在分析物过滤后，仍有大量分析物被低估了

《Environmental Chemistry Letters》：Substantial underestimated quantities of analytes following analyte filtration

　　在所有研究复杂介质的学科中，如生物学、化学、医学、毒理学、地质学、农业和环境科学，样品预过滤是一种常规程序，用于在仪器分析之前从液体样品中去除固体和其他不需要的物质。这通常被称为“纯化步骤”，使用的是假设为“惰性”的过滤材料，应该能够提高结果的质量。然而，过滤器是由可以吸附和保留目标分析物的材料制成的。此外，随着样品中分析物浓度的降低，被吸附的分析物量应该会增加。换句话说，在痕量水平下，低估真实分析物浓度的风险会大大增加。因此，过滤是一个常见的程序，可能会引入显著的误差，有时会导致假阴性结果，而且往往不易被察觉。因此，基于分析物水平的政策和法规可能会低估有毒化合物的真实健康和生态风险。在这里，我们讨论了关于在玻璃纤维、醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚丙烯、聚偏二氟乙烯和聚四氟乙烯膜上过滤过程中铅、萘、甲苯、酚、雌二醇、雌酮、双氯芬酸、环孢素以及全氟和多氟烷基物质等分析物损失的文献数据。对97个案例的荟萃分析显示，分析物损失的平均值为41.9%，范围从0%到100%不等。这一观察结果表明，在所有使用过滤进行分析的科学学科中，真实的分析物水平几乎是测量值的两倍。最后，由于过滤膜大多由微米级厚度的聚合物制成，这里讨论的现象与污染物和塑料碎片（如微塑料）之间的相互作用密切相关。

为什么在分析前要过滤溶液？各种类型的分析仪器，包括高效液相色谱（HPLC）、紫外-可见光（UV-Vis）光谱法和气相色谱-质谱法（GC-MS），在实验室中常用于检测和定量水基质中的溶解有机化合物。这些仪器需要清澈、无固体的样品，不含复杂的、不需要的物质，以提供准确的定量分析结果。例如，在固体的溶剂提取物中，高度极性化合物、寡聚物和聚合物的存在会降低色谱分辨率、色谱柱和GC-MS中的离子源寿命；这在地球化学中的“未分离的复杂混合物”（UCM）中尤为常见[1, 2]。

有多少化合物被过滤器保留？然而，一个经常被忽视的过滤问题是，通常由合成聚合物制成的膜盘和注射器过滤器在实验室样品预处理过程中会保留大量的分析物，平均保留率为41.9%，范围从0%到100%（图1；表1）。这种损失可能会影响后续分析测量的准确性。此外，随着分析物浓度的降低，膜过滤器保留的分析物百分比可能会增加，因为吸附位点与分析物分子的比例更高。因此，在较低的分析物浓度下，这种分析偏差会更加明显。

图1
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过滤装置可以通过从样品中保留分析物来显著减少样品中测量到的分析物量。左上角：原始的、直径47毫米的即用型膜盘，可以安装在实验室真空过滤装置中，用于从样品液体中去除固体。右上角：用于实验室的三分支真空过滤装置。图片显示了一个用于收集滤液的过滤瓶和侧面的隔膜真空泵。左下角：市面上可购买的注射器过滤器，右下角图片中展示了一个正在使用的过滤器。过滤器外壳上的颜色环和字母印刷用于标识膜材料和标称孔径。除了膜盘外，注射器过滤器（其内部装有微滤膜）也常用于环境实验室、化学实验室、法医和诊断测试实验室中，在分析测量之前从样品（如水样和生物液体）中去除固体和其他不溶性物质。图片来自不同的制造商和供应商：UltiDent Scientific [3]、Hawach Scientific [4]、Pall Corporation [5] 和 Fisher Scientific [6]。

表1 使用注射器过滤器进行实验室过滤时分析物的损失情况，显示了不同类型分析物、过滤膜材料以及不同分析物浓度和过滤体积的结果。缩写和单位已标准化，以保持一致性，但不改变其在参考文献中的原始含义。过滤引起的分析物损失的分析影响通常被忽视，主要取决于过滤体积、分析物浓度以及分析物对膜材料的亲和力。这种损失在样品通过膜过滤器时迅速发生，通常不受操作参数（如膜通量）的影响[7, 8]。由于大多数膜过滤器由基于碳氢化合物的聚合物制成，这种未考虑的分析物损失在涉及膜过滤的实验室过滤过程中是普遍存在的。

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尽管微滤膜和注射器过滤器已在研究实验室中使用了几十年，但过滤引起的分析物损失这一缺点多年来未被报道，并且在大多数已发表的报告中仍未得到解决。关于基于膜的实验室过滤过程中分析物损失的证据出现在20世纪90年代末[11]。这一现象现在得到了关于痕量有机化合物（也称为“微污染物”）的最新研究的支持。这些化合物包括工业增塑剂、药品和个人护理产品中的活性成分，以及许多内分泌干扰化合物，其中许多在室温下在水中的溶解度很低[18]。除了某些全氟烷基和多氟烷基物质（PFAS）既疏水又疏油外，痕量有机化合物通常具有中等到高的亲脂性，水溶性低，在中性pH条件下溶解时呈中性状态。这些特性使得这些化合物特别容易被基于碳氢化合物的膜过滤器保留。自21世纪初以来，越来越多的研究表明分析物在各种膜过滤器上的显著吸附[7,8,9,10,11,12,13,14,15,17,19]。

不可预测的误差
1999年至2024年间，有少量证据表明，实验室过滤可能会由于分析物在膜过滤器上的吸附而引入显著的、通常是不可预测的误差[7,8,9,10,11,12,13,14,15,19]。这种现象影响了广泛的化合物，包括全氟烷基和多氟烷基物质（PFAS）[7, 9]、萘和甲苯[11]、药品和类固醇激素[8, 10, 17, 19]、工业化学品如双酚[12, 17]、生物毒素[13]，甚至溶解在水中的无机物质如铅[14]。这些未考虑的损失可能导致食品中生物毒素的潜在低估高达100%[13]，眼科药物输送中的药物损失超过90%，平均为32%[10]，以及生物反应器中药物去除率的过高估计，以及环境样品中这些药物化合物的低估超过90%[19]。未能考虑这些损失可能会损害数据的完整性，并可能导致错误的结论。

对过滤保留的研究揭示了驱动这一现象的具体因素。例如，疏水性和烷基链长度与某些PFAS化合物在膜过滤器上的吸附增加直接相关[7, 9]，而特定的分子相互作用（如氢键）会导致某些分析物在尼龙膜上的几乎完全保留[8, 17]。此外，膜材料被发现是分析物回收的关键决定因素。虽然聚四氟乙烯（PTFE）[10, 12]、聚丙烯（PP）[10, 14]、玻璃微纤维（GMF）[8]和混合纤维素酯（MCE）[14]膜因其对某些分析物的低保留率而被推荐，但没有一种材料能普遍适用于广泛的分析物。实际上，在其他关于聚丙烯（PP）[8]和玻璃微纤维膜过滤器[14]的研究中报告了相反的结果，显示样品中分析物的显著损失。除了这些因素外，样品基质也起着重要作用[9]。因此，这些证据表明，实验室过滤过程中分析物损失的程度最终由分析物的性质、膜材料以及样品基质决定。

保留机制
这种膜-分析物相互作用的主要机制是非共价键合，涉及分析物和膜聚合物之间的非极性和极性相互作用。当样品液体通过膜时，这种相互作用会立即发生。在大多数情况下，分析物的性质（如亲脂性）、分析物浓度、滤液体积和膜材料是影响膜保留的分析物总量的主要因素。过滤器外壳也可能导致注射器过滤器或其他基于膜的过滤器中的分析物损失。

一般来说，分析物在室温下的高水溶性（例如数百到数千毫克/升）或大过滤体积（例如数百毫升或更多）可以将膜或膜过滤器对分析物的总体影响降低到较低或可忽略的水平。然而，对于高亲脂性的分析物（因此水溶性低，例如在低或亚毫克/升范围内）以及小样品体积（例如几毫升或几十毫升），膜和膜过滤器对分析物的保留可能会降低真实的分析物水平，导致假阴性结果[8, 9, 17]，甚至影响整个操作，例如在药物输送中[10]。

此外，一些中等亲脂性的极性有机化合物在通过某些类型的膜过滤时也会表现出显著的保留。例如，使用尼龙[8, 17]或聚醚砜膜[20]过滤含有酚类分析物的水样时，这些分析物包括各种工业增塑剂、杀虫剂、抗氧化剂以及内源性和合成激素[18, 21,22,23]。对于这些分析物，它们的酚羟基（Ar?OH）可以与膜上的极性位点形成强而定向的氢键相互作用。这加强了膜-分析物的结合，可能导致实验室样品中的分析物大量损失（表1）。

分析物损失的缓解
通常发现，在纯水溶液中分析物损失较高，有趣的是，在存在溶解有机物质（DOM）的情况下可以缓解这种损失。例如，使用相同的注射器过滤器时，Milli-Q水中的21种PFAS的平均损失为26 ± 23%，而在含有溶解有机物质的水中为19 ± 19%[9]。后者是通过将富含碳的土壤层与10 mM NaNO3在pH 5的Milli-Q水中摇晃24小时，液固比为40，然后通过0.45-μm玻璃纤维过滤器过滤，并用Milli-Q水稀释至10毫克/升溶解有机碳制备的[9]。DOM的缓解机制如下：DOM天然存在于环境水样中，它可以作为天然载体或“溶剂相”，通过其有机基质有效稳定疏水性分析物[24]。通过与物理上不可分离的DOM部分结合，分析物被保留在溶解相中，使其作为复合物通过膜过滤器而不是附着在膜表面。

通过调整样品pH值以使分析物化合物离子化[8, 15]或在过滤前向样品中添加可混溶的有机溶剂（例如乙醇/水1/1 v/v [8]或甲醇/水1/1 v/v [9]）也可以缓解损失。在用有机溶剂混合样品时，用户必须注意溶剂-水混合物可能会洗脱出与固体和其他不溶性物质结合的分析物和其他有机化合物，从而增加样品中自由溶解的分析物和其他有机化合物的浓度。此外，用户必须确保添加的有机溶剂与膜过滤器和外壳材料兼容[25]。鉴于所有这些不确定性，一些作者建议完全避免使用注射器过滤器，而是采用离心后上清液进行固相提取作为分析水样中PFAS的更好替代方法[7]。尽管如此，膜过滤仍然是实验室分析中预处理样品的一种方便且节省时间的方法。

一些研究建议在过滤步骤中采取预防措施和验证分析物回收情况，例如丢弃一定体积的初始滤液[8]或更严格地，在过滤后添加内标以考虑这些损失[9, 10]。氘代或其他稳定同位素标记的内标可以提高定量准确性，并有助于补偿样品处理和分析过程中的分析物损失；在某些应用中，它们的表现优于外部校准方法，还能帮助解释由于玻璃器皿损坏或挥发造成的损失[26]。然而，氘代类似物在保留或回收方面可能与天然分析物有所不同，甚至可能掩盖与稳定性、回收率或离子抑制相关的问题[27]。此外，当将标准品添加到复杂的样品基质中时（例如含有土壤颗粒的天然水样品），鉴于已知污染物残留物的存在，这些标准品的大部分可能会被吸附在矿物-有机基质上[28,29,30]。当标准品被添加到清澈的样品提取液中时，可溶性大分子物质也可能出现同样的现象。

**建议：**
当分析物容易被膜保留时（例如具有高亲脂性的有机化合物或含有能与膜聚合物发生非共价键合的官能团的极性有机化合物），建议使用无粘合剂的玻璃纤维/微纤维或其他无机膜（如银、氧化铝或陶瓷），这些膜应与样品基质兼容，即所选的膜材料必须对样品中的已知化学成分呈惰性。尽管有一项研究对此建议提出了相反的观点[14]，但硼硅酸盐玻璃已被证明对大多数有机溶质和水基基质中的溶剂具有长期的化学惰性（不含腐蚀玻璃的成分[25]），并且是实验室过滤产品中最便宜的无机膜类型之一[31,32,33,34]。除此之外，玻璃纤维/微纤维膜和注射器过滤器有高端和经济型两种规格可供选择，适用于各种实验室过滤需求[34,35,36,37,38,39]。因此，在这一领域存在较大不确定性的情况下，可以将它们作为首选方案，以尽量减少膜与分析物之间的相互作用。值得注意的是，带有玻璃纤维/微纤维膜的注射器过滤器通常具有较大的标称孔径（0.45 μm、0.7 μm 和 1.0 μm[35, 37, 39]），而常规的 0.45-μm 和 0.22-μm 注射器过滤器则推荐用于液相色谱分析前的样品预过滤[40, 41]。

另一种方法是使用 PTFE 膜（化学惰性且疏水）预先湿润注射器过滤器，然后用可与水混溶的有机溶剂（如甲醇）处理，以便水样更容易通过，同时最小化分析物与过滤膜之间的相互作用。但用户需要注意，预先湿润的膜过滤器中的溶剂残留物会被带入滤液中，可能会干扰后续的分析过程。无论是使用玻璃纤维/微纤维过滤器还是预处理的 PTFE 过滤器，由聚丙烯、丙烯酸或聚碳酸酯制成的过滤器外壳[25, 42]也可能是分析物吸附的另一个来源，尽管由于其表面积有限，这种影响通常较小[14]。

无论如何，如果条件允许的话，在样品通过膜或注射器过滤器后，丢弃最初的几毫升到几十毫升冲洗液会减少膜或过滤器对分析物的保留作用，同时减少从膜或过滤器上洗脱下来的杂质进入滤液中的量。根据我们过去二十年对色谱样品预过滤的经验，这一预防措施适用于分析环境或实验室水样时的大多数预过滤需求。

另一种去除样品中固体的方法是离心分离，但必须注意确保旋转速度和持续时间设置足够，以便在离心后获得清澈的上清液。对于热敏感样品（如生物液体），在整个离心过程中必须控制温度，以避免样品过热，尤其是在高离心速度（如超过 10,000 rpm）下。总体而言，离心是一种有效的方法，可用于去除水样中的固体和其他不溶性物质，尤其是那些会迅速堵塞注射器过滤器微滤膜孔隙的样品。

大多数膜盘和注射器过滤器都有容量等级。例如，25 毫米直径的注射器过滤器处理含固体的水样的容量等级为 10–100 mL；13 毫米直径的注射器过滤器通常的容量等级为 2–10 mL；4 毫米直径的注射器过滤器可以处理最多 2 mL 的样品体积[43,44,45,46]。对于较大体积的样品，47 毫米直径的膜盘的容量等级为 100–250 mL。虽然实际样品中的固体和其他不溶性物质含量变化较大，但这些容量等级通常较为宽松，适用于大多数含有低或中等量固体的水样（即实验室分析师常见的样品类型），除非样品中含有可溶于水的聚合物或其他可能堵塞膜孔的物质。使用过大的膜进行过滤既浪费资源又存在风险。

**膜材料：**
膜材料的选择较为复杂，但这里有一个实用的经验法则：对于低保留风险的化合物（例如在水中有良好溶解度的极性有机化合物，如溶解度为几百毫克/升或超过 1,000 毫克/升的化合物），基于再生纤维素、混合纤维素酯或醋酸纤维素的膜通常是不错的选择，因为它们操作简便（即在低操作压力下流速高）、购买成本相对较低，并且对分析物的保留作用最小。对于中等疏水性/亲脂性的化合物（例如 logKOW 为 2–4 的化合物），这些膜仍然可以使用，但需要注意分析物的分子结构和官能团。对于含有质子供体官能团的化合物（例如酚类或酚衍生物），用户应避免使用尼龙和聚醚砜膜，或者选择玻璃纤维/微纤维膜。否则，对于中等疏水性/亲脂性的有机化合物，再生纤维素和混合纤维素酯膜通常是可接受的。

无论分子结构如何，高疏水性/亲脂性的化合物（例如 logKOW 高于 4.0）和低水溶解度的化合物（例如在室温下的溶解度为几毫克/升或更低）特别容易通过膜和过滤器外壳材料被吸附，因此需要采取预防措施，在某些情况下还需要额外的步骤来减少过滤过程中的分析物损失。在所有情况下，在过滤步骤之前进行方法验证以测量分析物损失的影响是必不可少的。最后，对于含有有机溶剂或腐蚀性物质（例如强酸或氧化剂）的样品，用户必须参考特定类型膜和过滤器外壳材料的化学兼容性，这些信息通常会在产品数据表中提供，或者咨询制造商[25, 47]。

**分析物保留的间接证据：**
尽管膜和注射器过滤器制造商关于样品过滤过程中分析物可能损失的说明非常少[48,49,50,51,52,53]，但研究文献中有大量关于合成聚合物在水介质中吸附有机化合物的参考文献。未来研究膜-分析物相互作用时，可以参考以下研究领域开发和产品的丰富参考资料和用户指南：固相萃取（SPE）[54, 55]、固相微萃取（SPME）[56,57,58]、薄层色谱（TLC）[59] 和被动水采样[60,61,62,63,64,65,66,67,68]，这些领域几十年来已经广泛探讨并验证了许多有机分析物与合成聚合物之间的相互作用。这些领域的指南、产品信息和综述文章通常能提供有关微滤膜和注射器过滤器吸附分析物的有用见解，从而帮助用户避免未来的研究重复同样的工作。

**天然物质：**
除了合成有机化合物外，天然毒素和重金属也是重要的威胁，但有证据表明它们也可能被膜过滤器吸附[13, 14]。例如，在一项关于霉菌毒素的实验室研究中，Aichinger 等人使用多种类型的注射器过滤器纯化了 Alternaria 毒素的提取物[13]。他们观察到活性化合物有显著损失，在某些情况下甚至完全损失，其中 alternariol 和 alternariol monomethyl ether 的浓度受过滤影响最大，其次是 perylene quinones[13]。基于他们的发现，作者对先前发表的食品调查和过去暴露评估中 Alternaria 毒素的低检出率表示担忧。

同样，在另一项针对饮用水中铅（Pb）的研究中，Minning 等人观察到在通过 25 毫米直径的注射器过滤器之前，样品中的可溶性铅（Pb）在最初 30–45 mL 的过滤过程中有显著损失，该样品中溶解的铅（Pb）浓度分别为 24 μg/L 或 40 μg/L[14]。作者指出，关于选择合适的过滤膜的指导很少，几乎没有考虑到过滤器对溶解铅（Pb）的吸附作用，尽管铅（Pb）是水务运营商监测重金属污染的主要目标。

0.45-μm 和 0.22-μm 标称孔径的微滤膜设计用于通过物理尺寸排除作用去除液体中的颗粒物、细菌和胶体（图 2）。这些膜适用于大多数有机化合物、离子以及金属物种和阴离子之间的加合物。溶解在环境介质中的天然有机物（NOM），如腐殖酸、富里酸和单宁酸，通常可以通过这些膜，但由于它们具有中等疏水性/亲脂性以及分子上的大量质子供体官能团，可能会在某些富含电子供体官能团的聚合物膜（如尼龙和聚醚砜）中发生显著损失[69]。同样的不确定性也适用于生物分子，例如蓝藻水华产生的毒素，这些生物分子的分子量通常低于 1,000 道尔顿，其性质与天然有机物相似[70,71,72]。

水溶性聚合物（包括天然或合成来源的聚合物，分子量从几百道尔顿到超过一千万道尔顿不等[73, 74]）也会被膜吸附。由于微滤膜的分子量截止值（MWCOs）通常不用于表征这些聚合物，因此无法为其在过滤生物分子或水溶性聚合物时的使用制定参考指南，尽管有迹象表明它们允许分子量超过 100,000 道尔顿的化学物质通过[75]。在工程纳米材料（包括纳米塑料）的保留或释放方面也存在不确定性，这些材料目前正受到对其健康影响和环境行为的密切关注。这些物质不在膜制造商提供的传统“过滤谱”信息图谱范围内（图 2），它们与过滤膜材料的相互作用及其后果在很大程度上仍不清楚。

**环境科学家和毒理学家正在处理日益多样化的污染物[77]，因此必须在实验室样品过滤过程中测试各种目标分析物，特别是那些高保留风险的化合物（例如 logKOW 高于 4.0 的化合物）或中等疏水性/亲脂性的化合物（例如 logKOW 为 2–4 的化合物），以及那些被监管机构或公共卫生组织认定为优先污染物的化合物[21,22,23, 78]，以确保它们不会在过滤过程中被意外丢失。此外，还需要认识到常见的实验室器具、消耗品和清洁用品[16, 79,80,81,82,83,84]，甚至是分析设备的内置组件[80]也可能成为疏水性/亲脂性有机化合物的强吸附介质，从而导致分析物丢失。此外，一次性实验室消耗品可能会释放塑料添加剂[85]，而设计用于重复使用的尼龙刷毛和某些合成弹性体在更换样品基质或条件（例如 pH 值）后可能会释放之前样品中积累的化合物[86]。此外，来自环境基质中的天然有机物可以与溶解的有机化合物形成稳定的加合物，从而在后续的定量分析中导致测量结果失真[87, 88]。通常，对样品滤液或上清液的色谱和光谱测量只能检测到以未结合状态存在于水基质中的自由溶解的分析物。环境化学家通过提出“单样本分子年代学”这一新技术来研究环境中单个样本中多个时间点存在的污染物的相对年龄[89, 90]。由于大多数环境和生物基质本质上都是复杂的介质，其中包含可能与目标分析物相互作用的多种成分，因此分析人员必须意识到这些相互作用可能导致分析物丢失：例如，分析物可能通过与选定分析方法无法检测到的稳定加合物结合而丢失，或者被实验室过滤过程中使用的膜或注射过滤器截留[图3]。要测量这些分析物的比例，需要使用更强效的溶剂或其他化学试剂来分解分析物与相关有机物之间形成的加合物。

图3：实验室过滤过程中常用的微滤膜和注射过滤器会保留某些化学物质，如溶解的生物分子和水溶性聚合物。溶解在环境水样中的天然有机物（如腐殖酸、富里酸和单宁）通常可以透过0.45-μm和0.22-μm的膜，但含有自由孤对电子供体的聚合物膜（特别是尼龙和聚醚砜（PES）膜）会将其截留。这些物质与膜的相互作用及其后果在现有文献中尚未得到充分研究。在含有溶解有机物的环境和生物样本中常见的污染物-有机物复合物也需要进一步测试以验证其在实验室过滤过程中的回收情况。重金属、类金属以及金属离子与污染物之间形成的加合物是另一类需要进一步研究的分析物。对于金属物种的定量分析（如电感耦合等离子体质谱法、光发射光谱法和原子吸收光谱法），通常需要使用无杂质的清晰样品。此外，在微滤膜和注射过滤器对纳米材料（包括正在研究其环境和健康影响的纳米塑料和工程纳米材料）的保留（或释放）方面也存在空白。总体而言，溶解金属、水溶性聚合物、生物化合物、溶解有机物和污染物-有机物复合物是五类主要化学物质，它们的保留特性在实验室过滤设备（如滤纸、膜盘、注射过滤器和其他基于膜的过滤器）中仍知之甚少。

相关研究包括：注射过滤器对全氟和多氟烷基物质的保留[7]；环境科学家为净化受污染的水而进行的竞争[77]；纳米级天然有机物与双酚A相互作用并降低对人类细胞的毒性[88]；农药的重新释放[90]；微塑料的环境行为和健康风险评估[91]；微塑料是否影响人体免疫系统[92]；纳米塑料可能比普通微塑料更具危险性[93]；溶解有机物的核磁共振光谱分析[94]；腐殖物质对受污染土壤和沉积物中多环芳烃生物修复的影响[95]；天然有机物对海洋生物中金属形态和毒性的调控作用[96]。