在体外对Artemis突变进行碱基编辑，为治疗Artemis缺陷型严重联合免疫缺陷病（SCID）的基因疗法提供了新的见解

《Advanced Biotechnology》：Base editing of Artemis mutations ex vivo sheds light on gene therapy for Artemis-deficient SCID

摘要：Artemis是一种内切酶，在V(D)J重组过程中切割DNA发夹结构，这是编码接头形成和淋巴细胞发育的关键步骤。Artemis缺陷导致的严重联合免疫缺陷（ART-SCID）是一种单基因疾病，其特征是淋巴细胞发育受损以及对异基因造血干细胞移植的反应性差。在这项研究中，我们探讨了使用碱基编辑器来纠正Artemis基因中的突变。具体来说，我们首先记录了之前研究中发现的Artemis致病突变以及从ClinVar数据库中新识别的突变。然后，我们使用胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）修复了c.181T>C突变，并使用腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）针对与ART-SCID相关的致病c.49G>A和c.404G>A变异。靶向深度测序显示，rapOBEC1-SpRY-HF1-BE4max在c.181T>C位点实现了高效的编辑（约50%），而ABE8e在c.49G>A和c.404G>A位点的编辑效率分别约为35%和20%。重要的是，碱基编辑器在293TArtemis?/?系统中恢复了Artemis内切酶活性，并且通过靶向深度测序评估，在预测位点没有检测到脱靶效应。这些发现证明了碱基编辑可以纠正ART-SCID相关突变，突显了其在未来治疗开发中的潜力。

1 引言
严重联合免疫缺陷（SCID）是一组遗传性疾病，其特征是淋巴细胞发育受损（Fischer等人，2015年）。迄今为止，已有超过20个基因的突变与SCID相关，如CD3D、IL7R、IL2RG、RAG1、RAG2、PRKDC、LIG4和DCLRE1C（也称为Artemis）（Aranda等人，2024年）。SCID婴儿通常表现出慢性腹泻、口腔念珠菌病、皮疹和反复发作的难治性感染等症状。如果没有早期诊断和干预，SCID可能导致危及生命的并发症和高死亡率。
自20世纪60年代以来，造血细胞移植（HCT）已成为SCID患者的主要治疗方法，全球已有数千名婴儿接受了HCT治疗（Slatter和Gennery，2022年）。然而，对于Artemis缺陷的SCID（ART-SCID）患者来说，HCT治疗存在一些挑战。Artemis是一种内切酶，在V(D)J重组过程中切割DNA发夹中间体，这对淋巴细胞的发育至关重要（Moshous等人，2001年）。在RAG1/2重组酶复合体切割重组信号序列（RSS）后，Artemis在DNA-PKcs的激活下切割闭合的DNA发夹末端，产生3′突出端，为随后的抗原-受体库多样化做准备（Ma等人，2002年）。它还通过参与非同源末端连接（NHEJ）DNA修复途径来维护基因组完整性（Dudasova和Chovanec，2003年）。Artemis的缺陷会导致T细胞和B细胞发育停滞，并导致一种对辐射敏感的SCID形式（RS-SCID）（Moshous等人，2001年）。与Artemis突变相关的遗传和临床谱系高度异质。虽然缺失、无义突变、移码突变或破坏性剪接变异通常会导致典型的SCID，伴有淋巴细胞发育停滞，但保留部分核酸酶活性的低表达等位基因可能导致非典型表型，包括Omenn综合征和渗漏性SCID（Felgentreff等人，2015年；Pannicke等人，2010年）。临床研究表明，RS-SCID患者对烷化剂（用于清除受体造血干细胞的标准预HCT骨髓清除药物）具有全身敏感性（O'Marcaigh等人，2001年；Wang等人，2005年）。临床研究还表明，ART-SCID患者对电离辐射仍然高度敏感，并且在异基因HCT后更容易发生感染（Schuetz等人，2014年）。即使有HLA匹配的同胞供体，ART-SCID患者在接受HCT治疗后的T细胞和B细胞重建也不如其他SCID基因型有效（Haddad等人，2018年；O'Marcaigh等人，2001年）。因此，需要为ART-SCID患者寻找除HCT之外的替代治疗方法。
为了治疗Artemis突变，采用了携带野生型Artemis cDNA的慢病毒载体进行基因递送，该载体由强的人类延长因子-1α（EF1α）启动子驱动（Charrier等人，2019年；Multhaup等人，2015年）。这种配置恢复了基因表达，但导致了剂量依赖性的细胞毒性反应（Multhaup等人，2010年）。尽管用内源性人类Artemis启动子替换EF1α启动子后，在体内转导HSCs后实现了接近生理水平的表达并实现了显著的免疫恢复（Cowan等人，2022年；Multhaup等人，2011年；Punwani等人，2017年），但插入突变的安全性问题仍然存在。复制能力强的逆转录病毒或慢病毒（RCRs/RCLs）载体会随机整合，其持续复制可能导致病毒插入宿主基因组，逐渐增加患者发生肿瘤基因激活的风险（Milone和O'Doherty，2018年）。除了基因递送策略外，CRISPR-Cas9介导的同源定向修复（HDR）也为HSCs中的基因校正提供了另一种治疗方法（Pavel-Dinu等人，2019年）。然而，其临床应用仍然具有挑战性，因为HDR修复需要同时将供体DNA模板递送到HSCs中。此外，静止的HSCs本质上对HDR具有抗性，而容易出错的NHEJ途径会与HDR修复竞争，从而导致HSCs中HDR的效率较低（Shin等人，2020年）。
在过去的十年中，基因编辑技术迅速发展，并在遗传性疾病的治疗中显示出巨大的潜力（Chai等人，2023年；McAuley等人，2023年）。在快速发展的基因编辑平台中，胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）和腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）已成为两种主导工具。CBE和ABE都包含一个工程化的脱氨酶，与Cas9衍生的模块融合，用于sgRNA引导的DNA靶向。CBEs使用胞嘧啶脱氨酶（如大鼠APOBEC1）通过C到U的中间体将C•G转换为T•A，而ABEs使用进化的腺嘌呤脱氨酶（例如TadA*）通过A到I的脱氨将A•T转换为G•C（Gaudelli等人，2017年；Komor等人，2016年）。碱基编辑器已在临床试验中用于治疗镰状细胞病（SCD）、β-地中海贫血和家族性高胆固醇血症等疾病，以及用于开发通用嵌合抗原受体（CAR）T细胞（Jiang和Yang，2023年）。利用快速发展的碱基编辑精度，McAuley等人通过电穿孔将CBE递送到人类HSCs中，纠正导致SCID的CD3D突变，实现了约71.2%的致病等位基因修复（McAuley等人，2023年）。为了测试碱基编辑治疗ART-SCID的潜力，我们首先总结了导致SCID的Artemis相关突变，并部署了最新的CBE和ABE工具来纠正严重损害Artemis活性的c.49G>A、c.181T>C和c.404G>A突变。体外编辑在c.181T>C位点实现了50%的修复率，在c.49G>A位点实现了30%的修复率，从而验证了碱基编辑作为ART-SCID的有效治疗途径。

2 结果
2.1 Artemis基因中致病突变的总结和鉴定
为了探索碱基编辑治疗ART-SCID的潜力，我们首先总结了之前报道的Artemis致病点突变（Cowan等人，2022年；de Villartay等人，2009年；Ege等人，2005年；Evans等人，2006年；Felgentreff等人，2015年；Hazar等人，2024年；Huang等人，2025年；Inoue等人，2023年；Lagresle-Peyrou等人，2008年；Le Deist等人，2004年；Lee等人，2013年；Li等人，2002年；Ma等人，2002年；Moshous等人，2001年；Mou等人，2021年；Musio等人，2005年；Noordzij等人，2003年；Pannicke等人，2010年；Sundin等人，2019年；van der Burg等人，2007年；Woodbine等人，2010年）（表S1）。这些突变包括D17N、H35D、D37G、D136N、D165N、H228N和H254L，它们构成了Artemis的催化核心（Karim等人，2020年）。
为了更深入地了解Artemis突变与疾病之间的关联，并系统地识别适合基因编辑的位点，我们进一步分析了ClinVar数据库中存储的Artemis相关变异。然后，从ClinVar数据库中筛选出41个被记录为疾病相关突变且在Artemis进化过程中高度保守的突变，以进行进一步的功能表征（图1a，表S1）。接着，使用已建立的293TArtemis?/?细胞系和CJ报告基因构建物以及体外V(D)J重组测定来评估上述Artemis突变体的活性。机制上，当小鼠RAG1/2复合体切割pCJ底物中的重组信号序列（RSSs）后，DNA发夹末端会被Artemis打开，然后双链DNA断裂可以通过NHEJ修复机制连接。当将功能性Artemis引入293TArtemis?/?细胞时，成功的DNA修复能够使GFP表达，然后通过流式细胞术在293TArtemis–/–细胞中量化（图1b）。使用这个报告系统，我们发现G6E、E10G、F19L和L110R突变显著降低了Artemis的活性（图1c）。为了进一步研究这些Artemis突变体的活性，我们准备了三种DNA底物用于体外活性测定（图1d）。如图1e所示，所有四种Artemis突变体在与单链DNA孵育时表现出降低的核酸酶活性。一致地，这些突变体的内切酶活性也显著降低，因为它们对3′ DNA突出端底物和DNA发夹底物的活性有限（图1f，g）。综上所述，我们新发现G6E、E10G、F19L和L110R突变严重损害了Artemis的外切酶和内切酶活性，从而导致ART-SCID。之前报告和本研究中记录的所有突变都列在表S1中。

图1
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确定了四种损害其核酸酶活性的Artemis突变。a Artemis蛋白中的进化保守残基。Hsa，智人；Mmu，小鼠；Gga，家鸽；Mmy，鼠耳鼠；Mdo，家猫；Oan，鸭嘴兽；Cmy，海龟；Xla，非洲爪蟾；Dre，斑马鱼；Rty，儒艮；Cmi，海牛。b 使用编码接头（CJ）报告基因测定在Artemis缺陷的293T（293TArtemis–/–）细胞中评估Artemis内切酶活性。c CJ报告基因测定显示，G6E、E10G、F19L和L110R突变与野生型蛋白相比显著降低了Artemis活性。d 用于评估Artemis核酸酶活性的三种DNA底物。星号表示Cy5标记。e—g 所有四种Artemis突变都降低了其对单链DNA（e）、3′ DNA突出端（f）和DNA发夹底物（g）的核酸酶活性。流式细胞术结果表示三个生物学重复实验的平均值±标准差。P值使用Student’s t检验计算。ns：不显著。体外实验在三个独立重复中进行，展示了一个代表性结果。

2.2 选择三种Artemis相关突变进行CBEs和ABEs编辑
尽管Artemis基因中的许多突变与酶活性丧失和SCID的发展有关，但只有部分变异可以通过碱基编辑进行纠正。为了系统地识别可编辑的残基，我们对表S1中列出的致病突变进行了额外分析，并选择了那些原则上可以使用胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）、腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）、DAF-CBE2或DAF-TBE2（分别介导C到T、A到G、C到G和T到G的转换）进行纠正的突变，这些编辑器在表1中列出（Gaudelli等人，2017年；Komor等人，2016年；Ye等人，2024年）。表1总结了潜在可编辑的突变及其相关活性、预测的sgRNAs、旁观者编辑和PAM要求。表1中用粗体显示的等位基因代表功能丧失突变，用红色突出显示的突变表示本研究中目标纠正的突变。在sgRNA + PAM列中，红色核苷酸表示目标位点，而粗体核苷酸表示PAM序列。绿色显示的核苷酸表明由于密码子简并性，碱基编辑并未改变编码的氨基酸。下划线的核苷酸表示剪接供体位点。a. 本研究的数据表明了Artemis突变体的染色体外V(D)J重组活性水平（%）。b. 数据来源于Felgentreff等人2015年的研究（Felgentreff et al. 2015）。c. 数据来源于Huang等人2025年的研究（Huang et al. 2025）。加号（+）表示在编码链上进行编辑，减号（–）表示在非编码链上进行编辑。根据特定的碱基编辑器，预测了潜在的旁观者突变。对于ABE和CBE，相对于原间隔区+2到+10位置的核苷酸被认为容易被编辑，而使用DAF-CBE2和DAF-TBE2时，+7到+15位置被认为会受到影响。N/A表示不适用；表示等位基因信息不可用或突变不是点突变。

基于上述分析，我们随后关注了表1中用粗体标出的完全消除Artemis活性的变异体。这些突变包括Q7*、S119*、D17N、S32C、C61R、G118V、G135E和Y199*。在这些突变中，Q7*、S119*和Y199*是发生在催化结构域中的早终止突变，而c.49G>A（D17N）和c.181T>C（C61R）突变之前已被报道会导致Artemis的结构损伤（Huang et al. 2025; Poinsignon et al. 2004）。为了获取关于其余错义突变的更多信息，我们使用SWISS-MODEL进行了进一步的结构分析。我们根据野生型结构（PDB: 6WNL）对突变蛋白进行了建模，并计算了相对自由能。结果显示，G118V、G135E和L110R突变显著降低了蛋白质稳定性（图2a）。此外，G118与一个保守的水分子相互作用，该水分子连接了L31、S32、S62和T65，这些位置都被报道对Artemis的活性至关重要（表1）（Huang et al. 2025）。这种相互作用网络在相关的SNM家族成员SNM1A和SNM1B中也是保守的（PDB: 4B87和7A1F），突显了这五个残基的催化和进化重要性（图2b, c）。S32C替换破坏了S32-H33氢键，并在关键催化残基（H33、H35、H115、D136）附近引入了π-硫键相互作用，可能诱导了影响酶活性的构象变化（图2d）。

三种Artemis突变可以通过碱基编辑器进行校正。a. 使用Aggrescan3D（https://biocomp.chem.uw.edu.pl/A3D2/）计算了Artemis突变体的自由能。选中进行编辑的G135E突变体显示出较低的自由能。b. 对Artemis、SNM1A和SNM1B的结构建模显示，五个保守的残基能够与一个共享的水分子形成氢键。c. 多序列比对揭示了具有进化保守性的致病氨基酸突变。Hsa，智人；Mmu，小鼠；Lja，日本七鳃鳗；Pfl，黄斑海鞘；Bbe，贝尔彻氏鳃口动物；Nge，Notospermus geniculatus；Aau， Aurelia aurita；Dha，Debaryomyces hansenii；Mfl，Mylnosiga fluctuans；She，Salpingoeca helianthica；Bfl，佛罗里达鳃口动物；Aqu，昆士兰Amphimedon；Sce，酿酒酵母；Dre，斑马鱼；Pma，海七鳃鳗。d. Artemis中的S32C突变破坏了S32和H33之间的原始氢键，取而代之的是C32和H33之间的π-硫键相互作用。e. Artemis基因中c.49G>A、c.404G>A和c.181T>C突变的位置。f. CJ报告实验表明，与c.49G>A、c.404G>A和c.181T>C编辑相关的旁观者突变具有功能性后果。流式细胞术结果以三个生物学重复实验的平均值±标准差表示。P值使用Student’s t检验计算得出。ns：不显著。

基于对这些失活突变的功能和结构分析，我们接下来筛选了可以通过ABE或CBE有效靶向的纯合突变，因为它们具有高编辑效率和已建立的临床适用性。然后确定c.49G>A（D17N）和c.404G>A（G135E）适合通过ABE介导的校正。此外，我们还包括了c.181T>C（C61R）作为代表性的CBE可编辑突变，以探索胞嘧啶碱基编辑的可行性（表1）。c.49G>A突变是在一项日本SCID研究中发现的，该研究包括八名患者，其中两名患者携带纯合的c.49G>A突变。这些患者在六个月大之前就被诊断出来，表现出严重的感染和严重的T细胞缺陷；其中一名患者还表现出皮肤红斑（Inoue et al. 2023）。c.404G>A突变在另一项研究中也有报道，该研究包括四名ART-SCID患者。其中两名患者携带纯合的c.404G>A突变，两者都表现出T?B?NK?免疫表型。临床上，一名患者在诊断时表现出持续的带状疱疹病毒感染，最终都因严重疾病并发症而死亡（Noordzij et al. 2003）。值得注意的是，这些突变分布在不同的外显子中，c.49G>A位于外显子1，c.181T>C位于外显子3，c.404G>A位于外显子6（图2e）。

最后，为了确保编辑这三个突变的安全性，评估了原间隔区+2到+10位置的腺嘌呤和胞嘧啶的潜在旁观者效应。对于c.49G>A和c.404G>A的ABE介导的校正，预测的单一旁观者替换包括I16M、I16V、Y133C和T134A。对于c.181T>C的CBE介导的校正，预测了S62L（表1）。在293TArtemis–/–细胞中的功能评估显示，S62L减弱了但未消除活性，I16M和Y133C导致了轻微的降低，T134A的影响可以忽略不计，I16V没有可检测到的效果（图2f）。总体而言，这些结果表明c.49G>A、c.404G>A和c.181T>C是适合且安全的碱基编辑目标，预测的旁观者编辑对功能的影响最小。

为了实现对Artemis突变的碱基编辑，我们建立了一个体外流程（图3a）。首先，使用慢病毒载体将Artemis突变体转导到293TArtemis–/–细胞中，然后进行单细胞分选和克隆扩增。接下来，表达Artemis突变体（293TT181C、293TG404A和293TG49A）的细胞被转染CBE或ABE构建体并孵育三天。收集一部分细胞进行测序，其余的细胞用于评估校正后的Artemis活性。

Artemis c.181T>C突变通过CBE得到了有效校正。a. 生成293TT181C、293TG49A和293TG404A细胞系以及使用CBE或ABE评估编辑效率的工作流程。携带c.181T>C、c.49G>A或c.404G>A突变的人类Artemis基因片段被包装到慢病毒载体中并转导到293TArtemis–/–细胞中。经过嘌呤霉素选择后，分离出单细胞克隆以进行进一步实验。b. 将各种胞苷脱氨酶与nCas9或SpRY-HF1结合到BE4max构建体中。c. 设计了多种用于不同碱基编辑器的sgRNA。d. 使用深度测序对目标位点和旁观者的编辑结果进行定量分析。e. rA1-SpRY-HF1-BE4在编辑Artemis c.181T>C突变时没有显示出显著的sgRNA4依赖的脱靶效应。NC，阴性对照，表示没有转染碱基编辑器。f. 在293TT181C细胞中使用rA1-BE4或evoFERNY-BE4进行碱基编辑后，Artemis内切酶活性显著增加。g. 在293TT181C细胞中使用sgRNA4和sgRNA5进行rA1-SpRY-HF1编辑后，Artemis内切酶活性显著增加。h-i. 由sgRNA1（h）和sgRNA4（i）介导的成功编辑的c.181C>T等位基因内的旁观者突变频率。红色碱基代表主要的组合旁观者突变。NBM：无旁观者突变。所有结果以三个生物学重复实验的平均值±标准差表示。P值使用Student’s t检验计算得出。ns：不显著。

为了编辑c.181T>C突变，我们使用了几种高活性的胞苷脱氨酶，包括大鼠APOBEC1（rA1）、APOBEC3A（A3A）和evoFERNY，它们被整合到BE4max骨架中，这是一种以高编辑效率著称的碱基编辑器（图3b）。鉴于S62L旁观者突变可能影响Artemis活性，还测试了窄窗口碱基编辑器变体，如YEE和A3A-Y130F，以实现更精确的编辑（Kim et al. 2017; Koblan et al. 2018; Thuronyi et al. 2019; Wang et al. 2018）（图3b）。此外，rA1与SpRY-HF1结合使用，SpRY-HF1是一种PAM放松的Cas9变体，具有高保真度（Walton et al. 2020），以进一步扩展编辑实验中的sgRNA设计选项（图3b）。接下来，我们设计了多种sgRNA，包括一个目标核苷酸位于原间隔区+5位置，并且下游有一个NGG PAM（sgRNA1；图3c）。此外，还设计了其他sgRNA，目标位点位于原间隔区+3到+7位置，并且下游有一个NRN PAM，从而可以使用rA1-SpRY-HF1进行编辑（图3c）。

接下来，我们将不同的CBE构建体和sgRNA转染到293TT181C细胞中。Sanger测序显示，当由sgRNA1引导时，rA1-BE4max和evoFERNY-BE4max在目标位点的编辑效率高于A3A-BE4max（图S1a），而YEE-BE4max没有显示出可检测的编辑活性（图S1a）。此外，当与sgRNA4或sgRNA5配对时，rA1-SpRY-HF1显示出强大的编辑效率（图S1a）。深度测序进一步确认，rA1-BE4max和evoFERNY-BE4max的校正率约为30%，并且在预测的位点没有显著的脱靶效应（图3d, S1b）。具体来说，使用Cas-OFFinder根据sgRNA序列预测了脱靶位点，并选择了每个sgRNA的五个预测位点进行实验分析。进行了靶向深度测序，并使用CRISPResso2计算了目标位点和脱靶位的编辑频率。通过计算sgRNA目标区域内的C到T转换总频率来确定每个位点的脱靶编辑效率。值得注意的是，rA1-SpRY-HF1结合sgRNA4在目标位点的编辑效率达到了约50%，并且在任何计算预测的基因组位点都没有显示出显著的脱靶活性（图3d, e）。重要的是，流式细胞术分析表明，rA1-BE4max、evoFERNY-BE4max或rA1-SpRY-HF1在293TT181C细胞中部分恢复了Artemis活性（图3f, g）。我们还发现，在c.181T>C编辑过程中旁观者效应相对明显。为了进一步研究旁观者突变对编辑结果的影响，我们通过过滤在目标位点具有成功编辑的序列重新分析了我们的深度测序数据。这种单倍型级别的分析使我们能够量化同一等位基因内预期修饰和旁观者突变的共现频率。结果显示，位点4、9和14在sgRNA1和sgRNA4引导的编辑中显示出最高的旁观者突变频率（图3h, i）。位点4（CTA到TTA，都编码亮氨酸）和9（TAC到TAT，都编码酪氨酸）的替换不会改变氨基酸序列，因为密码子简并性。因此，主要的旁观者效应归因于位点14的突变，导致S62L替换。如图2f所示，S62L突变单独导致Artemis活性中度降低。因此，c.181T>C突变可以使用CBE编辑器有效校正，这样的编辑可以部分恢复Artemis的活性。

为了校正Artemis c.49G>A和c.404G>A突变，我们首先测试了五种腺嘌呤碱基编辑器，包括ABE7.10、ABEmax、ABEmax、ABE8e、ABE8e-SpRY-HF1和ABE8e-NRRH，后两者结合了PAM放松的Cas9变体（图4a）（Thuronyi et al. 2019; Walton et al. 2020）。对于c.49G>A，设计了六个sgRNA，其中sgRNA1和sgRNA2与典型的NGG PAM兼容，而其余四个可以通过SpRY-HF1或NRRH编辑（图4b）。

使用ABE8e在体外有效编辑了Artemis c.49G>A突变。a. 使用五种碱基编辑器在体外编辑c.49G>A和c.404G>A突变。b. 设计了多种用于编辑c.49G>A突变的sgRNA。c. ABE8e和ABE8e-NRRH在c.49G>A位点的编辑效率约为35%。d. ABE8e介导的c.49G>A突变显著增强了体外Artemis活性，而c.404G>A突变的校正未能恢复活性。e. ABE8e-SpRY-HF1和ABE8e-NRRH介导的c.49G>A突变显著增强了体外Artemis活性。f. 由sgRNA1介导的成功编辑的c.49G>A等位基因内的旁观者突变频率。红色碱基代表主要的组合旁观者突变。g. 设计了多种用于编辑c.404G>A突变的sgRNA。NC，阴性对照，表示没有转染碱基编辑器。h. ABE8e和ABE8e-SpRY-HF1在c.404G>A位点的编辑效率约为20%。i. 由sgRNA1介导的成功编辑的c.404G>A等位基因内的旁观者突变频率。NBM：无旁观者突变。所有结果以三个生物学重复实验的平均值±标准差表示。P值使用Student’s t检验计算得出。ns：不显著。

将ABE8e转染到293TG49A细胞后，Sanger测序显示ABE8e结合sgRNA1在目标位点诱导了显著的编辑（图S2a）。ABE7.10和ABEmax没有显示出可检测的目标位点编辑，但在相邻位置产生了显著的旁观者编辑。有趣的是，与sgRNA1相比仅相差一个核苷酸的sgRNA2无法通过任何编辑器支持目标编辑，尽管再次观察到了旁观者编辑现象（图S2a）。在PAM放宽的sgRNAs中，ABE8e-NRRH与sgRNA5配对时表现出最高的效率，而其他组合的活性则各不相同（图S2b）。深度测序确认ABE8e与sgRNA1的组合达到了约35%的校正效率，与ABE8e-NRRH与sgRNA5的组合相当（图4c）。使用CJ报告基因检测的流式细胞术显示，在sgRNA1、sgRNA5和sgRNA6的引导下，ABE8e-、ABE8e-NRRH-和ABE8e-SpRY-HF1介导的编辑显著增加了293TG49A细胞中的Artemis活性（图4d, e）。重要的是，我们没有在预测的基因组位点发现显著的脱靶突变，这证实了我们sgRNA1设计的精确性（图S3a）。在c.49G>A编辑中，最常见的（约55%）旁观者突变发生在位点7和9（图4f）。值得注意的是，由此产生的I16V替换并没有显著改变Artemis的活性（图2f）。这一发现与我们的CJ报告基因检测结果一致，后者显示c.49G>A的校正可以部分恢复Artemis的活性（图4d）。为了校正c.404G>A突变，我们设计了七种sgRNAs，其中sgRNA1和sgRNA2与典型的NGG PAMs兼容，其余五种则可以通过SpRY-HF1进行编辑（图4g）。使用相同的编辑流程，将不同的ABEs转染到293TG404A细胞中。对于典型的PAM sgRNAs，Sanger测序显示只有ABE8e与sgRNA1配对时能够有效编辑目标位点（图S2c）。在PAM放宽的sgRNAs中，sgRNA3表现出最高的编辑效率，而其他组合的活性则各不相同（图S2d）。下一代测序确认ABE8e与sgRNA1以及ABE8e-SpRY与sgRNA3的组合达到了约20%的编辑效率（图4h）。此外，我们对预测的脱靶位点的分析显示，sgRNA1没有诱导显著的脱靶突变（图S3b）。然而，ABE8e介导的c.404G>A编辑并没有增加Artemis的活性（图4d）。在c.404G>A编辑中，最常见的旁观者突变涉及位点5、7和9的同时替换。第二常见的模式发生在位点12和14，其次是位点12、14和19的突变（图4i）。这些突变模式分别对应于Y133C+T134A、D136G和D136G+R138G替换。我们发现Y133C+T134A突变不影响Artemis的活性，而单独的D136G或D136G+R138G突变则完全消除了其活性（图2f）。这些结果表明，主要的D136G旁观者突变可能是c.404G>A编辑未能恢复功能的原因。总体而言，这些结果强调了ABEs在体外有效编辑Artemis的c.49G>A突变。

3 讨论
Artemis突变通过破坏V(D)J重组和DNA双链断裂修复来阻止T细胞和B细胞的发育，导致RS-SCID。在这项研究中，我们不仅总结了影响活性的突变，还识别了Artemis的一些先前未表征的功能残基。此外，选择了三个突变位点（c.49G>A、c.181T>C和c.404G>A）来评估碱基编辑器治疗ART-SCID的潜力。我们的结果显示，rapOBEC1-SpRY-HF1-BE4max在c.181T>C位点的编辑效率约为50%，而ABE8e在c.49G>A和c.404G>A位点的编辑效率分别约为35%和20%。总的来说，这些发现证明了碱基编辑可以纠正ART-SCID相关的突变，突显了其作为治疗Artemis单核苷酸变异体的潜在策略，特别是当旁观者编辑不影响关键催化残基从而保持酶活性时。然而，当出现有害的旁观者效应时，可能需要使用具有更严格编辑窗口的碱基编辑器来最小化不必要的替换，并提高治疗的安全性和有效性。然而，这项研究仍存在一些局限性。首先，我们仅使用了ABEs和CBEs测试了A到G和C到T的转换，这两种是广泛使用的碱基编辑器类型。然而，Artemis中还存在其他类型的突变，如C到G和G到T（表1）。除了传统的A到G和C到T转换之外，DNA糖基酶介导的碱基编辑的最新进展大大扩展了核苷酸替换的范围，现在包括C到G、T到C、T到G和G到C的转换（Tong等人2023, 2024；Ye等人2024）。基于这些进展，许多可以通过DNA糖基酶编辑器结合识别非典型PAM序列的Cas9变体进行纠正的Artemis突变应该是未来治疗测试的候选对象（表1），这将进一步扩展碱基编辑在ART-SCID和其他单基因疾病中的应用范围。此外，需要注意的是，对于携带纯合大片段基因组缺失的患者，碱基编辑不是一个可行的策略，因为这些病例缺乏可编辑的模板。临床遗传模式支持了在复合杂合患者中纠正单个等位基因的治疗合理性。文献表明，虽然双等位基因突变会导致SCID的表现，但只携带一个突变等位基因的父母仍然是无症状的（Inoue等人2023；Strubbe等人2021；Sundin等人2019；Volk等人2015）。例如，Inoue等人描述了一名携带纯合exon 1—3缺陷的患者，其单等位基因的父母是健康的。这证实，如果患者携带大片段缺失和可编辑的点突变，仅纠正点突变就可以有效地将其基因型转换为携带者状态。其次，尽管c.404G>A突变的编辑效率达到了约20%，但Artemis的活性并没有显著恢复。这可能是由于D136位点的旁观者突变（图4i），该残基可能对Artemis的活性很重要（Poinsignon等人2004）。替代的基因编辑方法，如CRISPR-Cas9介导的HDR和prime editing（PE），可能提供更适合纠正这些类型突变的策略。Prime editing通过将Cas9与逆转录酶结合并使用外源性RNA模板来实现精确的核苷酸校正，从而显著减少旁观者编辑效应（Anzalone等人2019）。经过多轮优化后，prime editing在优化设置或特定细胞类型中的效率可以达到约50%（Yan等人2024）。尽管其在细胞中的效率低于碱基编辑，但其精确性使其成为未来基因治疗应用的有希望的工具（Chen等人2021；Chen和Liu 2023）。碱基编辑疗法现已进入临床开发阶段，针对SCD、β-地中海贫血、家族性高胆固醇血症和通用CAR-T疗法等多种疾病正在进行多项试验（Jiang和Yang 2023）。在β-地中海贫血和SCID的临床前研究中，使用患者来源的CD34+细胞在自我更新的HSPCs中展示了持久的治疗性编辑效果（Liao等人2023；McAuley等人2023）。本研究中的所有编辑实验都是在293T细胞中进行的，该细胞提供了一个方便且稳健的初始评估系统，但并不能完全再现人类HSPCs的生物学特性。与293T细胞不同，原代CD34+ HSPCs表现出不同的DNA修复途径偏好，并且对基因组编辑成分相关的细胞毒性更为敏感（Shin等人2020）。未来对CD34+ HSPCs的研究可能需要临床相关的递送方法，例如电穿孔核糖核蛋白（RNP）复合物，与基于质粒的递送相比，它在细胞毒性和基因组重排效率之间表现出良好的平衡（Lattanzi等人2019）。此外，维持HSPCs的干性和多谱系潜力需要专门的培养优化，包括使用特定的细胞因子或小分子来防止编辑过程中的过早分化。最重要的是，必须通过长期植入实验在免疫缺陷小鼠模型中验证碱基编辑HSPCs的治疗效果和安全性，以确保编辑后的细胞保持其自我更新能力并且不会发生恶性转化。此外，我们的脱靶分析仅限于预测的位点；因此，未来的研究需要在HSPCs中进行更全面的、全基因组的评估，以完全定义这种方法的精确性。尽管这项研究的初步性质和使用了简化的细胞模型，但我们的发现清楚地证明了碱基编辑可以用于纠正与ART-SCID相关的致病性Artemis突变。通过将精确的核苷酸校正与功能结果联系起来，这项工作突出了碱基编辑器的治疗相关性，特别是对于那些适合高效和准确编辑的突变。尽管需要进一步优化以提高精确性、减少旁观者效应，并将这些方法扩展到临床相关的细胞类型（如患者来源的CD34+ HSPCs），但碱基编辑和prime editing技术的持续快速发展为临床转化提供了强大的潜力。总体而言，我们的结果扩展了对Artemis突变的功能理解，并为未来基于基因编辑的ART-SCID及相关单基因疾病的治疗奠定了理论基础。

4 材料与方法
4.1 细胞
293T细胞系来自ATCC（Cat# CRL-3216, RRID: CVCL_0063），在DMEM（cat.: C11995500BT, Gibco）中培养，添加10% FBS，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。293TArtemis?/?细胞是在之前的研究中生成的（Huang等人2025）。转染使用jetPRIME（cat.: 114–15, PolyPlus-transfection Bioparc.）按照制造商的说明进行。
4.2 荧光报告基因检测
在24孔板中的293T Artemis?/?细胞被培养并用jetPRIME转染CJ构建载体（pCJ、小鼠RAG1和小鼠RAG2）和指示Artemis蛋白表达载体。转染4小时后，更换培养基。48小时后，用胰蛋白酶消化细胞并通过离心收集，然后用PBS洗涤一次，再悬浮在PBS中。使用Beckman FACS Calibur分析GFP表达。
4.3 质粒构建
人类Artemis基因被构建到pEZ-Flag（cat.: EX-NEG-M12, iGene Biotechnology）载体中用于蛋白表达。Artemis基因突变体通过QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（cat.: #210513, Agilent）制备。SpRY-HF1基因是从pCAG-CBE4max-SpRY-P2A-EGFP（Addgene plasmid #139999）克隆的。NRRH基因是通过引入nCas9的突变生成的。
4.4 蛋白质纯化
Expi293F细胞在Hi-exp 293培养基（cat.: AC601501, OPM Bioscience）中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为8%。为了蛋白表达，使用聚乙烯亚胺（PEI）作为转染试剂将细胞转染pEZ-Artemis质粒。DNA和PEI以1:4（w/w）的比例混合后加入细胞培养基中。转染后96小时，用预冷的PBS洗涤细胞两次。然后用裂解缓冲液（1% TritonX-100, 25 mM Tris (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA和1×蛋白酶抑制剂混合物（cat.: AG21501, Accurate Biology）裂解细胞。在4°C下以12,000 g离心10分钟后，用anti-Flag树脂（cat.: P9801, Beyotime Biotechnology）在4°C下免疫沉淀细胞裂解上清液3小时。然后用洗涤缓冲液（1% TritonX-100, 25 mM Tris (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA和1 mM PMSF）缓慢洗涤树脂五次。然后根据制造商的说明，用洗脱缓冲液（25 mM Tris (pH 7.4), 500 mM NaCl, 1 mM DTT）和含有5 μg/μl 3×Flag肽（cat.: F4799, Sigma-Aldrich）洗脱样品，并通过超滤透析缓冲液（25 mM Tris (pH 7.4), 150 mM KCl, 10% glycerol）进行透析。使用Detergent Compatible Bradford Protein Assay Kit（cat.: P0006C-1, Beyotime Biotechnology）定量纯化后的蛋白质浓度，并储存在-80°C。
4.5 体外切割实验
DNA切割底物（Huang等人2025）用Cy5荧光团标记。切割反应（10 μl）在含有25 mM Tris (pH 7.4), 10 mM KCl, 10 mM MnCl?, 0.25 mM ATP, 0.5 mg/ml BSA和1 mM DTT的反应缓冲液中进行，包括100 nM DNA底物和150 nM Artemis蛋白。反应在37°C下孵育2小时用于DNA发夹底物，或1小时用于单链DNA和DNA突出端底物。反应通过加入10 μl停止缓冲液（98% formamide, 2% EDTA）并在95°C下加热5分钟终止。然后在20%变性尿素–TBE聚丙烯酰胺凝胶上分离样品。电泳后，使用Bio-Rad QualityOne系统成像凝胶。
4.6 使用碱基编辑系统进行基因编辑
Artemis c.49G>A、c404G>A和c.181T>C突变基因通过慢病毒载体整合到293TArtemis?/?细胞的基因组DNA中。每种胞嘧啶脱氨酶变体分别克隆到BE4max构建体中。然后将ABE和CBE构建体与pUC19-gRNA质粒一起转染到293T G49A、293T G404A和293T T181C细胞中。在6孔板的每个孔中，使用4 μg的质粒DNA，CBE或ABE与gRNA的比例为3:1。转染3天后，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（cat.: 175042784, QIAGEN）提取基因组DNA，并设计引物来克隆目标和脱靶序列。PCR产物使用QIAquick PCR Purification Kit（cat.: 28106, QIAGEN）进行纯化，用于Sanger测序和深度测序。用于克隆目标位点和非目标位点的所有引物均列在表S2.4.7中。

**非目标位点和旁观者突变分析**
我们使用Cas OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder）来预测非目标位点，并选择了5个预测位点进行进一步分析（见表S2）。CRISPResso2用于计算目标位点和非目标位点的编辑频率。通过计算sgRNA目标区域内A到G或C到T的转换总频率来评估每个位点的非目标编辑效率。为了分析旁观者效应，我们过滤了深度测序数据中包含成功目标位点编辑的序列。显示了最常见的10种旁观者突变组合。

**Artemis的结构预测**
通过将相应的序列提交给SWISS-MODEL服务器（https://swissmodel.expasy.org/），并利用人类Artemis的X射线晶体结构（PDB: 6WNL）作为参考模板，对人类Artemis突变体的结构进行了建模。生成的模型在Discovery Studio中进行了能量最小化处理以优化其结构。随后，使用PyMOL及其默认设置进行了静电势计算和结构可视化。

**定量和统计分析**
在所有情况下，数据均使用GraphPad Prism 8进行处理和绘制，误差条表示三次生物学重复实验的标准差（SD）。统计显著性通过Student’s t检验来确定，其中显著性定义为*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。