综述：冷冻电子断层扫描在药物发现和疾病理解中的应用与前景

《Current Opinion in Structural Biology》：Applications and prospects of cryo-electron tomography in drug discovery and understanding disease

　　卡米拉·M·克莱门特 | 胡安-卡洛斯·莫巴雷克 | 坦梅伊·A·M·巴拉特
英国剑桥大学弗朗西斯·克里克大道分子生物学实验室结构研究部门，邮编CB2 0QH

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）正成为结构生物学领域的一项变革性工具。与基于纯化分子的方法不同，cryo-ET能够直接在完整的细胞和组织中观察大分子，保留其天然相互作用和生理环境。通过提供健康和病变细胞的高分辨率图像，cryo-ET为理解感染和疾病机制提供了强有力的手段。此外，结合亚层析平均技术，cryo-ET可以解析超过3 ?分辨率的大分子结构，使其成为计算药物发现的有前景的方法。本文重点介绍了cryo-ET在理解人类疾病方面的最新贡献，并探讨了这项快速发展的技术在基于结构的药物发现中的未来前景。我们提出了一个路线图，以促进其在药理学研究中的广泛应用。

**结构生物学在理解疾病和辅助药物发现方面的不断贡献**
了解目标分子如何相互作用、药物如何改变它们的构象以及这些分子变化如何影响细胞功能，对于治疗创新至关重要。因此，基于结构的方法与其他技术高度协同，可以显著加速药物发现。多年来，X射线晶体学和核磁共振（NMR）的进步为从离子通道到G蛋白偶联受体（GPCRs）等药物靶点的结构提供了革命性的见解[1]，许多现代药物都源于这些开创性的结构研究[2]。最近，在过去十年中，电子冷冻显微镜单粒子分析（cryo-EM SPA）通过实现纯化大分子复合物的原子级分辨率结构，推动了结构研究的飞跃[3]。这一进展得益于显微镜仪器的进步[4]、直接电子探测器的开发[5]以及强大的图像处理算法[6,7]。

除了这些实验方法外，人工智能（AI）驱动的方法也极大地改变了结构生物学。例如AlphaFold2[8]和RoseTTAFold[9]已经证明仅凭序列信息就能近乎实验精度地预测蛋白质结构。更近期地，AlphaFold3[10]和RoseTTAFold All-Atom[11]扩展了这些能力，能够预测完整的生物分子复合物——包括蛋白质-配体、蛋白质-核酸和多组分复合物——极大地扩展了它们在基于结构的药物发现中的应用范围。值得注意的是，这些计算模型可以作为实验流程的改进起点，提供互补的信息。

**cryo-EM SPA对药物发现流程的影响**
cryo-EM SPA通过提供关于药物-靶点相互作用的详细见解，促进了合理药物设计的发展。以SARS-CoV-2刺突蛋白为例，其快速的结构表征直接指导了疫苗的开发[12,13]；针对铜绿假单胞菌致病因子PcrV的抗体设计也基于结构信息[14]。cryo-EM还彻底改变了GPCRs的结构研究[15]，这类靶点占美国食品药品监督管理局（FDA）批准药物靶点的近36%[16]，同时也研究了与神经退行性疾病相关的淀粉样蛋白[17]。这些成就凸显了SPA在结构指导治疗开发和疾病理解中的核心作用。预计cryo-EM技术的未来发展[18,19]将进一步扩展这些见解。

然而，SPA在基于结构的药物发现中存在局限性，尤其是在捕捉配体结合及其在天然细胞或组织环境中的作用机制方面[20]。这是因为SPA通常依赖于目标分子的生化分离和纯化，而这些分子在细胞中的构象可能与纯化后的构象不同，从而可能遗漏仅在天然环境中发生的相互作用[21,22]。这种微观分子细节与细胞和组织层面的生物复杂性之间的知识差距定义了该领域的下一个挑战：结构生物学能否直接扩展到复杂的天然多细胞环境中？

**从还原论模型到细胞景观：cryo-ET的概述**
为了实现这一雄心勃勃的目标，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）作为一种强大的技术应运而生，它能够在保持相关分子相互作用的情况下，直接在天然结构环境中观察大分子，无论是从重组的复合物还是从细胞和组织中观察[20,23]。在本综述中，我们使用的“原位”一词具有更广泛的意义，包括在完整细胞环境（in cellulo）中确定的结构，以及从类似病毒的重组复合物中确定的结构。

cryo-ET涉及获取多个“倾斜”的生物样本图像，并通过计算将其组合成三维（3D）断层图，显示样本的内部排列，分辨率通常为3–4 nm（图1a）。cryo-ET可以与一种称为模板匹配（TM）的补充计算技术结合使用，该技术通过将断层图与参考原子结构进行比较来检测特定的大分子复合物（图1b），从而有效地在原位映射大分子[24]。最近在TM方面的进展，包括从头生成模板和深度学习框架（如DeepFinder[25]、DeePiCt[26]、TomoTwin[27]和2DTM[28]），显著提高了大分子识别的准确性和速度，加深了对细胞内部结构的理解。

**下载：高分辨率图像（708KB）**
**下载：全尺寸图像**

**图1. cryo-ET、TM和STA的示意图。**
(a) 在cryo-ET中，玻璃化的样本相对于电子束逐渐倾斜，倾斜范围通常在±60°之间，并在直接电子探测器上获取图像。所得倾斜序列经过计算对齐并反投影，重建出称为断层图的三维体积。
(b) TM通过将断层密度与已知原子结构（模板）进行比较来定位它们在断层图中的位置，使用适当的评估标准生成3D定位图，用于可视化和分析复合物的空间组织（改编自参考文献[37]）。
(c) 在STA中，从断层图（或SPT中的倾斜图像）中提取包含目标大分子的亚层析图（或子体积）。然后对这些提取的亚层析图进行迭代对齐并平均，生成更高分辨率的密度图，从而有可能解析细胞内大分子的原子结构。

一旦通过TM识别并定位了目标大分子，就可以进一步使用亚层析平均（STA）或单粒子断层扫描（SPT）进行分析，这些方法需要从断层图中提取并平均重复的大分子密度（图1c）。STA（或SPT）可以提供通常从亚纳米到几纳米分辨率的大分子重建，具体取决于目标的丰度和结构均匀性[29, 30, 31, 32, 33, 34]。现代STA软件包已能够在天然细胞环境中实现接近原子级的重建（3–4 ?分辨率）[30,31]，尽管实现足以构建从头算原子模型的分辨率仍然属于例外情况[33, 34, 35]。

对于厚度超过约300 nm的样本（如完整组织或多细胞复合物），可以在cryo-ET之前应用冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削[20]。cryo-FIB用于逐渐消融细胞或组织材料，生成由于弹性散射增加而无法通过cryo-EM观察的薄电子透明层[36]，从而在保持天然环境的同时实现高分辨率成像。cryo-ET结合这些相关工具，代表了结构生物学的一个范式转变，对理解疾病过程和加速药物发现具有直接影响。在本文的其余部分，我们将重点介绍cryo-ET的最新贡献，并展望该技术在未来几年可能在该领域带来的发展。

**原位可视化疾病病理**
cryo-ET可以在分子水平上揭示病变细胞和组织的病理特征，这些特征其他技术难以发现，即使通过视觉检查病变细胞的重建断层图也常常能提供新的见解。结合TM和STA，cryo-ET使研究人员能够比较健康细胞和病变细胞之间大分子复合物的位置、结构和构象。下面列举的例子虽然不全面，但展示了cryo-ET结合TM和STA的一些最新应用，这些应用加深了我们对疾病机制的理解。

通过可视化神经元和神经组织，cryo-ET为神经退行性疾病的分子变化提供了关键见解。早期关于神经元蛋白质稳态的研究结合了cryo-ET、TM和STA，发现静息神经元中只有约20%的蛋白酶体处于活跃状态，揭示了一组在应激条件下可以被激活的非活性复合物[38]。在帕金森病的研究中，cryo-EM在聚焦离子束铣削的神经元中解析了α-突触核蛋白聚集物，显示了纤维状聚集体与细胞器的分布，表明短纤维会引发并促进聚集体的生长[39]。在阿尔茨海默病中，cryo-ET和STA以亚纳米分辨率解析了β-淀粉样蛋白斑块和不同的tau纤维构象，提供了关于致病聚集的机制见解，并为潜在的药物结合位点提供了线索[40]（图2a）。

**下载：高分辨率图像（2MB）**
**下载：全尺寸图像**

**图2. cryo-ET在疾病和感染中的结构洞察。**
(a) 阿尔茨海默病。第一面板显示阿尔茨海默病大脑的断层切片，其中包含细胞外的tau纤维和周围的细胞器，比例尺10 nm。第二面板显示成对的C形原纤维。第三面板显示约8.7 ?的螺旋STA结果。
(b) 纤毛疾病。第一面板显示代表性纤毛顶端的断层切片和根据本研究中描述的亚层析平均生成的3D模型。第二面板显示去膜的纤毛切片（改编自参考文献[43]）。
(c) 细菌感染。第一面板显示附着在宿主细胞上的沙门氏菌微细胞的断层切片。第二面板显示3D分割图，包括膜、T3SS注射体、肌动蛋白和核糖体。第三面板显示T3SS针状结构接触宿主细胞膜并使其弯曲（改编自参考文献[47]）。
(d) 病毒感染。第一面板显示HIV-1核心在同一核孔复合体（NPC）中的连续切片，用紫色箭头标出并编号。NPC、核糖体、显著的核小体、细胞核和核膜均有标注，比例尺100 nm（改编自参考文献[49]）。第二面板显示感染细胞内的病毒工厂，其中包含组装好的核衣壳束，核糖体侵入工厂空间（改编自参考文献[50]）。

同样，cryo-ET结合STA为纤毛及其在纤毛疾病中的破坏提供了重要见解，例如视网膜退化。它揭示了 cargo 运输过程中纤毛内运输列车的结构重塑[41]、驱动纤毛运动的动力蛋白马达的构象动态[42]，以及调节轴丝完整性和长度的顶端相关蛋白的稳定作用[43]（图2b）。此外，cryo-ET解析了由rootletin和相关蛋白组成的根状纤维的天然组织，这些成分将纤毛固定在细胞体上。这些成分的突变会损害纤毛稳定性，导致人类纤毛疾病，如视网膜退化[44]。最后，在肌肉疾病的研究中，cryo-ET阐明了nebulin作为分子尺子的作用，稳定了细纤维，为肌肉疾病的治疗策略提供了关键机制见解[45]。

**cryo-ET在感染研究中的应用**
cryo-ET还揭示了细菌、病毒和寄生虫感染中的宿主-病原体相互作用。对于人类病原体幽门螺杆菌（Helicobacter pylori），cryo-ET揭示了cag类型4分泌系统（T4SS）的体内分子结构，显示这种纳米机器如何在细菌遇到宿主细胞时诱导形成带有侧向通道的膜管。这些通道可能作为将毒力因子直接输送到宿主细胞的通道。cryo-ET成像还展示了H. pylori如何重塑宿主膜以建立感染[46]。同样，在感染沙门氏菌的细胞中，cryo-ET可视化了III型分泌系统（T3SS）注射体与宿主膜的直接接触，捕捉到了转运复合体的原位结构。这种转运复合体使细菌能够将毒力因子注入宿主细胞，操纵细胞过程以促进感染。注射体与宿主膜的紧密关联还触发了膜的重塑，这可能有助于细菌进入并增强其致病能力[47]（图2c）。

对于病毒病原体，最近对HIV-1感染细胞的冷冻光电子显微镜（cryo-CLEM）联合成像技术使人们能够观察到完整的、成熟的锥形衣壳穿过核孔复合体，从而修正了现有的病毒脱壳模型[48]。最近，一种结合了冷冻FIB铣削和冷冻ET的集成相关工作流程，使得能够在核孔跨核导入的不同阶段精确地原位可视化HIV-1核心，同时捕捉到对接和转运中的衣壳[49]（图2d）。对于另一种重要的人类病原体埃博拉病毒，冷冻ET捕捉到了病毒在质膜上组装和出芽的多个阶段，提供了其在天然细胞环境中的复制周期的结构快照[50]。对埃博拉病毒复制工厂的补充研究进一步阐明了病毒核衣壳的细胞内组装过程，揭示了之前未解决的核衣壳与病毒基质的相互作用[51]。在寄生虫中，对导致疟疾的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的冷冻ET研究显示，其生命周期中微管组织存在阶段特异性差异[52]。此外，对恶性疟原虫裂殖子的最新原位分析表明，顶质体（一种对异戊二烯类生物合成等关键代谢途径至关重要的类质体细胞器）被四层膜包围[53]。从药物设计的角度来看，了解顶质体腔与细胞质之间被多层膜分隔的情况对于判断候选药物是否需要穿越这些屏障到达目标部位，或者它们是否可以针对对顶质体功能和维持至关重要的细胞质因子非常重要。

高分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography）在药物相关靶点的研究中取得了重要进展。一项具有里程碑意义的研究直接使用高度优化的流程从单粒子电子衍射（STA）数据构建了一个原子模型，报告了用病毒成熟抑制剂bevirimat处理后的未成熟病毒样颗粒中HIV-1衣壳的3.9 ?分辨率结构。该结构显示了一个六螺旋束，包含了CA（衣壳）-SP1（间隔肽1）切割位点，在未成熟病毒晶格中这一位点无法被蛋白酶访问。据推测，bevirimat通过稳定这一束结构来阻止病毒成熟，从而阻断CA–SP1处的蛋白水解切割[54]。重要的是，这项工作提供了未成熟衣壳-抑制剂复合物的原位结构，将早期分离的衣壳结构扩展到了天然病毒晶格中。自这项研究以来，新的STA软件包如RELION-5和emClarity已经开发出来，能够对同一生物样本进行类似或更好的STA重建[30,55]（图3a）。

下载：下载高分辨率图像（1MB）
下载：下载全尺寸图像
图3. 病原体大分子复合物的冷冻ET和STA。(a) 未成熟HIV-1衣壳（CA-SP1）的STA图，分辨率为3.0 ?，以多种视图展示，改编自参考文献[30]。(b) 与氯霉素结合的肺炎链球菌70S核糖体。对氯霉素处理过的细胞进行STA分析，使得能够在完整细胞内可视化抗生素结合位点[56]。(c) 感染寄生虫的红细胞的分段断层扫描图像，其中Pf-80S核糖体（60S–40S）的STA重建显示了结合的E位点tRNA（橙色），分辨率为4.1 ? [58]。cryo-ET，冷冻电子断层扫描；STA，亚层平均。

接下来，使用M软件框架实现了高分辨率的细胞内STA，该框架采用SPT（或受限单粒子电子显微镜）方法进行精细处理。通过准确校正粒子及倾斜图像级别的辐射诱导样品变形，能够在完整的肺炎支原体细胞内以3.5 ?分辨率可视化与氯霉素结合的70S核糖体。这一结果提供了有力的证据，证明冷冻ET可以在原位提供相关的结构细节，直接观察到核糖体在其天然细胞环境中的抗生素结合口袋[56]（图3b）。值得注意的是，Xu等人（2025年）将分辨率进一步提高到了3.0 ?，从而能够更详细地观察氯霉素在肽基转移酶中心的结合情况[57]。

最近，对感染恶性疟原虫的红细胞的原位冷冻ET和STA分析揭示了核糖体延长周期中的几个天然中间体，展示了翻译抑制剂cabamiquine（CBQ）如何干扰延长因子的结合和核糖体的生物发生。这项研究提供了疟原虫在其天然细胞环境中药物诱导变化的分子水平可视化[58]（图3c）。

总的来说，这些研究表明，冷冻ET、透射电子显微镜（TM）和单粒子电子衍射（STA）的方法创新——无论是在硬件还是计算流程方面——正在实现以前仅限于单粒子电子衍射（SPA）和其他结构技术的关键药物-靶点相互作用的原位可视化。这样的原位结构展示了大分子的“真实”细胞构象，应该会加速基于结构的药物发现过程。

尽管取得了近期进展，冷冻ET仍面临一些根本性限制，这些限制限制了其更广泛的应用。首先，样品制备相对繁琐，涉及FIB铣削和长时间的数据收集，与SPA相比[20]。其次，其固有的低信噪比使得难以达到与SPA相当的分辨率。此外，获得高分辨率结构还依赖于细胞内目标蛋白的自然丰度，因为STA需要大量的目标大分子副本。这些限制影响了可实现的结构细节以及数据在药理学研究中的实际应用。

最近的发展正在逐步克服许多样品制备方面的限制，通过自动化许多与冷冻ET相关的工作流程[59]。使用激光相位板等硬件改进可以显著提高断层扫描质量，同时FIB铣削技术的进步也显著改善了样品制备和层片质量[19,60]。此外，数据分析软件的最新创新显著提高了TM的分辨率并提升了STA的分辨率，使这项技术更接近于成为常规的结构生物学方法，将手动工作时间从几个月缩短到了几天[22]。

将冷冻ET与互补方法结合使用有望增加其在该领域的影响，例如，通过相关质谱成像技术定位细胞和组织中的小分子[61]，或者通过CLEM技术定位药物靶点[62]。同样，将分子动力学模拟[63]和基于AI的大分子建模与冷冻ET结合使用也有潜力在该领域带来重大突破。事实上，AlphaFold预测的模型已经被应用于实验确定结构不可用的冷冻ET图中，从而在中间分辨率下实现蛋白质鉴定和模型构建[64,65]。

总之，我们认为冷冻ET正从一种专门的结构生物学方法发展成为一种具有直接药物应用价值的技术。它能够捕获大分子复合物、构象状态，甚至是在天然环境中的小分子相互作用，这开始重塑了可成药靶点的识别和验证方式。学术界和工业界已经开始利用这些能力，全自动化的流程现在简化了数据采集和分析过程。展望未来，持续提高通量、分辨率以及与互补计算和成像方法的集成对于结构药理学的下一次革命至关重要。