比Se取为在相同条件下S(t)的稳定值。为了量化膨胀动力学，使用Voigt（Kelvin–Voigt）型指数模型对实验得到的S(t)数据进行了拟合，公式3[29, 30, 31]。在这个公式中，k表示时间t时的膨胀比，Se表示平衡膨胀比，λ是膨胀时间常数（分钟）。较大的λ表示达到平衡的过程较慢。

2.8. 膨胀行为
膨胀行为可以通过Korsmeyer-Peppas膨胀模型来估计，如公式4[29, 32]所示。膨胀行为通过几个参数来表征，包括膨胀分数(f)、给定时间t的膨胀比(r(t))和平衡膨胀比(se)。这里，Se是在相同条件下从S(t)的稳定值得到的平衡膨胀比。公式2根据质量测量提供时间依赖的膨胀比S(t)，而公式3用于拟合S(t)以获得Se和λ。此外，一个常数(d)反映了聚合物网络结构，扩散指数(n)表示溶剂传输的性质。指数n在识别扩散机制中起着关键作用，它是通过基于公式3的对数变换数据的斜率分析确定的。这种分析主要集中在达到稳定值之前的初始膨胀阶段，此时模型仍然有效。扩散指数为0.5表示Fickian扩散（Case I传输），其中溶剂扩散占主导。相比之下，指数为1.0对应于Case II传输，其中膨胀主要由聚合物链松弛控制。指数在0.5到1.0之间的值表示异常或非Fickian扩散，表明扩散和松弛过程的结合。指数大于1意味着偏离Fickian行为，称为超Case II传输，表明由于聚合物网络动力学导致膨胀速率加快[32, 33]。膨胀测试在35°C下进行，以反映生理相关的皮肤/伤口接触条件。还包括其他温度（50和65°C）作为机械探针，以评估PEGDA/CMC水凝胶系统的温度依赖性传输和网络松弛行为，而不是直接模拟典型的伤口温度[34, 35]。

2.9. 膨胀动力学研究
检查了水凝胶的膨胀动力学，以确定膨胀过程是一级还是二级动力学。一级膨胀动力学由公式5[33]描述：公式5中，r(t)表示时间t时的膨胀比，se是平衡膨胀比，k是一级速率常数（以分钟-1表示，因为膨胀时间以分钟为单位测量）。常数k反映了膨胀速率与剩余膨胀能力之间的比例关系。该模型表明膨胀过程主要是由扩散控制的[36]。通过使用初始条件积分公式5，其中时间t从0到t0，膨胀比S从0到S0，可以推导出公式6[6]。常数k与膨胀速率参数k成反比，这意味着k值越高，膨胀速率越快。根据一级动力学，随着k的增加，膨胀速率也会增加。为了评估二级动力学，使用以下方程（公式7）对水凝胶的膨胀行为进行了建模：公式7。通过使用初始条件积分公式6，其中t从0到t0，s从0到s0，可以得到公式8[8]。公式8中，k'是一级动力学常数，以分钟-1表示。这个常数与膨胀速率成反比，意味着随着k的减小，膨胀过程会减慢。

2.10. 3D打印水凝胶中的黑孜然籽油（B-EO）负载
使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了PEGDA/CMC和负载B-EO的PEGDA/CMC水凝胶的化学结构。测量使用Thermo Fisher Scientific iZ10 FTIR光谱仪进行，该光谱仪配备了衰减全反射（ATR）附件，并处于透射模式（Thermo Fisher Scientific Inc., 美国）。光谱记录在4000–500厘米-1的波数范围内。此外，还使用连接到SEM系统的能量分散X射线光谱（EDX）进一步分析了微针贴片的元素组成和分布。EDX分析用于确认水凝胶基质中元素的存在和均匀分布。在选定的区域收集光谱，并进行元素映射，以可视化微针结构中元素的空间分布。

2.11. 黑孜然籽油（B-EO）释放速率和B-EO释放行为模型
研究了B-EO从水凝胶中的释放行为，实验在PBS（pH 7.4）和37°C下进行。将负载B-EO的PEGDA/CMC水凝胶样品浸入5毫升PBS中，并在预定的时间间隔取出0.5毫升释放介质，然后用等体积的新鲜PBS替换，以保持沉降条件。使用275纳米波长的UV-Vis分光光度法[21]量化释放的B-EO量，参考从2到10微克/毫升的B-EO溶液生成的标准校准曲线。收集了随时间累积的B-EO释放百分比。为了研究释放机制，使用Korsmeyer-Peppas模型（公式4）分析了实验数据，其中r(t)表示时间t时释放的B-EO量，W0表示水凝胶基质中B-EO的总量。使用几种经验释放动力学模型进一步评估了最初240分钟内的药物释放曲线，包括零级、一级和二级模型。使用回归系数方法评估每个模型对数据的拟合程度。在零级释放动力学中，B-EO释放速率随时间保持恒定，可以用公式10描述[10]。公式10中，r(t)表示时间t时释放的B-EO量，W0是时间t=0时B-EO的初始浓度，k0是零级速率常数。对于一级释放动力学，释放速率依赖于浓度，可以用公式11和公式12表示：公式11可以重新排列为：公式12，其中k1是一级速率常数（以-1或每小时表示）。为了评估一级动力学，生成了剩余B-EO浓度对时间的对数图。该图的斜率给出了初级速率常数，相关系数表明模型的适用性。二级释放动力学由公式13描述：公式13。此外，Hixson和Crowell[37]提出颗粒的表面积与其体积的立方根成正比。基于这种关系，他们开发了以下方程：公式14。公式14中，W0表示初始药物量，W(t)表示时间t时的剩余量，k是一个考虑表面积与体积关系的常数。该模型适用于颗粒或片剂的表面积和直径随时间变化的药物释放系统[37, 38]。数据分析涉及将基质中剩余药物百分比的立方根与时间作图。Higuchi模型[39]最初是为平面表面设计的，已适应于各种形状和多孔材料。它依赖于几个关键假设：(i) 基质中的初始药物浓度远大于药物的溶解度；(ii) 药物扩散主要在一个方向上发生，最小化边缘效应；(iii) 药物颗粒远小于系统的厚度；(iv) 基质的膨胀和溶解最小；(v) 药物的扩散速率保持恒定；(vi) 释放环境中始终维持完美的沉降条件[40]。简化的Higuchi模型可以表示为公式15：公式15。公式15中，W(t)表示时间t时释放的累积药物量，kHiguchi是Higuchi溶解常数。数据通常通过将释放的累积百分比与时间的平方根作图来分析[41]。

2.12. 抗菌测试
根据AATCC147（修改版）：通过琼脂盘扩散法评估纺织材料的抗菌活性[42, 43]来确定水凝胶样品的抗菌活性。简要来说，选择了大肠杆菌（ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）进行测试。使用生理盐水溶液或0.85%氯化钠稀释所有不同的微生物，相应的细菌悬浮液浊度为McFarland标准0.5，相当于1.5 × 10^8 CFU/mL的细菌悬浮液。然后将细菌接种物涂抹在琼脂板上，并放置直径为9毫米的水凝胶样品。在37°C下培养大约24小时后，测量抑制区的直径。重复该程序，并以三次实验的平均值表示抑制区直径（毫米）。

2.13. 体外细胞毒性测试
使用L929小鼠成纤维细胞评估了所有3D打印的负载B-EO的PEGDA/CMC水凝胶的细胞毒性，遵循ISO 10993-5指南[44]中的提取物稀释方法。细胞以1.3 × 10^4细胞/孔的密度接种在96孔板中，并培养24小时。在提取物制备之前，使用70%乙醇对水凝胶进行灭菌，然后将其浸入浓度为0.1克/毫升的培养基中过夜。将得到的提取物应用于培养的细胞并培养48小时。使用MTT测定法评估细胞活力。暴露于提取物后，向每个孔中加入MTT溶液，并在37°C和5% CO2气氛下培养4小时，以形成甲酚蓝晶体。随后将晶体溶解在DMSO中，并使用微孔板读数器在570纳米处测量吸光度。细胞活力相对于未处理对照组计算，值高于70%表示无细胞毒性。

2.14. 统计分析
每个测试进行了三次重复，数据以平均值±标准差显示。使用IBM SPSS统计软件（IBM，芝加哥，IL，美国）分析图表。在本研究中，“n”表示每种条件下的独立打印样本数量（独立样本），除非另有说明（n = 3）。当进行技术重复时，它们用于评估测量的重复性，并在统计分析之前取平均值以获得每个独立样本的单一值[45]。使用图形诊断（Q–Q图和残差图）评估参数检验的假设。当这些假设被视觉指示出偏差时，结果需要谨慎解释[46]。统计显著性设定为P < 0.05。

3. 结果和讨论
3.1. 3D打印条件的优化用于水凝胶微针的制备
使用LCD 3D打印工艺制备了PEGDA/CMC微针贴片，并使用共聚焦表面轮廓评估打印的保真度。然后使用公式1计算每个样本的体积精度（Va），Taguchi L9设计使得在有限的试验次数内能够识别出主导因素。如图2a-i和图2j中的主效应图所示，微针直径和高度对Va的影响最大，而在测试窗口内的暴露时间没有显著影响。最佳条件（直径800微米，高度900微米，层高40微米；样本g）产生了最高的Va，因此被选为所有后续实验的条件（表2和图2）。共聚焦显微镜图像、表面轮廓以及3D打印微针贴片的体积精度百分比（Va）是在Taguchi方法指导下，通过优化打印参数制备的（a-i），以及Taguchi对3D打印微针直径、微针高度和层高的分析及信噪比（j）。3.2 微针水凝胶的特性微针的几何形状在决定水凝胶微针贴片的整体性能方面起着关键作用[47]。在本研究中，探讨了微针几何形状对可打印性、机械性能、膨胀行为、药物释放特性、抗菌活性和细胞毒性的影响。3.2.1 可打印性根据第3.1节的发现，最佳微针尺寸确定为直径800 μm和高度900 μm。图3显示了圆锥形、六角锥形和方形基锥形微针在压缩测试前（图3a-c）和测试后（图3d-f）的形态。插图展示了打印微针的表面轮廓，突出了不同基部几何形状对直径的影响。如表3所总结的，圆锥形、六角锥形和方形基锥形微针的测量直径分别为810.66 ± 46.39 μm、809.30 ± 83.14 μm和898.50 ± 33.59 μm，与设计规格非常接近。然而，实际制备的微针高度始终低于预期设计值。压缩测试前，圆锥形、六角锥形和方形基锥形微针的测量高度分别为419.50 ± 40.62 μm、347.64 ± 21.10 μm和304.31 ± 28.13 μm。这种差异可能是由于聚合过程中材料的收缩造成的，主要与水凝胶配方中的PEGDA基质有关[48]。添加小分子如CMC可以部分缓解这种收缩，最多可减少约60%[49]。就体积精度（Va）而言，各几何形状的顺序为：圆锥形 > 方形基锥形 > 六角锥形。这种趋势可能是由于过度固化造成的，过度固化会不成比例地影响锥形微针的尖锐边缘。过度固化导致聚合物在设计的边界之外过度聚合，从而引起额外的收缩和变形，而在更平滑、更对称的圆锥形几何形状中这种现象不那么明显。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图3. 在优化打印参数下制备的3D打印微针贴片的形态，包括圆锥形、六角锥形和方形基锥形，在压缩测试前（a-c）和测试后（d-f），以及（g）实线条和图案条显示了压缩测试前后的微针高度，（h）2.5%应变下微针贴片的压缩强度。数据以平均值±标准差（n = 每组3个独立打印样本）表示。条形上方不同的字母表示组间存在统计学上的显著差异（单因素方差分析，使用Tukey事后检验。小写和大写字母表示不同形状设计中的独立比较组，P < 0.05）。表3. 不同几何形状的微针的尺寸和压缩强度。参数几何形状圆锥形六角锥形方形基锥形直径（μm）810.66 ± 46.39809.30 ± 83.14898.50 ± 33.59高度（μm）419.50 ± 40.62347.64 ± 21.10304.31 ± 28.13Va93.13 ± 19.2540.24 ± 5.5760.86 ± 12.79压缩强度（Pa）500.69 ± 152.75412.48 ± 182.44219.59 ± 62.49压缩模量（Pa）144.65 ± 14.52171.22 ± 13.90123.45 ± 9.73微针几何形状对机械性能的影响已经得到了广泛研究，特别是在LCD 3D打印中[50, 51, 52]。在本研究中，发现圆锥形微针的尖端比六角锥形和方形基锥形微针更加平坦（参见图3a-c）。这种效应归因于LCD系统中的光漂白现象，它倾向于使圆锥形结构的尖端变钝。相比之下，锥形几何形状不太容易受到这种影响，能够更有效地保持尖锐的角度。图3g比较了压缩前后的微针高度，其中实线条表示原始高度，图案条表示压缩后的高度。不同的字母（a, b, A）表示微针设计之间的统计学上显著差异（P < 0.05）。针基部出现皱纹证实了压缩变形的发生。六角锥形和方形基锥形微针的变形比圆锥形设计更大。这可以通过压缩过程中的压力分布来解释，压力分布定义为施加力除以接触面积。由于圆锥形微针的接触面积较大，因此承受的压力较小，导致变形和皱纹较少。如图3g所示，所有微针在压缩过程中都保持了结构完整性，确保了与伤口表面的持续接触，这对于治疗过程中的药物持续释放是有利的。3.2.2 机械性能所有微针几何形状的压缩模量均超过100 Pa（参见图S1）。在本研究中，3D打印的水凝胶被设计为接触伤口的微地形，而不是用于插入的药物输送微针。与必须穿透角质层的经皮微针不同，后者需要尖锐的尖端和高抗断裂强度，接触伤口的微结构水凝胶贴片旨在留在伤口表面。模量在100 -1,000 Pa范围内的水凝胶被认为适用于非侵入性伤口敷料应用，因为它们的柔软性和灵活性能够为伤口表面提供舒适感，同时在使用过程中保持足够的机械强度[53, 54, 55, 56, 57, 58, 59]。在测试的设计中，压缩强度的顺序为圆锥形 > 六角锥形 > 方形基锥形（参见图3h和表3）。这种趋势可以归因于横截面几何形状的差异以及压缩过程中的应力分布[60]。圆形横截面通常比矩形或方形横截面提供更大的抗弯曲能力，而顶点数量、表面积和轴向结构等因素进一步影响强度[61]。具有较大横截面积的设计通常表现出更高的抗断裂力和更好的机械强度[62]。从机械角度来看，水凝胶伤口敷料因此被设计成具有类似组织的机械性能，能够与不规则的伤口表面紧密接触，改善水分保持，并支持抗菌剂的持续表面释放，同时最小化对周围组织的机械刺激。3.2.3 膨胀性能水凝胶的膨胀行为提供了关于其网络结构、机械稳定性、水分传输和药物装载潜力的见解。膨胀比率反映了交联密度，较高的值对应于更松散受限的聚合物链[63]。在35、50和65 °C下进行的膨胀测试显示，在第一个小时内膨胀比率迅速增加，随后达到平衡状态，如图4所示。下载：下载高分辨率图像（431KB）下载：下载全尺寸图像图4. 35 °C（实线）、50 °C（虚线）和65 °C（点线）下微针贴片的膨胀行为：（a）平面形，（b）圆锥形，（c）六角锥形和（d）方形基锥形。快速吸水趋势受水凝胶的组成和交联密度控制。膨胀过程可以分为几个连续阶段。最初，网络中的极性基团结合水分子（初级结合水），导致网络膨胀和内部亲水区域的暴露。这些亲水位点随后吸引并保留了额外的水（次级结合水）。进一步的吸收是由渗透压驱动的，多余的水最终占据链间和孔隙内的自由体积，从而导致进一步的体积膨胀[64]。表4总结了从经验Korsmeyer-Peppas膨胀模型得出的扩散指数（n），进一步揭示了水凝胶基质内的水分传输机制。表4. 使用经验Korsmeyer-Peppas膨胀模型计算的水凝胶的扩散指数（n）和膨胀速率参数（τ）值。几何形状温度（°C）n扩散行为膨胀速率参数值（τ）（分钟）350.24 ± 0.02Fickian15.80500.12 ± 0.01Fickian16.40650.33 ± 0.02Fickian19.23圆锥形350.40 ± 0.06Fickian11.11500.13 ± 0.01Fickian12.50650.99 ± 0.22非Fickian14.29六角锥形350.20 ± 0.03Fickian13.51500.22 ± 0.01Fickian13.00650.51 ± 0.08非Fickian20.22方形基锥形350.23 ± 0.02Fickian11.11500.14 ± 0.01Fickian11.11650.50 ± 0.09非Fickian11.54如图4所示，35 °C代表皮肤和伤口接触的生理相关温度，因此强调在此条件下的膨胀行为以进行应用导向的解释。在50和65 °C下的额外测量是为了检查PEGDA/CMC水凝胶系统的温度依赖性膨胀和传输行为，以支持扩散与网络松弛的机制讨论，而不是为了模拟伤口条件[34, 35, 65, 66]。鉴于已知伤口pH值在愈合和感染过程中会变化，并且广泛用作先进伤口敷料设计中的相关刺激因素，提出了pH依赖性膨胀（例如pH 5.5 vs pH 7.4）作为后续研究，以进一步使膨胀评估与伤口微环境条件对齐[67, 68]。图5a提供了膨胀行为的示意图，显示了有无微针结构的水凝胶之间的明显差异。无微针的PEGDA/CMC水凝胶表现出Fickian扩散，而含微针的水凝胶在35 °C和50 °C时表现出Fickian扩散，但在65 °C时转变为非Fickian传输。这种转变可能与高温下CMC相的部分结晶有关[69]，这限制了水分的渗透。下载：下载高分辨率图像（452KB）下载：下载全尺寸图像图5. （a）有无微针的PEGDA/CMC的膨胀行为示意图，（b）不同温度下PEGDA/CMC水凝胶在平衡状态下的膨胀比率。数据以平均值±标准差（n = 每组3个独立打印样本）表示。条形上方不同的字母表示组间存在统计学上的显著差异（单因素方差分析，使用Tukey事后检验，P < 0.05）。如图5b所示，所有微针几何形状（圆锥形、六角锥形和方形基锥形）在65 °C下的膨胀比率低于35 °C和50 °C。在无微针的水凝胶（平面形）中也观察到了类似的温度依赖性降低，尽管没有非Fickian行为的证据。这种差异可能归因于微针尖端的结晶域的局部化，其更高的浓度比在平坦表面上分布时更有效地限制了溶剂的进入。膨胀速率参数（τ）与膨胀速率成反比，进一步说明了这些效应。较高的τ值对应于较慢的膨胀[29]。如图5b所示，平衡膨胀率随温度升高而增加，尽管这种趋势受到之前描述的结晶限制的调节。为了更好地理解潜在的膨胀机制，进行了动力学建模。根据一级分析（方程6），如果膨胀仅由扩散控制，则ln (Se/(Se – S))与时间的图表应呈现一条直线[29]。如图6所示，这种关系是线性的，证实了扩散是主要贡献因素，但不是唯一的因素[29, 70]。二级动力学（参见图7）揭示了聚合物网络松弛的额外作用，在高温下变得更加明显。这些结果表明，PEGDA/CMC水凝胶的膨胀是由耦合机制控制的，其中溶剂扩散和基质松弛都起作用。这些过程的相对影响随温度和微针几何形状而变化，突出了扩散驱动的吸收与水凝胶网络结构松弛之间的动态平衡[71]。下载：下载高分辨率图像（395KB）下载：下载全尺寸图像图6. 根据方程6，在35 °C（实线）、50 °C（虚线）和65 °C（点线）下，ln (Se/(Se-S))与时间的图表：（a）平面形，（b）圆锥形，（c）六角锥形和（d）方形基锥形。下载：下载高分辨率图像（363KB）下载：下载全尺寸图像图7. 根据方程8，在35 °C（实线）、50 °C（虚线）和65 °C（点线）下，t/S与时间的图表：（a）平面形，（b）圆锥形，（c）六角锥形和（d）方形基锥形。3.2.4 PEGDA/CMC水凝胶中的B-EO装载图8展示了PEGDA/CMC和装载了B-EO的PEGDA/CMC水凝胶的FTIR光谱。在图8a中，约3330 cm-1处的宽带归因于CMC和吸收水的O-H伸缩，而约1636和约1084 cm-1处的峰分别对应于C=O（或结合水）和C-O-C伸缩[73, 74]。加入B-EO后，水凝胶光谱（图8b）在约2929和2854 cm-1处的强度增加，这些与脂肪族C-H伸缩振动相关，表明水凝胶基质中存在精油成分[75, 76]。此外，在图8c中，约1745 cm-1处的峰，归属于酯C=O伸缩，在B-EO装载后变得更加明显[75, 76]。下载：下载高分辨率图像（381KB）下载：下载全尺寸图像图8. PEGDA/CMC和装载了B-EO的PEGDA/CMC水凝胶的FTIR光谱。值得注意的是，约1406和807 cm-1处的特征丙烯酸酯C=C带的消失证实了PEGDA经历了有效的光交联，表明乙烯基团转化为了稳定的交联网络。这一发现表明光聚合过程中的交联效率高，网络形成成功[73, 77]。这些结果验证了B-EO成功融入PEGDA/CMC水凝胶中，且没有破坏交联网络的完整性。PEGDA/CMC和负载B-EO的PEGDA/CMC水凝胶的SEM图像分别显示在图9a和图9b中。PEGDA/CMC水凝胶具有相对密集的结构，孔隙之间的连通性有限，而负载B-EO的水凝胶则表现出更多孔隙和更连通的形态，其特征是孔隙较大且孔壁较薄。这些观察结果表明，B-EO的加入增加了水凝胶基质内的自由体积。

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图9. PEGDA/CMC和负载B-EO的PEGDA/CMC水凝胶的SEM显微图及其对应的EDX光谱，放大倍数为100倍

EDX分析显示，两种水凝胶主要由C和O组成，其中微量Na来自CMC。加入B-EO后，观察到O含量增加而C含量减少，表明表面成分发生了变化。元素分布图进一步证实了检测到的元素在水凝胶基质中的均匀分布。这些结果表明，B-EO成功融入水凝胶，并有助于形成更多孔隙的结构，同时不损害整体均匀性。

3.2.5. B-EO释放速率

将黑孜然籽油（B-OE）加入PEGDA/CMC微针水凝胶中，并浸入PBS溶液中24小时以评估其释放曲线（图10）。随着B-EO通过微针片扩散，其累积释放量逐渐增加。释放行为使用Korsmeyer-Peppas模型进行分析，其中释放指数（n）区分了Fickian和非Fickian机制，如表5所总结。对于未添加微针的PEGDA/CMC水凝胶，释放遵循Case II Fickian机制，表明聚合物松弛和侵蚀是主要驱动力，而不是简单的扩散。在这种机制下，药物释放主要受聚合物稳定膨胀或降解的控制。相比之下，具有圆锥形和方形基金字塔几何形状的PEGDA/CMC微针水凝胶表现出非Fickian传输，表明Fickian扩散和聚合物松弛/降解共同起作用。而六边形微针水凝胶则遵循Fickian扩散，表明B-EO的释放主要受浓度梯度控制，聚合物松弛或侵蚀的贡献较小。

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图10. 负载B-EO的PEGDA/CMC微针水凝胶的B-EO释放累积量与时间的关系图

表5. 各种动力学模型的n值、R2值和动力学参数

模型 n Flat Cone Hexagonal Square-based
Korsmeyer-Peppas 1.05 0.88 0.40 0.55
R2 Flat Cone Hexagonal Square-based
Flat Cone Hexagonal Square-based
Zero order 0.86 0.82 0.67 0.93 0.025 0.026 0.023 0.023
First order 0.86 0.82 0.67 0.93 6.96 7.33 6.45 6.30 6.30 1.95 1.81 1.77 1.02
Second order 0.86 0.82 0.67 0.93 1.95 2.05 1.81 1.77 0.93 0.91 0.92 0.85 0.74 2.09 0.85 0.40 0.43 0.36 0.41 0.36

为了进一步阐明B-EO的释放动力学，应用了包括零级、一级、二级、Higuchi和Hixson-Crowell模型在内的其他动力学模型。相关系数（R2值）和动力学常数显示在图S3–S8中，并在表5中总结。对于未添加微针的PEGDA/CMC水凝胶，Higuchi模型最好地描述了释放曲线，这与Fickian扩散控制的释放一致，释放速率与时间的平方根成正比。圆锥形微针片也遵循这一模型，支持了Korsmeyer-Peppas关于涉及扩散和聚合物松弛的非Fickian传输的早期发现。对于方形基金字塔微针，Hixon-Crowell模型提供了最佳拟合。该模型表明，B-EO的释放与微针的逐渐溶解和降解有关，因为它们的尺寸和表面积随时间减小。值得注意的是，这些微针还表现出最低的压缩强度，这可能在释放过程中导致了结构失效。水分吸收可能进一步削弱了结构，促进了B-EO通过微针的释放。对于六边形金字塔微针，B-EO的释放也符合Fickian扩散，表明B-EO的释放主要受浓度梯度控制。

3.2.6. 抗菌性能

图11显示了使用B-EO、PEGDA/CMC水凝胶和负载B-EO的PEGDA/CMC水凝胶样品与金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）孵育24小时后的盘扩散试验结果。为了确保各组间的公平比较，样品尺寸、接种密度（1.5 × 10^8 CFU/ml）、孵育时间（24小时）和测量协议对所有条件保持一致。结果表明，B-EO对金黄色葡萄球菌表现出显著的抗菌活性，表现为明显的抑制区，但对大肠杆菌几乎没有效果。这种抗菌活性的差异可能与B-EO成分对不同细菌菌株的最小抑制浓度（MICs）有关。B-EO的主要生物活性成分，包括百里醌、对伞花烃、香芹酚和百里氢醌，已知通过破坏细胞膜、改变膜通透性和抑制关键细菌酶来发挥抗菌作用。然而，作为主要成分的百里醌通常对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）的效果较差。大肠杆菌的较弱反应也可能归因于革兰氏阴性菌的结构特征。与革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌不同，大肠杆菌具有富含脂多糖（LPS）的外膜，这作为额外的通透性屏障，限制了许多疏水化合物的渗透。通过这种膜的传输主要由孔蛋白促进，它们优先允许小分子亲水分子通过，从而限制了疏水精油成分进入细胞内目标的途径。此外，外排机制可能进一步减少了抗菌化合物在细胞内的积累。这些因素解释了金黄色葡萄球菌相对于大肠杆菌更高的敏感性，并支持B-EO作为革兰氏阳性菌抗菌剂的更大潜力。

3.2.7. 细胞毒性

细胞毒性测试用于评估材料是否具有导致细胞损伤或死亡的潜力。在本研究中，使用L929成纤维细胞系进行了测试，这是评估医疗器械和材料生物相容性的标准模型。细胞暴露于负载B-EO的PEGDA/CMC微针片后，通过测量暴露后的代谢活跃和存活细胞百分比来确定细胞活力。结果显示100%的细胞存活率（参见表S1），表明该材料在测试条件下没有引起任何细胞死亡、膜损伤或代谢紊乱等细胞毒性效应。这些发现表明，负载B-EO的PEGDA/CMC微针片具有生物相容性，适用于与生物组织的接触应用。然而，需要注意的是，这一评估仅针对体外条件及L929细胞系。

结论

使用LCD-based 3D打印成功制备了含有黑孜然籽油（B-EO）的PEGDA/CMC水凝胶微针片，并对其形态完整性、机械强度、膨胀行为、药物释放动力学和抗菌效果进行了表征。应用Taguchi实验设计（DOE）精确优化了打印参数，确保了微针几何形状的可重复性和良好控制。最佳打印条件为针径800 μm、针高900 μm和层高40 μm，能够制造出定义明确的微针结构，而固化时间对结构完整性影响最小。在研究的三种几何形状中，圆锥形微针表现出最高的机械强度，使其最适合用于皮肤插入和经皮应用。膨胀行为分析显示，在35°C和50°C下为Fickian扩散，而在65°C时转变为非Fickian传输，这是由于温度引起的聚合物松弛和结晶度变化。药物释放研究进一步证明，微针几何形状显著影响B-EO的释放机制。Higuchi模型有效描述了未添加微针的水凝胶以及圆锥形和六边形微针的释放动力学，而Hixson-Crowell模型最适合方形基金字塔微针。抗菌测试证实，B-EO对金黄色葡萄球菌表现出强烈的抑制活性，这归因于其具有破坏膜活性的生物活性成分，但对大肠杆菌的效果有限。使用L929成纤维细胞进行的细胞毒性测试显示了优异的生物相容性，没有细胞损伤、膜破坏或代谢抑制的证据。总体而言，这些发现表明，负载B-EO的PEGDA/CMC水凝胶微针片可作为经皮药物输送的有希望的平台。该系统提供了可调的机械性能、可控的几何依赖性药物释放机制和固有的抗菌活性。这些发现为进一步开发和潜在的临床应用（如伤口护理、感染控制等需要局部和持续输送天然治疗剂的领域）奠定了坚实基础。

关于作者贡献声明：

Manit Nititanakul：撰写 – 审稿与编辑。
Lih-Sheng Turng：撰写 – 审稿与编辑。
Paweena Pattaraudomchok：撰写 – 原始草稿、方法学、调查、数据分析、数据管理。
Chuanchom Aumnate：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、资源管理、概念化。

数据可用性

支持本研究结果的数据可向相应作者索取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。