马铃薯糖苷生物碱在加热条件下的稳定性——与脂肪酸的反应

《Current Research in Food Science》：Stability of potato glycoalkaloids under heating conditions – Reactions with fatty acids

　　凯文·米陶 | 克里斯蒂娜·迈耶斯 | 哈沙德拉伊·M·拉韦尔 | 英加·斯米特 | 马库斯·施密特 | 萨沙·罗恩
柏林工业大学，食品技术与食品化学研究所，Kaiserin-Augusta-Allee 14，10553 柏林，德国

**摘要**
糖苷生物碱（GA）是茄科植物的内源性代谢物，通常被视为污染物。然而，它们在高温食品加工过程中的稳定性和反应性（如炸土豆和油炸）尚未得到全面研究。因此，本研究的目的是通过研究新反应产物的形成来表征GA在热诱导反应中的反应性。基于GA可能存在于细胞膜中并可能与脂质和两亲化合物反应的假设，结合对反应产物的初步筛选结果，本研究重点关注了GA与（内源性）脂质的反应。为此，将纯GA与脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸）在油炸常用的温度（180°C）下进行孵育。通过多级高分辨率质谱和液相色谱-串联质谱技术对形成的反应产物进行了表征。发现了两条新的反应途径：GA通过糖部分的羟基与脂肪酸发生酯化反应，以及甾体生物碱部分的氧化反应。此外，在不添加食用油的情况下，也在加工后的土豆基质中验证了这些产物的形成，这表明酯化反应来源于土豆块茎中的内源性脂肪酸。因此，本研究的结果有助于理解GA在土豆制品热加工过程中的化学命运。然而，仍需确定其总生成量，并进行毒理学研究以评估这些反应产物对人类营养的影响。

**1. 引言**
糖苷生物碱（GA）主要在茄科植物（如土豆（Solanum tuberosum）、番茄（S. lycopersicum）或茄子（S. melongena）的组织中形成（Ammar等人，2025；Martínez-García等人，2026；Friedman，2006，2015；Zhao等人，2021）。土豆中最主要的GA代表是α-龙葵碱（结构1，图1）和α-查科宁碱（2，图1）。这些物质通常集中在表皮及其下层，而在果肉中的含量较低。在发芽过程中，块茎中的GA合成会增加，尤其是在发育中的芽中。然而，土豆中的GA因其潜在的毒理学效应而广为人知，尤其是在食用绿色发芽的土豆或大量土豆皮时（Friedman，2006；Milner等人，2011；EFSA，2020）。

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**图1.** 实验概述，用于研究GA与脂肪酸的反应性并验证其在加热土豆基质中的存在。在模型实验中，α-龙葵碱和α-查科宁碱分别与选定的脂肪酸进行加热（参见第3.2节“通过HRMS解析氧化的龙葵啶结构”，第3.3节“模型系统中α-GA及其反应产物的色谱分离和质谱检测”，第3.4节“模型系统中GA的转化和反应产物的形成”）。对于某些模型实验，从土豆芽中提取并分离GA。在HRMS实验中（参见第3.1节），使用新鲜土豆皮进行筛选；而在LC-MS/MS实验中（参见第3.5节），将冻干土豆皮粉末用水重新水化并加热以验证土豆基质中的反应产物。

α-龙葵碱和α-查科宁碱由相同的亲脂性苷元龙葵啶（3，图1）和不同的三糖组成。α-龙葵糖由L-鼠李糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成；而α-查科糖由两个L-鼠李糖单元和D-葡萄糖组成（Friedman，2006；Kuhn等人，1955a，1955b；Zhao等人，2021）。由于这些化学结构包含极性和非极性部分，两亲性是它们在不同生物体内发挥生物活性的主要原因（Milner等人，2011）。含有较小糖类的相关化合物被称为β1-GA和β2-GA（当一个糖部分被水解时），以及γ-GA（当两个外层糖部分在酸性条件下被水解时）（Friedman等人，1993）。除了加工过程中导致的水解外，这些化合物还可能以生物合成的天然中间体的形式以微量存在（Baur等人，2021；Cárdenas等人，2015）。一些研究表明，水解产物的生物活性似乎低于α-GA（Milner等人，2011；Rayburn等人，1994）。虽然已知通过去皮（机械去除）和煮沸（渗入水中）可以降低食品中的GA含量（M?der等人，2009a，2009b），但选择合适的土豆品种和适当的储存方法也可以保持较低的GA含量（Petersson等人，2013）。然而，关于GA在进一步食品加工过程中的化学降解情况知之甚少，尤其是在高温条件下，如煎饼或炸薯条的油炸过程中。特别是在后者过程中，温度通常达到170至180°C，且片状物通常油炸3至5分钟（Arslan等人，2018）。关于油炸过程中α-GA减少的科学数据很少。文献中报道的减少幅度从几乎0%到超过80%不等（EFSA，2020；Martínez-García等人，2025；Raters等人，2024；Rytel，2012；Rytel等人，2018；Tajner-Czopek等人，2014）。这些有限且存在争议的报告引发了关于GA在加热过程中稳定性的讨论。然而，目前尚未全面解决GA在土豆加工过程中的降解命运。据我们所知，尚未有研究报道在将土豆加工成主要食品（包括薯条或炸薯条）过程中形成的具体化学转化途径。除了假设可能发生热诱导的水解外，迄今为止尚未报道其他反应产物，如片段或加合物。这与欧洲食品安全局（EFSA）的风险评估一致，该机构表示“尚未发现关于GA降解产物的化学性质的信息”（EFSA，2020）。

一般来说，块茎中的所有内源性化合物理论上都可能在高温下与GA发生反应，提供了多种反应伙伴的可能性。脂质可能是GA的合理反应伙伴，因为GA被认为存在于细胞膜中。由于其两亲性质和与甾醇的复杂结合（Keukens等人，1995，1996；Roddick & Rijnenberg，1986），GA可能与细胞膜中的（磷）脂质相互作用。这种机制——GA融入细胞膜——也是其在哺乳动物中具有毒性的原因。然而，土豆块茎的总脂质含量通常较低，占鲜重的0.1%至0.2%，主要分布在表皮和维管组织中（Ramadan & Oraby，2016）。新鲜块茎中的游离脂肪酸浓度也较低，通常报告为每克鲜重几微克，大约2至4 μg，仅占总脂肪酸的很小一部分（Spychalla & Desborough，1990）。Lilja和Lingert（1989）指出，由于组织破坏和脂肪酶活性，加工过程中游离脂肪酸的水平可能会显著增加，达到每克鲜重约25 μg。

基于这一假设，本研究的核心假设是GA普遍容易发生热诱导的转化。进一步假设它们可以与土豆基质中的内源性化合物（特别是两亲化合物如磷脂或脂肪酸）反应。在油炸或深炸过程中，食用油是另一种可能的脂质反应伙伴。因此，还假设食用油会影响脂质反应产物的形成。因此，本研究旨在表征α-GA在热诱导反应中的稳定性及其反应性，以及在含有棕榈酸、硬脂酸、油酸和α-亚麻酸的模型体系中的反应产物形成。随后，在加热的土豆基质中调查了反应产物的存在情况。鉴于表皮及其下层中的GA和脂质含量较高，预计在土豆皮和带皮产品中会发现更多的GA衍生反应产物。为了验证所有这些假设，使用高分辨率质谱对加热后的土豆皮进行了反应产物筛查。在模型实验中表征潜在反应产物后，使用靶向LC-MS/MS方法分析了土豆样品中是否存在这些产物（图1）。为了评估食用油的作用，还使用了葵花籽油加热的土豆基质进行了后续实验。

本研究的主要目标是识别新的产物，而不是对潜在降解或反应产物的毒理学风险评估。只有当化学结构完全确定并且潜在化合物以纯化形式获得时，才能进行后续实验（如定量和毒理学风险评估），从而制定有效的风险沟通策略。

**2. 材料与方法**
首先，将富含GA的土豆皮加热并筛查潜在的反应产物（参见第3.1节）。然后，建立了由纯α-GA（α-龙葵碱和α-查科宁碱）与选定脂肪酸组成的模型体系，并在180°C下加热（图1）。随后进行了多级质谱实验以了解反应产物的化学结构（参见第3.2节）。此外，使用LC-MS表征了反应产物的形成（参见第3.3节“模型系统中α-GA及其反应产物的色谱分离和质谱检测”，第3.4节“模型系统中GA的转化和反应产物的形成”），并通过LC-MS/MS的多反应监测（MRM）模式验证了不同土豆基质中这些反应产物的存在（参见第3.5节）。

**2.1. 化学试剂**
α-龙葵碱和α-查科宁碱购自PhytoLab GmbH & Co. KG（德国Vestenbergsgreuth）。乙腈（超纯级）和甲酸（LC-MS级）购自Merck KGaA（德国Darmstadt）。甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级）、二氯甲烷和氯仿购自VWR International GmbH（德国Darmstadt）。棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸购自TCI Deutschland GmbH（德国Eschborn）。磷酸（85%）购自Bernd Kraft GmbH（德国Duisburg）。

**2.2. 样品**
用于GA提取的土豆（Solanum tuberosum，品种‘Linda’）从当地超市购买，并在室温下光照条件下存放几天直至发芽。仅使用富含GA的芽进行提取。此时，品种的选择仅基于超市的可用性。用于进一步土豆基质实验的土豆（品种‘Agria’）从柏林附近的当地农贸市场购买，收获后不久使用。这些土豆在实验室使用前被存放在阴凉黑暗处几天。这些土豆既未变绿也未发芽。选择‘Agria’品种是因为它广泛用于生产需要高温的炸薯条。该品种的糖含量较低（Abbasi等人，2012），脂质含量适中（0.22%的鲜重，Abbasi等人，2012），GA含量为39–110 mg/kg鲜重（Abbasi等人，2012；Kasnak & Artik，2018；Najm等人，2018；Urban等人，2018）。

**2.3. 糖苷生物碱标准品的制备**
GA的提取和分离按照Kozukue等人（1999）的方法进行，并稍作修改。增加了额外的纯化步骤，需要更多的样品和溶剂。简要来说，将12克约1厘米长的冻干绿色芽研磨（IKA Multidrive C S000，IKA-Werke GmbH & CO. KG，Staufen，德国），并在室温下用150 mL氯仿/甲醇（2:1，v/v）混合物中提取三次，每次30分钟，并进行超声处理。有机提取物被合并后进行过滤（使用Büchner漏斗；型号MN 615，直径110毫米，Machery-Nagel GmbH & Co. KG公司，德国杜伦），然后通过旋转蒸发去除溶剂（设备包括IKA RV10 auto、IKA HB digital、IKA Vacstar digital，IKA-Werke GmbH & CO. KG公司，德国施陶芬）。剩余物用100毫升0.2摩尔浓度的盐酸在室温下通过超声波处理30分钟（设备为Elma Transsonic 460 H，Elma Schmidbauer GmbH公司，德国辛根），之后再次过滤。所得溶液用30毫升25%的氨水碱化，在60摄氏度下孵育60分钟，随后置于-30摄氏度下过夜。沉淀物通过离心分离（2700×g，Eppendorf 5804，Eppendorf SE公司，德国汉堡），并在Büchner漏斗中用10毫升5%的氨水洗涤三次。洗涤后的沉淀物通过旋转蒸发完全干燥。绿色杂质用少量二氯甲烷冲洗，而大部分GA未溶解。白色残留物中含有96±4%的α-茄碱和α-查科宁，两者的比例为38:62（±3；见图S6），这一比例是通过HPLC-UV方法确定的（参见第2.8节），并与市售的参考化合物进行了比较。在提取物中还检测到了β-GA、γ-GA以及茄啶。

2.4. 使用马铃薯基质的实验
为了通过HRMS筛选潜在的反应产物（参见第3.1节），新鲜马铃薯（品种‘Agria’，参见第2.2节）经过水清洗并手工去皮。去皮后的马铃薯在Heraeus UT 6烤箱（Heraeus Holding GmbH公司，德国汉诺威）中以180摄氏度加热5分钟，然后使用IKA Multidrive C S000设备（IKA-Werke GmbH & CO. KG公司，德国施陶芬）进行匀浆处理，随后用1毫升甲醇通过超声波处理60分钟提取50毫克马铃薯物质。提取物通过PTFE材质的注射过滤器（孔径0.45微米，直径13毫米，VWR international LLC公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺）进行过滤。

2.5. 通过LC-MS/MS验证化合物
为了验证这些化合物（参见第3.3节关于α-GA及其反应产物的色谱分离和质谱检测，以及第3.4节关于GA转化和反应产物形成的模型系统），新鲜马铃薯（品种‘Agria’，参见第2.2节）同样经过水清洗并手工去皮。马铃薯皮和果肉在-30摄氏度下冷冻，随后进行冻干（设备为Christ LOC-1M，Alpha 2–4 unity，Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH公司，德国奥斯特罗德），然后研磨。将50毫克样品转移到一个未密封的玻璃小瓶中，并加入100毫升水进行复水。在室温下孵育1小时后，将小瓶放入180摄氏度的烤箱中加热2.5、5、10、15、20、30、45、60和120分钟。干燥后的残留物在室温下冷却，再用1毫升甲醇通过超声波处理60分钟提取。在LC-MS/MS测量之前，样品需通过注射过滤器过滤。通过冻干样品后再用水复原的过程制备出均匀的样品，以证明在不同加热时间下反应产物的形成情况（重复三次实验）。

2.6. 模拟煎炸油的影响
为了模拟煎炸油的影响（见图S4和图S5），将50毫克冻干的马铃薯皮研磨物转移到玻璃小瓶中，并加入100毫升水进行复水。在室温下孵育1小时后，加入25毫升葵花籽油，然后将小瓶放入180摄氏度的烤箱中加热30分钟，随后按照之前的方法进行提取和测量。

2.7. 模型实验的制备
对于第3.2节中描述的模型系统，将25微克α-茄碱标准品（28.8纳米摩尔）或25微克α-查科宁标准品（29.4纳米摩尔）溶解在50毫升甲醇中，并与85微克硬脂酸（300纳米摩尔，溶于50毫升叔丁基甲基醚中）混合。反应混合物在未密封的玻璃小瓶中以180摄氏度加热5分钟。加热后，样品在室温下冷却，再用1毫升甲醇通过超声波处理30分钟提取。

2.8. α-茄碱和α-查科宁的HPLC-UV分析
α-茄碱和α-查科宁的HPLC-UV分析按照Distl和Wink（2009年）的方法进行，但对洗脱梯度进行了轻微调整。使用的HPLC设备为Agilent Infinity 1260高效液相色谱系统（Agilent Technologies Inc.公司，美国加州圣克拉拉），配备Agilent G6470A三重四极杆质谱检测器（电喷雾离子化源，正离子模式）。分离使用XBridge? BEH Amide柱（3.5微米，内径130埃，长度250×4.6毫米，Waters Corp.公司，美国米尔福德）。设置如下：柱温30摄氏度；流速0.8毫升/分钟；洗脱液A为0.1%的甲酸水溶液；洗脱液B为乙腈；洗脱程序为0分钟时10% A，2分钟时10% A，12分钟时50% A，18分钟时50% A，20分钟时10% A，运行结束后5分钟仍为10% A；进样体积2微升；脱溶剂气体为氮气；脱溶剂气体温度200摄氏度；气体流速11升/分钟；雾化器压力35磅/平方英寸；鞘气温度275摄氏度；鞘气流量11升/分钟。检测采用多重反应监测（MRM）和选离子监测（SIM）方法，其中[M+H]+为质子加合物的m/z值（SIM模式下为离子质量，MRM模式下为前体质量）。对于所有未氧化的化合物，选择m/z 98.1作为产物离子；对于所有氧化的化合物，选择m/z 120.1作为产物离子。选择这些离子是因为它们的强度最高，且分别只存在于天然或氧化的GA中。实际上，马铃薯中的游离脂肪酸含量非常低（每克鲜重仅2至4微克；Lilja和Lingert，1989年；Sychalla和Desborough，1990年）。

2.9. 新化合物的高分辨率质谱（HRMS）分析
HRMS分析采用正离子模式进行，使用Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL?离子阱质谱仪（配备Ion Max ESI源，Thermo Fisher Scientific Inc.公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。样品溶解在甲醇中，稀释后的反应混合物通过注射泵以15微升/分钟的流速注入。使用瑞斯平（0.05毫克/毫升）作为质量校准标准。对于多级碎裂（MSn），氧化和未氧化的茄啶的碎裂能量设为40（见图3A&B），查科宁硬脂酸酯和氧化α-茄碱的碎裂能量设为55（见表S1A和S1B）。质谱解析使用Freestyle 1.8 SP2 QF1软件（Thermo Fisher Scientific Inc.公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

3. 结果与讨论
3.1. 马铃薯皮中反应产物的HRMS表征
为了研究马铃薯薯片和炸薯条加工过程中GA的转化情况，采用直接注入HRMS方法监测较小的GA β-和γ-衍生物及反应产物的形成。图2显示了未经外部（煎炸）油处理的马铃薯皮甲醇提取物的质谱图。由于马铃薯皮中的GA含量通常高于马铃薯肉质，因此推测在热处理后会产生更多的反应产物。使用正离子模式的电子喷雾离子化技术，根据精确质量将最丰富的信号归属于含有一个氮原子的分子。其中大多数是质子化的GA及其反应产物。

图2. 在180°C下加热5分钟后马铃薯皮的高分辨率质谱图。重复出现的质量差15.9949 Da用“Δ16 Da”标记，对应于一个氧原子的差异。α-chaconine（m/z 852.5095）的假设反应用黑色箭头表示：鼠李糖的水解（–146.0575 Da, m/z 706.4520，与β1-solanine相同m/z）、氧化（–6.0466 Da, m/z 846.4629），或与乙酸（+42.0106 Da, m/z 894.5201）、棕榈酸（+238.2294 Da, m/z 1090.7389）或亚油酸（+262.2299 Da, m/z 1114.7394）的酯化反应。

最强烈的信号归属于质子化的α-chaconine（[M+H]+ m/z 852.5095，定义为100%）。α-solanine倾向于形成单电荷离子（[M+H]+, m/z 868.5044）和双电荷离子（[M+H+Na]2+, m/z 445.7468；见图S1），后者的m/z为868.5044。α-solanine和α-chaconine之间的质量差15.9949 Da（“Δ16 Da”，见图2）是一个有用的区分标志。这个值基于一个氧原子，是由于α-chaconine的糖苷部分含有两个6-脱氧糖基团（见图1），而α-solanine仅含有一个（见图1）。这种差异也存在于已知的水解产物m/z 706.4520（对于β1-chaconine、β2-chaconine和β1-solanine）和m/z 722.4469（对于β2-solanine）之间。

在m/z 890到1150的范围内（见图2右侧），检测到强度低于7%的未知成分信号，它们的m/z也相差一个氧原子（m/z 894.5201和910.5150、1090.7389以及1114.7342和1130.7344）。根据它们的精确质量，α-GA与这些新化合物之间的差异暂时被归类为化学式C2H2O（Δm/z 42.0106）、C16H30O（Δm/z 238.2296）和C18H30O（Δm/z 262.2299），这些很可能是与有机酸的缩合产物。由于棕榈酸（总脂肪酸的15-20%）和亚油酸（50-61%）在马铃薯脂质中的普遍存在（Galliard, 1973），因此怀疑它们是主要结合物。类似地，m/z 894.5201和910.5150的信号被归类为α-GA与乙酸的酯。对于β1/2-chaconine和β1-solanine（m/z 706.4520 → 748.4625、944.6814和968.6813）、β2-solanine（m/z 722.4469 → 764.4573、960.6768和984.6750）以及γ-GA（m/z 560.3941 → 602.4048、798.6235和822.6232）也检测到了类似的反应产物。这些反应产物的后续验证通过第3.3至3.5节描述的模型实验和LC-MS/MS分析进行了验证。

除了上述的酯化反应外，还检测到了原始GA的其他衍生物。其中一些被假设为三氧化的α-chaconine和氧化的α-solanine，因为它们的m/z分别为846.4629和862.4576，与α-chaconine和α-solanine相比分别相差6.0466 Da和6.0468 Da。

3.2. 通过HRMSn对氧化的solanidine进行结构解析
为了进一步了解酯化和氧化GA的化学结构，分别将α-solanine和α-chaconine与硬脂酸在180°C下加热5分钟后得到的样品提取物使用多级高分辨率质谱（HRMSn）进行分析。α-chaconine硬脂酸酯和氧化α-solanine的碎片模式分别列在表S1A和S1B中。在α-chaconine硬脂酸酯的碎片过程中，只有在糖仍然连接的情况下才能检测到酯（例如，β-chaconine硬脂酸酯，m/z 972.7145），表明酯化发生在糖基团上。在氧化α-solanine的碎片过程中，尽管发生了糖的水解，氧化结构仍然存在于碎片离子上。检测到了氧化的β-solanines（m/z 716.4006和m/z 700.4006）、γ-solanines（m/z 554.3476）和solanidine（m/z 392.2949）作为碎片，表明氧化发生在甾体生物碱部分。

为了表征氧化的甾体部分的结构，进一步分析了m/z 398.3391（solanidine，见图3A）和m/z 392.2923（氧化solanidine，见图3B）。理论上，这种碎片可以通过串联实验研究，例如涉及原始（m/z 868.5044 → 398.3391 → ）和氧化（m/z 862.4585 → 392.2923 →）α-solanine的碎片，或者直接从原始（m/z 398.3391 → ）和氧化（m/z 392.2923 →）solanidine的碎片进行研究，后者是通过上述模型中的水解形成的。由于通过水解形成的solanidine衍生物的强度较高，并且其精确质量可以更确定地确定，因此选择了这些进行解释。为了解释碎片模式，图3中的离子被分为三组（完整碎片列表见表S3）：I）不含氮的离子，存在于氧化和非氧化苷元的光谱中（见图3A&B，绿色）；II）仅由氧化（见图3B）或非氧化solanidine（见图3A）形成的离子对，它们也相差6 Da，所有这些离子都含有一个氮原子（橙色）；III）既不属于I组也不属于II组的离子，主要在氧化或非氧化solanidine的碎片过程中形成（见图3A&B，蓝色）。

m/z 157.1003和253.1935的离子在两个碎片离子光谱（见图3A&B）中都存在，且丰度较高，不含氮，因此属于I组。它们的组成分别被归类为C12H15+和C19H25+。除了这两个碎片离子外，还有其他仅由碳氢化合物组成的碎片离子，因此也属于I组（见表S3）。大多数这些碳氢化合物碎片在两个光谱中的强度相似。这表明氧化不发生在A、B、C和D环上，尽管这些环中已经存在不饱和的C-C键。

m/z 321.2430和327.2900以及m/z 120.0800和126.1269的离子对仅由氧化（见图3B）或非氧化solanidine（见图3A）形成，质量相差6 Da。由于它们含有氮，因此可以归类为II组。假设这种质量差是由氧化引起的。由于这四个碎片离子都含有氮，氧化似乎发生在杂原子的附近——要么在E环，要么在F环。

对于m/z 321.2430和327.2900的离子，提出了A环的碎片过程，留下了一个未配对的电子，该电子由B环中的不饱和C-C键稳定。m/z 126.1269的离子已在Cahill等人（2010）对非氧化solanidine的碎片过程中描述过，由F环组成。类似地，在氧化solanidine的碎片过程中形成了m/z 120.0800的碎片，其m/z小6 Da。根据Cahill的碎片结构假设，这个碎片具有类似吡啶的结构，但F环被氧化。

在考虑双键的位置时，还必须考虑氧化solanidine的能量特性，因为更稳定的产物更受青睐。由于环状结构，预期会形成芳香化合物，其π电子价必须符合Hückel规则。三个双键可以排列在六元F环（哌啶衍生物）中，从而形成符合Hückel规则的吡啶inium衍生物。相比之下，在五元E环（吡咯衍生物）中，只需要两个π键就能形成芳香环（吡咯衍生物）。第三个双键/氧化必须发生在分子的其他位置，与芳香环无关。这意味着会有双氧化的衍生物。由于没有证据表明存在双氧化的solanidine，因此暂时假设三氧化的solanidine具有芳香的F环。

这一假设得到了氧化solanidine的m/z 158.0955和非氧化solanidine的m/z 150.1268形成的支持。这两个碎片离子都包含E环和F环，来源于D环的碎片。对于m/z 150.1268，提出了E环的吡咯结构（见图3A）。相比之下，由于F环的假设性氧化，似乎不太可能形成类似的F环碎片。此外，在非氧化solanidine的碎片过程中更倾向于形成m/z 98.1的碎片离子。为了避免混淆其他碎片，这些HRMSn实验的范围限制在m/z 100到m/z 392和398之间。在氧化solanidine的碎片中没有发现m/z 98.1的碎片（未显示），这支持了F环被氧化的假设。然而，在LC-MS/MS分析中，m/z 98.1的产物离子被选为所有非氧化GA的产物离子，而m/z 120.1的产物离子被选为氧化GA的产物离子。

由于反应产物混合物复杂，后续分离是一项困难的任务。因此，目前的研究范围还无法分离这些反应产物并明确阐明它们的化学结构。相反，已经初步确定了它们的化学结构，进一步的研究应侧重于通过核磁共振（NMR）光谱提供必要的额外证据。

3.3. 在模型系统中对α-GA及其反应产物进行色谱分离和质谱检测
为了更深入地了解新型化合物的性质，通过将α-solanine和α-chaconine与感兴趣的脂肪酸以十倍摩尔比加热进行了模型实验。图4显示了在180°C下加热5分钟后模型系统中与棕榈酸反应产物的色谱图。

图4. 在180°C下加热5分钟后α-solanine和α-chaconine与棕榈酸反应产物的色谱图。A) α-chaconine（m/z 852.5 → 98.1）、三氧化α-chaconine（m/z 846.5 → 120.1）和棕榈酸α-chaconine酯（m/z 1090.7 → 98.1）；B) α-solanine（m/z 868.5 → 98.1）、三氧化α-chaconine（m/z 862.5 → 120.1）和棕榈酸α-chaconine酯（m/z 1106.7 → 98.1）；C) β1-chaconine、β2-chaconine和β1-solanine（m/z 706.5 → 98.1）、三氧化β1-chaconine、β2-chaconine和β1-solanine（m/z 700.5 → 120.1）以及β1-chaconine、β2-chaconine和β1-solanine的棕榈酸酯（m/z 944.7 → 98.1）。

在模型系统中，检测到了所有的水解产物（例如β1/2-chaconine、γ-chaconine和solanidine）。此外，还发现了假设的酯（例如α-chaconine + 棕榈酸 – H2O）以及所有水解产物的氧化产物（例如α-chaconine – 3×H2）（参见第3.4节）。对于α-solanine也发现了类似的化合物（例如α-solanine + 棕榈酸 – H2O）（见图4）。

保留时间和峰的数量提供了关于化合物结构的重要信息。由于使用了HILIC柱进行色谱分离，极性的α-GA比非极性的β-GA或GA脂肪酸酯洗脱得更晚。氧化GA与原始GA相比具有更长的保留时间，这得出了两个结论（见图4A）。首先，可以排除氧化GA仅在ESI过程中形成的可能性，因为否则保留时间应该是相同的。相反，它们必须是热处理的结果。其次，由于保留时间较长，氧化GA比原始GA稍微更具极性。

关于α-GA和棕榈酸的酯，检测到了多个峰。考虑到α-solanine有九个羟基，可能会形成多达九种潜在的构象异构体。实际上，色谱图至少显示了六个独立的峰（见图4B）。同样，棕榈酸α-chaconine酯的色谱图显示了五个峰（见图4A）。羟基数量和峰数量的这种差异可以通过形成具有相似空间排列的异构体来解释，例如通过l-鼠李糖中的C3和C4处的赤道羟基以及d-葡萄糖中的C2、C3和C4处的羟基形成的α-龙葵碱酯，这些异构体的保留时间相似。与其它异构体相比，形成了两种α-龙葵碱酯，而α-查科宁似乎只有一种异构体最为常见。这可能是由于d-葡萄糖基或d-半乳糖基上的伯羟基，α-龙葵碱有两个伯羟基，而α-查科宁只有一个。由于空间原因，伯羟基是更好的亲核试剂，因此更有可能形成酯（Dimakos & Taylor, 2018）。当Horton和Lauterback（1969）在室温下将1-甲基葡萄糖与乙酸酐以等摩尔比在吡啶中孵育时，四个剩余羟基的乙酰化比例大约为C6处40%，C4处20%，C3处20%，C2处20%。这支持了本研究的结果。类似于α-GA，还发现了氧化的β-GA和至少三种β-GA棕榈酸酯的构象异构体（图4C）。

为了深入了解新型反应产物的形成机制，在含有硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、亚油酸（C18:2）和α-亚麻酸（C18:3；图5）以及硬脂酸甘油三酯（图S2和图S3）的模型系统中测定了α-GA的降解动力学，同时也在没有脂质的条件下单独加热进行了研究。此外，还监测了GA的各个反应产物的形成（水解产物、与脂肪酸的酯、氧化产物和“混合产物”，图5）。为了更好地概述，图5和图6显示了相应物质的总量（例如，图5A中的α-查科宁和α-龙葵碱作为α-GA）。

单独处理纯α-GA（“对照”）并未导致α-龙葵碱和α-查科宁的显著转化（图5A、图S2和图S3A&B）。因此，只检测到少量水解产物（图5B），没有其他反应产物（图5C-E）。由于脂肪酸主要存在于食品系统中的三酰甘油中，最初将α-GA与硬脂酸甘油三酯孵育（图S2，n = 1）。在这个反应系统中，观察到α-GA的适度降解，可能是由于先前的硬脂酸甘油酯水解以及随后游离脂肪酸与GA的反应。实际上，当α-GA与脂肪酸孵育时，观察到了更高的转化率（图5A），因此用于进一步研究。在这些模型系统中，α-龙葵碱和α-查科宁的转化速率相似（图S3A和B）。然而，使用多不饱和脂肪酸时转化率更高（图5A）。例如，在加热30分钟后，与多不饱和脂肪酸孵育后仅检测到初始α-GA的10%，而在与油酸或硬脂酸的二元系统中分别仍有约20%或30%的α-GA剩余。在含有游离脂肪酸的模型系统中，水解产物β-GA（β1-龙葵碱、β2-龙葵碱和β2-查科宁的总和，图5B）、γ-GA和苷元龙葵啶（图S3C和D）在加热过程开始时就已存在。2.5分钟后，所有模型系统中β-GA和龙葵啶的浓度同时增加。然而，在含有多不饱和脂肪酸的系统中，水解产物的浓度在5分钟后再次下降，而在含有饱和脂肪酸的系统中，浓度增加到更高的水平（图5B和图S3D）。γ-GA的量仅在含有饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的模型系统中增加，而在含有多不饱和脂肪酸的系统中没有增加（图S3C）。

α-GA脂肪酸酯的形成动力学与β-GA的形成类似（图5C）。2.5分钟后，每种酯的浓度几乎相同，而在5分钟后，含有饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的模型中酯的浓度进一步增加，而含有多不饱和脂肪酸的模型中酯的浓度减少。加热30分钟后，相应模型系统中α-GA和饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸的酯更多。在某些情况下，甚至检测到了二酯（图S3E）。不能排除也发生了更高程度的酯化。然而，预计浓度低于检测的潜在限值。如第3.1节“马铃薯皮中反应产物的HRMS表征”和第3.3节“模型系统中α-GA及其反应产物的色谱分离和质谱检测”所述，也可以找到水解产物的酯。同样，β-GA棕榈酸酯的数量最多（图S3I和J）。

在含有多不饱和脂肪酸的孵育混合物中，氧化α-GA的形成最快（图5D）。然而，即使使用饱和脂肪酸，也发生了显著的氧化。与酯和水解产物类似（图5B&C），在含有α-亚麻酸的系统中5分钟后浓度达到最大值，之后浓度下降。然而，不同脂肪酸的孵育在统计上没有显著差异。所有水解产物（如β-GA、γ-GA和苷元）都发现了氧化形式（图S3F–H）。类似于氧化的α-GA，含有四种不同脂肪酸的模型系统中氧化水解产物的浓度也相似。

还检测到了同时氧化和酯化的反应产物（图5E和图S3K）。图5E展示了一个由三种不同反应类型产生的示例性反应产物。只有在使用饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸时观察到显著的生成。然而，这些分析物的相对丰度较低，可能是由于多重平行反应途径和形成的反应产物数量较多。

图5显示了几次测量的相对较大的误差条，这可能妨碍了显著差异的直接视觉识别。数据来自在不同天进行的三次实验。在每次重复实验中，同时准备了具有不同脂肪酸系统和加热时间的样品，并进行了相同的分析程序。尽管严格标准化了加热和处理参数，但仍存在相当大的变异性。尽管如此，所有重复实验和模型系统都显示出一致的反应曲线，定性结果具有可比性，支持了定性趋势的稳健性。变异性主要与最大响应强度和表观反应速率的差异有关。这种行为表明，即使在严格控制的条件下，涉及的反应途径也极易受到外部因素的影响。

为了估计形成的反应产物数量，采用SIM模式测量了分析物。假设所有分析物在电喷雾离子化过程中都在甾体氮上质子化，则可以预期所有分析物有相似的响应。基于这一假设，可以比较不同分析物的积分峰面积。加热2.5分钟后，β-GA的相对峰面积为7–10%（图5B），α-GA脂肪酸酯的相对峰面积为2–4%（图5C），氧化α-GA的相对峰面积为7–12%（图5D）。长时间加热后，含有硬脂酸的模型系统中反应产物的总面积不超过15%。鉴于SIM模式下分析物确切响应因子的不确定性，通过三种途径形成的量似乎是可比的。由于三种途径似乎以相似的速率进行，它们可能对GA的整体转化贡献程度相似。从机制角度来看，这三种途径是独立发生的。

图6示例性地展示了之前提到的GA衍生物的反应产物的暂定结构：水解产物β1-查科宁（4），与亚油酸形成的酯的主要构象异构体（5），氧化的α-查科宁（6），以及由α-查科宁（2）和亚油酸组成的混合物中的主要构象异构体，即与亚油酸和氧化β1-查科宁形成的酯（7）。此外，还在模型系统中识别出基于GA的水解、氧化和酯化的多种其他反应产物，如图7所示。显然，不同的途径会产生相同的产品，并可以连续或并行发生。从α-GA开始，糖的水解可以分步骤进行，例如释放单个单糖或整个三糖以形成β-GA或苷元（蓝色）。γ-GA的形成首先需要形成β1-或β2-GA，因为两个外侧糖基团不能一步水解。

图5显示了几个测量的相对较大的误差条，这可能妨碍了显著差异的直接视觉识别。数据来自在不同天进行的三次实验。在每次重复实验中，同时准备了具有不同脂肪酸系统和加热时间的样品，并进行了相同的分析程序。尽管严格标准化了加热和处理参数，但仍存在相当大的变异性。尽管如此，所有重复实验和模型系统都显示出一致的反应曲线，定性结果具有可比性，支持了定性趋势的稳健性。变异性主要与最大响应强度和表观反应速率的差异有关。这种行为表明，即使在严格控制的条件下，涉及的反应途径也极易受到微妙外部因素的影响。

为了估计形成的反应产物数量，采用SIM模式测量了分析物。假设所有分析物在电喷雾离子化过程中都在甾体氮上质子化，则可以预期所有分析物有相似的响应。基于这一假设，可以比较不同分析物的积分峰面积。加热2.5分钟后，β-GA的相对峰面积为7–10%（图5B），α-GA脂肪酸酯的相对峰面积为2–4%（图5C），氧化α-GA的相对峰面积为7–12%（图5D）。长时间加热后，含有硬脂酸的模型系统中反应产物的总面积不超过15%。鉴于SIM模式下分析物确切响应因子的不确定性，通过三种途径形成的量似乎是可比的。由于三种途径似乎以相似的速率进行，它们可能对GA的整体转化贡献程度相似。从机制角度来看，这三种途径是独立发生的。

图6示例性地展示了之前提到的GA衍生物的反应产物的暂定结构：水解产物β1-查科宁（4），与亚油酸形成的酯的主要构象异构体（5），氧化的α-查科宁（6），以及由α-查科宁（2）和亚油酸组成的混合物中的主要构象异构体，即与亚油酸和氧化β1-查科宁形成的酯（7）。此外，还在模型系统中识别出基于GA的水解、氧化和酯化的多种其他反应产物，如图7所示。显然，不同的途径会产生相同的产品，并可以连续或并行发生。从α-GA开始，糖的水解可以分步骤进行，例如释放单个单糖或整个三糖以形成β-GA或苷元（蓝色）。γ-GA的形成首先需要形成β1-或β2-GA，因为两个外侧糖基团不能一步水解。

理论上，只要存在羟基——无论是来自糖还是苷元——就可以找到所有GA的脂肪酸酯（“+ FA”）。一旦形成，酯也可以根据个别稳定性和整个反应途径的平衡再次水解（橙色）。由于酯化发生在糖苷残基上，脂肪酸酯可以通过糖的水解共同消除（紫色）。此外，所有GA（包括含有和不含有脂肪酸酯的龙葵啶）都可以发生氧化（“– 3×H2”），因为氧化发生在分子的不同部分，而酯化则不同（参见第3.2节；绿色）。虽然酯化是一个可逆过程，但由于能量稳定性，氧化几乎是不可逆的。此外，氧化只能发生一次，而酯化可以在分子的多个位置发生。

由于描述的三种反应——水解、酯化和氧化——可以同时发生，因此预期会有大量的GA衍生物反应产物。因此，每种反应产物的形成量都很少。由于这些反应可以同时发生并且似乎具有相似的速率，反应途径在早期就变得复杂，每种脂肪酸通过其独特的动力学增加了反应的复杂性。在土豆基质的情况下，预计路径的分支会更加复杂。一般来说，最初诱导的转化步骤（如α-GA脂肪酸酯的形成）对于所有脂肪酸来说似乎以相似的速率进行。这与Hartman等人（1966）的发现一致，他们报告说从甘油和此处使用的四种脂肪酸形成的酯的速率没有显著差异。假设该机制基于糖部分的羟基对脂肪酸的亲电羧基碳的典型亲核攻击。然而，在后续反应中出现了差异，特别是在多不饱和脂肪酸存在的情况下，反应进行得更快。因此，在含有饱和脂肪酸的模型系统中，中间反应产物倾向于积累到更明显的程度。尽管详细动态仍然难以确定，但从理论上讲，可能有几个因素导致在含有多不饱和脂肪酸的系统中GA的转化加速。首先，酸度的差异可能起作用。不饱和脂肪酸表现出较低的pKa值（硬脂酸：10.15；油酸：9.85；亚油酸：9.24；α-亚麻酸：8.28；Kanicky & Shah, 2002）。这种增加的酸性可能促进GA的质子催化水解。其次，在含有不饱和脂肪酸的系统中，自由基介导的过程可能更为显著，因为多不饱和脂肪酸中的烯丙基氢原子在氧气存在下容易被抽取，从而导致脂质自由基、活性氧物种和次级自由基中间体的形成（Choe和Min, 2006；Porter等人, 1995；Pratt等人, 2011；Tietel等人, 2023）。这些物种可能会增强系统的整体反应性。除了与脂质相关的机制外，GA的热处理还可能导致糖苷部分的水解，释放出还原糖。这些糖可能会进一步发生反应，如焦糖化或美拉德反应（Hodge, 1953），从而形成活性羰基化合物。因此，模型系统可能涉及脂质衍生的自由基、糖降解产物和酸性环境中的氧气之间的复杂相互作用。尽管在含有多不饱和脂肪酸的系统中自由基的形成似乎更有可能，但在含有饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的模型系统中检测到的氧化GA的数量相似。这表明脂质氧化产物不太可能是GA氧化的主要驱动因素。相反，GA的氧化可能主要通过内在反应途径进行，或者自由基物种可能在竞争性副反应中被消耗，从而限制了它们对GA氧化的净贡献。总之，可以预期多种部分重叠的机制共同作用于GA的降解。虽然酯的形成可以通过典型的酸催化反应来解释，但GA的氧化可能涉及酸催化和羰基介导的转化的复杂相互作用，可能还伴随着自由基反应。然而，在含有不饱和脂肪酸的系统中α-GA的更快减少表明，可能还有其他涉及活性氧物种的反应途径也参与了GA的降解。目前，现有的数据还不足以得出明确的机制结论。进一步的研究，例如使用含有分离的反应中间体、自由基清除剂、无糖苷底物或控制氧气供应和pH值的系统，将提供有关各个途径的宝贵见解，并更详细地了解GA降解的机制。

3.5. 类食物基质中反应产物的存在
在模型系统中，鉴定出了多种化合物。为了展示它们在真实类食物基质中的存在，通过HILIC-MS/MS（MRM模式）分析了加热后的马铃薯皮中的前体离子、碎片离子和之前在模型系统中描述的化合物的保留时间。因此，将冻干马铃薯皮粉末重新水化并在180°C的烤箱中加热长达120分钟。图8显示了类食物基质中GA衍生物反应产物的存在：α-查科宁和棕榈酸的酯（图8A）、三氧化α-查科宁（图8B）、β-查科宁和棕榈酸的酯（图8C）以及三氧化β-查科宁（图8D）。这四种化合物在加热2.5分钟后就已经被检测到（图8E-H）。随着进一步加热，浓度持续增加，在60分钟和120分钟时达到最高浓度。在相同块茎的类似加热的马铃薯肉质样本中也检测到了这四种化合物，但其浓度明显低于加热后的马铃薯皮。图8中仅示例性地展示了基于查科宁和棕榈酸酯的化合物。类似地，也形成了茄碱和其他脂肪酸的酯。实际上，由于亚油酸是马铃薯脂质中最常见的脂肪酸，因此可以检测到亚油酸的酯，其强度略高（Galliard, 1973）。此外，在这些复杂基质中加热120分钟后还检测到了其他反应产物，如三氧化β-查科宁和棕榈酸的酯以及三氧化茄啶和棕榈酸的酯。然而，这些化合物的信号非常弱，表明其浓度较低。总体而言，在更复杂的基质中反应产物的形成似乎较慢。此外，在简单的模型中使用了游离脂肪酸。显然，在天然基质中，脂质是酯化的并嵌入在不同的细胞器中。最初假设煎炸油可能是反应伙伴的来源，因为它在炸薯片和炸薯条的过程中提供了主要的脂质。在迄今为止的所有实验中，都没有添加额外的油/脂肪。因此，GA脂肪酸酯的形成必须来源于马铃薯的内源性脂肪酸。此外，还进行了向马铃薯基质中添加葵花籽油的实验。然而，向类食物基质中添加油并随后加热并没有显著增加反应产物的数量（图S4和图S5）。从化学角度来看，这可能是因为煎炸油中的脂肪酸以三酰甘油的形式存在，对于糖组分的极性羟基来说过于非极性，无法与三酰甘油发生反应。相比之下，两亲性的GA可以通过与甾醇形成复合物而嵌入细胞膜中（Milner等人, 2011）。因此，GA与细胞膜脂质的反应性似乎更高。从食品技术的角度来看，煎炸过程中只有少量的煎炸油进入产品，因为水分的蒸发和一定程度的外壳形成阻止了其进入。只有在水分蒸发并且油开始渗入食品的细孔后，才能预期薯片和炸薯条中的脂肪含量会增加（Arslan等人, 2018；Bouchon等人, 2001；Ziaiifar等人, 2008）。因此，由于α-GA是相对极性的糖苷，预计它们会留在马铃薯产品中，因此与煎炸油的显著反应仅发生在产品与煎炸油的界面。只有有限的研究报告了在煎炸油中检测到显著的α-GA（Friedman, 2006）。因此，不预期GA与煎炸油会有显著的反应。然而，随着α-GA转化和修饰过程中物质的非极性增加，它们迁移到煎炸油中的潜力也会增加。当然，有必要对实际马铃薯产品（如薯片和炸薯条）中的煎炸油的作用进行更详细的研究。

为了评估这些新型反应产物的毒理学和生理学方面及其对人类饮食的相关性，需要进一步的研究。α-茄碱和α-查科宁可以通过两种机制引起毒性症状：首先，通过与胆固醇形成复合物破坏（哺乳动物）细胞完整性，并由于糖部分的三维结构导致膜膨胀（Keukens等人, 1995；Milner等人, 2011；Rayburn等人, 1994）；其次，抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，其中甾体生物碱的氮在抑制过程中起关键作用（Millner等人, 2011；Roddick等人, 1989；2001）。这两种机制都可能受到形成的反应产物化学结构改变的影响——糖部分的转化以及随后的膨胀变化，还有生物碱氮附近的氧化以及随后的酶抑制变化。在最坏的情况下，这种影响可能会更强。然而，也可能更弱。未来的研究需要进行后续的风险评估。基于这两种毒理学机制，这应该通过酶抑制测定或关于细胞膜完整性的细胞毒性实验来进行。

4. 结论
本研究提供了关于GA在模型系统以及加热马铃薯基质中对脂肪酸稳定性和反应性的见解。首次描述了新的GA反应产物，如脂肪酸酯和氧化GA（图6，暂定结构建议）。这些产物来源于内源性脂质，与预期相反，煎炸油似乎并未促进GA脂肪酸酯的形成。除了在模型系统中的形成外，它们也在类食物基质（加热后的马铃薯皮粉末，图8以及加热后的马铃薯粉末）中被证实存在。此外，在模型系统中还鉴定出了许多由GA的水解、氧化和酯化组合产生的其他反应产物（图7）。有理由假设所有这些途径也可能发生在真实食品样品（如薯片和炸薯条）的加工过程中。由于这些反应产物在加热后的马铃薯基质中被检测到，它们可能作为马铃薯热处理的标志物，包括广泛消费产品的加工。由于GA和脂质在块茎的皮层及其附近含量不成比例地高，因此在加热后的马铃薯皮中观察到更多的反应产物。因此，预计含有（残留）皮层的薯片和炸薯条中的这些反应产物含量更高。对这些化合物进行全面量化以及确定其加工过程中的条件和程度仍然是必要的。随后需要进行毒理学研究，以评估它们对人类饮食的潜在影响。然而，分离这些化合物对于它们的全面表征至关重要，因为这为通过NMR进行绝对结构解析、通过LC–MS/MS进行准确定量以及随后的风险评估提供了基础。同时，由于形成的化合物结构多样且浓度低，这一步骤仍然具有很高的挑战性。总体而言，结果表明热处理诱导了糖生物碱的多种转化途径，导致了以前未识别的化合物的形成。这些发现强调了需要将当前的分析方法扩展到包括它们的转化产物，这对于基于马铃薯的食品的毒理学评估也可能具有相关性。

未引用的参考文献
Abbasi等人，2011；Schrenk等人，2020；Hartman，1966；Horton和Lauterbach，1969；Najm等人，2012；Roddick，1989。

CRediT作者声明
Keven Mittau：概念化、方法论、验证、正式分析、调查、数据管理、撰写 - 原稿、可视化、项目管理；
Christina Meyers：概念化、撰写 - 审阅与编辑、项目管理；
Harshadrai M. Rawel：方法论、验证、资源、撰写 - 审阅与编辑；
Inga Smit：撰写 - 审阅与编辑、项目管理、资金获取；
Marcus Schmidt：撰写 - 审阅与编辑、项目管理、资金获取；
Sascha Rohn：概念化、方法论、资源、撰写 - 审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。

在准备这项工作时，作者使用了DeepL和ChatGPT来提高手稿的可读性和语言表达。使用这些工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。