《Archives of Virology》：Wyeomyia confusa Lispivirus (WcLispV-SP): a novel neotropical mosquito virus in the Lispiviridae family
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对在大西洋森林 (巴西圣保罗州 Pindamonhangaba) 采集的 Wyeomyia confusa 蚊子进行宏转录组学 (Metatranscriptomic) 分析，鉴定出一种先前未表征的病毒，命名为 Wyeomyia confusa 利斯皮病毒 (
对在大西洋森林 (巴西圣保罗州 Pindamonhangaba) 采集的 Wyeomyia confusa 蚊子进行宏转录组学 (Metatranscriptomic) 分析，鉴定出一种先前未表征的病毒，命名为 Wyeomyia confusa 利斯皮病毒 (Wyeomyia confusa Lispivirus, WcLispV-SP)，分类上隶属于利斯皮病毒科 (Lispiviridae) 的 Canmovirus 属。该病毒基因组由一条长度为 12,698 个核苷酸的负义单链RNA (Negative-sense single-stranded RNA, ssRNA?) 组成，编码六个开放阅读框 (Open Reading Frames, ORFs)：核衣壳蛋白 (Nucleoprotein, N)、两个假想蛋白 (Hypothetical Proteins, HP/1 和 HP/2)、糖蛋白 (Glycoprotein, G)、ORFan 蛋白以及 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA Polymerase, RdRp-L)。系统发育分析支持将 WcLispV-SP 归类为 Canmovirus 属内的一个独特物种。对 RdRp 的结构分析揭示了单分子负链 RNA 病毒目 (Order Mononegavirales) 成员所特有的保守结构域和催化基序，支持了其功能完整性。这些发现扩展了利斯皮病毒科 (Lispiviridae) 的已知多样性，并凸显了宏基因组学 (Metagenomic) 方法在发现和表征与新热带森林蚊子相关的 RNA 病毒方面的效用。
研究背景、问题与目的
Wyeomyia confusa 属于蚊科 (Culicidae) 的 Wyeomyia 属，是一种主要栖息于新热带区 (如亚马逊雨林) 潮湿热带生态系统，特别是大西洋森林等野生环境的蚊子。其幼虫主要在凤梨科植物积水 (Phytotelmata) 中发育。该属蚊虫并非人类虫媒病毒 (Arbovirus) 的主要传播媒介，但既往研究曾在大西洋森林的 W. confusa 样本中检测到寨卡病毒 (Zika virus)，提示其可能作为病毒宿主或储存宿主。全球范围内，由登革病毒 (Dengue virus)、黄热病毒 (Yellow fever virus)、寨卡病毒和基孔肯雅病毒 (Chikungunya virus) 等引发的疫情，凸显了监测蚊媒病毒多样性、发现新型病毒以评估潜在流行病学风险的重要性。特别是在生物多样性热点地区，如巴西的大西洋森林，利用宏转录组学等高通量测序方法，是发现和表征与野生蚊虫相关的、此前未被描述病毒的关键技术。本研究旨在通过对采集自巴西圣保罗州 Pindamonhangaba 大西洋森林的 W. confusa 蚊子进行宏转录组学分析，鉴定并系统表征其中新型病毒，以增进对利斯皮病毒科 (Lispiviridae) 病毒多样性、系统发育及其在自然环境中进化生态学的理解。本论文发表于《Archives of Virology》。
主要技术方法
研究人员对 2019 至 2020 年在巴西圣保罗州多个城市采集的蚊子进行分群，其中重点分析了来自 Pindamonhangaba 市 Parque Natural Municipal do Trabiju 森林地面的样本 (Meta17 池，包含 44 只雌性 W. confusa 个体)。对样本进行匀浆、过滤、RNA 提取，使用 Illumina MiSeq 平台进行高通量测序。生物信息学分析流程包括：使用 FastQC 和 Trimmomatic 进行原始数据质量控制和接头修剪；使用 rnaviralSPAdes 进行从头组装 (De novo assembly)；通过 Kraken2 进行初步分类学分析；使用 DIAMOND 比对 Serratus RdRp 数据库筛选病毒序列，并通过 BLASTn/BLASTp 比对 NCBI GenBank 进行验证确认。病毒基因组特征通过 ORFfinder 和保守结构域分析工具进行解析。系统发育分析 (Phylogenetic analysis) 采用最大似然法 (Maximum likelihood, ML) 在 IQ-TREE 中完成，节点支持度通过 1000 次自举法 (Bootstrap) 评估。此外，还使用 SWISS-MODEL 对 RdRp 蛋白进行了三维结构建模，并使用 UCSF Chimera 进行可视化。
研究结果
1. 分类学鉴定
对 Meta17 文库的 897 个重叠群 (Contigs) 进行 Kraken2 分类显示，病毒序列仅占 0.11%。通过 DIAMOND 分析 Serratus RdRp 数据库，鉴定出三个与 RNA 病毒相关的重叠群，其中一个被归类为利斯皮病毒科 (Lispiviridae)。研究人员选择对此利斯皮病毒科相关序列进行重点表征。
2. Wyeomyia confusa 利斯皮病毒 (WcLispV-SP) 的基因组特征
该病毒基因组 (GenBank 登录号 PX992751) 为一条 12,698 个核苷酸的负义单链 RNA (ssRNA?)。通过 Bowtie2 将原始读段比对回该基因组，获得平均测序深度 33.96×，支持基因组组装完整。该基因组编码六个开放阅读框 (ORFs)，依次为：核衣壳蛋白 (N)、两个假想蛋白 (HP/1, HP/2)、糖蛋白 (G)、ORFan 蛋白以及 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp-L)。其基因组结构与利斯皮病毒科成员一致，具有预测的 3‘ 端前导序列 (Leader, 51 nt) 和 5’ 端尾随序列 (Trailer, 213 nt)。BLASTn 比对显示，该病毒与先前在巴西 Sabethes quasicyaneus 蚊子中发现的 Pedras Lispivirus (OQ779241.1) 具有 81.12% 的核苷酸序列一致性。蛋白质序列比对分析进一步揭示了与不同 Sabethes 属蚊子来源的 Pedras Lispivirus 蛋白在不同 ORF 上的相似性和差异性。
3. 利斯皮病毒科的结构域与保守基序分析
对 WcLispV-SP 的 RdRp 进行结构域和基序分析，鉴定出四个保守结构域：单分子负链 RNA 病毒目 RNA 依赖性 RNA 聚合酶结构域 (Mononegavirales RNA-dependent RNA polymerase domain, Mononeg_RNA_pol)、单分子负链 RNA 病毒目 mRNA 加帽区 V 结构域 (Mononegavirales mRNA-capping region V domain, Mononeg_mRNAcap)、病毒加帽甲基转移酶结构域 (Virus-capping methyltransferase domain, Methyltrans_Mon_2nd) 以及 FtsJ 样甲基转移酶结构域 (FtsJ-like methyltransferase domain, FtsJ)。其中，Mononeg_RNA_pol 结构域包含催化核心的三个关键基序 A、B 和 C。三维结构建模显示，这些催化基序在 WcLispV-SP 的 RdRp 和同源的 Canmo_PELV (即 Pedras Lispivirus) RdRp 中空间排列高度保守。多重序列比对分析发现，在利斯皮病毒科的 53 个 RdRp 序列中，基序 A (xxxDxxxWNxxx)、基序 B (xGxxQKxWT) 和基序 C (GxxDNQxx) 具有高度保守的氨基酸模式，这些基序在 RNA 合成、模板结合和金属离子配位中起关键作用。
4. 系统发育分析
基于 53 个利斯皮病毒科 RdRp 蛋白序列构建的最大似然法系统发育树显示，WcLispV-SP 与 Pedras Lispivirus (Canmo_PELV) 形成一个高支持度 (Bootstrap 值 1000) 的单系群。物种划分工具 (Species Demarcation Tool, SDTv) 分析显示两者 RdRp 蛋白序列一致性为 81.1%，低于国际病毒分类委员会 (ICTV) 为利斯皮病毒科设定的同一属内不同物种的阈值 (<85%)。结合 BLASTp 分析结果 (100% 覆盖度，81.12% 一致性)，这些证据支持 WcLispV-SP 是 Canmovirus 属中的一个新物种。
讨论与总结
讨论部分总结：本研究发现并表征的 WcLispV-SP 扩展了人们对与新热带森林蚊子，特别是大西洋森林生物群落相关的病毒多样性的认知。该病毒与在巴西其他州 (如马拉尼昂州、米纳斯吉拉斯州) 的 Sabethes 属蚊子中发现的 Pedras Lispivirus 在系统发育上密切相关，表明利斯皮病毒科成员可能广泛分布于巴西不同地区占据相似生态位的森林蚊子中。本研究存在一定局限，如使用单个包含 44 个个体的混合样本池 (Meta17)，这限制了对病毒真实流行率和个体感染模式的评估；此外，缺乏实验验证 (如 PCR、RACE) 来确认基因组末端。尽管如此，严格的生物信息学流程和一致的基因组覆盖度支持了该病毒基因组的真实性和完整性。WcLispV-SP 的发现支持了新热带生态系统蕴藏着大量未被探索的病毒多样性的观点。虽然目前没有证据表明利斯皮病毒可感染脊椎动物，但对这类野生蚊媒病毒的研究有助于理解病毒-宿主相互作用的长期进化动态，为评估潜在的病毒“溢出” (Spillover) 风险提供背景信息。该研究凸显了宏基因组学监测在野生蚊子种群中的重要性，并有助于完善当前对利斯皮病毒科多样性、进化及宿主关联的认识。
结论翻译：在本研究中，研究人员对一种与 Wyeomyia confusa 蚊子相关的新型病毒 (WcLispV-SP) 进行了基因组表征，该病毒发现于从巴西圣保罗州 Pindamonhangaba 大西洋森林采集的样本中。系统发育分析和基于遗传距离的指标表明，根据 ICTV 制定的划分标准，WcLispV-SP 代表了隶属于利斯皮病毒科 (Lispiviridae) 的 Canmovirus 属中的一个新物种。这些结果表明，宏基因组学是一种有效的病毒监测和发现工具，能够识别在生物多样性高的环境中静默传播的病毒谱系。为了预测潜在的溢出风险并理解病毒在节肢动物中的进化动态，有必要进行更多的研究。这将有助于在公共卫生和“一体健康” (One Health) 框架下，制定综合的基因组监测和环境监测策略。
