“修复还是冻结？”——化学成像中由组织制备过程引起的光谱差异

《Analyst》：Fix or freeze? Spectral differences arising from tissue preparation in chemical imaging

　　光谱化学成像作为一种强大的、无标记的方法，已经出现，它基于组织内在的振动特征来可视化其生化组成。特别是，中红外光谱化学成像（MIRSI）对于研究疾病机制、识别生物标志物和指导药物开发的基础生物医学研究变得至关重要。然而，MIRSI对样品制备协议的敏感性及其对光谱数据解释的影响仍然知之甚少。在这里，我们系统地比较了使用基于量子级联激光（QCL）的MIRSI从大鼠肾脏和肝脏组织中收集的光谱数据，这些组织分别使用标准的新鲜冷冻（FF）和福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织处理方法制备。我们应用了常用的光谱数据处理技术，包括均匀流形逼近和投影（UMAP）、相关矩阵和二阶导数光谱分析，以表征制备引起的差异。FF样品保留了更广泛的生化信号，保持了组织的天然化学组成，而FFPE组织则显示出较低的光谱多样性和吸收信号强度。此外，我们观察到在FFPE样品中主要在1026 cm?1处有一个一致的光谱带，这可能是由于固定引起的化学修饰和/或结构重排。我们的发现表明，组织制备显著改变了MIRSI捕获的化学和形态信息，因此在涉及化学成像和基于人工智能（AI）的光谱分析的工作流程中，需要仔细考虑处理协议。

引言

化学成像技术正成为生物医学科学中组织分析的强大分析方法。特别是，中红外光谱化学成像（MIRSI）对于研究疾病机制、识别生物标志物和指导药物开发的基础生物医学研究变得至关重要。1–3 最近在中红外（mid-IR）光子学方面的进展改进了标准的MIRSI仪器，如傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪，4,5 同时引入了新的光谱化学成像模式，包括双频梳、基于量子级联激光（QCL）的显微镜7,8 和光学光热红外（O-PTIR）成像。9 这些MIRSI模式提供了体外组织和细胞研究中空间分辨的分子信息，揭示了光学成像方法（需要对比剂生成）无法提供的生物学见解。与揭示组织结构和形态特征的传统组织学方法不同，化学成像捕获了光谱中印制的分子指纹，揭示了健康和病变组织之间的潜在生化差异。10–12

这些技术在生物医学研究和临床环境中的信息提供程度取决于内在化学信号的保存情况。中红外分子指纹光谱包括关键的振动带，如酰胺I和II带（约1650和约1550 cm?1），它们携带有关蛋白质二级结构的信息，与脂质相关的带（约1700–1740 cm?1），以及低于1400 cm?1的磷酸或碳水化合物模式，这些可以作为功能和代谢细胞状态的生物标志物。然而，这些光谱特征可能对样品制备协议敏感，如果组织的生化完整性受损，这些特征可能会被掩盖或修改。13

两种广泛使用的制备方法，新鲜冷冻（FF）和福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE），为不同类型的应用提供了互补的优势。FFPE确保了长期保存并保持了组织形态，但通过蛋白质交联和基于溶剂的脱水诱导了化学变化。14–16 相比之下，FF组织保存协议更好地保留了不稳定的生物分子，但带来了与存储、生物安全和处理相关的物流挑战。17 之前，将FF组织的光谱与FFPE和脱蜡FF组织的光谱进行了比较，揭示了与组织制备过程相关的光谱变化。18–20 同样，使用拉曼光谱对来自癌性和健康样本的脱蜡FFPE和FF组织进行的比较研究也报告了FFPE样本中光谱信号强度的降低。21 然而，这些早期研究主要依赖于集合平均光谱或有限区域测量，这无法完全捕捉高光谱化学成像数据集中的像素级光谱异质性。相比之下，基于QCL的MIRSI能够进行大范围的像素级分析，从而不仅可以评估平均光谱差异，还可以评估带的出现、ROI到ROI的变异性，以及与下游分类相关的光谱信息的保存情况。因此，观察到了组织制备协议对光谱数据集的影响，但这阻碍了不同生物医学研究和临床应用中化学成像方法的可靠解释性和可重复性。22

在这项研究中，我们调查了样品制备方法如何影响基于QCL的MIRSI中组织切片的像素级光谱保真度、光谱多样性和下游数据解释性。通过分析使用标准FF和FFPE协议制备的大鼠肾脏和肝脏组织的数千个光谱，我们展示了FFPE处理导致了显著的光谱退化，包括与功能性生物分子（如脂质、核酸和蛋白质）相关的光谱带的减弱或消失。此外，我们的二阶导数光谱分析显示FFPE组织中的光谱带多样性降低。另外，我们观察到在FFPE样品中主要在1026 cm?1处有一个一致的光谱带，这可能是由于固定引起的化学修饰和/或结构重排。为了评估MIRSI光谱是否可以用来区分组织类型和制备方法，我们应用UMAP进行无监督聚类，发现FF组织光谱保持了足够的生化多样性以进行组织分类，而FFPE组织的光谱形成了一个压缩的簇。逻辑回归在UMAP投影数据上进一步揭示了FF和FFPE样本之间的区分特征主要来源于糖原和酰胺区域。这些结果强调了组织制备在保持组织天然生化组成中的关键作用，突出了在化学成像管道中使用机器学习技术进行MIRSI数据解释时化学固定的潜在限制效应。

材料与方法

动物处理和组织收集

所有涉及活鼠的程序均按照NIH关于实验室动物护理和使用的指南进行，并得到了威斯康星大学医学院和公共卫生学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。成年鼠通过腹腔注射含有氯胺酮（100 mg kg?1）、赛拉嗪（20 mg kg?1）和阿普唑嗪（3 mg kg?1）的混合物被安乐死，随后进行心灌流，使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和4%甲醛（PFA）。立即解剖肝脏和肾脏组织，并将其分成两半，分别用新鲜冷冻（OCT）或FFPE协议进行后续处理。

组织包埋和切片

肝脏和肾脏组织使用新鲜冷冻（FF）和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）两种协议进行制备。对于FF制备，组织被转移到冷冻模具中，嵌入到最佳切割温度（OCT）化合物中，并在干冰上快速冷冻。冷冻块在?20 °C下使用Leica CM1950冷冻切片机切成10 μm厚的切片，并安装在氟化钙（CaF2）基底上。为了去除残留的OCT，切片短暂浸泡在去离子水中（约10–30秒），然后在室温下风干。对于FFPE制备，组织首先在室温下用10%中性缓冲福尔马林（NBF）固定24–48小时。固定后，使用自动化组织处理器（Sakura VIP5组织处理器）进行处理，该处理器在分级乙醇中进行顺序脱水，在二甲苯中透明处理，并在受控温度（通常约60 °C）和真空条件下进行石蜡渗透（过夜循环）。处理后的组织被嵌入石蜡块中，并使用Leica Histocore Biocut切片机切成10 μm厚的切片。切片安装在CaF2基底上，过夜干燥，并在60 °C下短暂孵育以促进粘附和平整。在成像之前，FFPE切片使用标准化协议进行脱蜡：两次二甲苯浸泡（每次5分钟），然后两次100%乙醇清洗（每次5分钟）和一次95%乙醇清洗（5分钟）。然后将切片冲洗在蒸馏水中并完全风干。所有组织切片都安装在纯净的氟化钙（CaF2）基底上，并在4 °C下储存，直到进行光谱成像。

基于量子级联激光的中红外成像

中红外高光谱成像使用Spero-QT显微镜（Daylight Solutions, Inc.）进行，该显微镜配备了四个QCL模块，提供从950到1800 cm?1的光谱覆盖范围（图1b），如我们之前的工作所述。23 使用12.5×红外物镜（NA = 0.7；像素大小 = 1.3 μm）和未冷却的微测辐射热计焦平面阵列（480 × 480像素）获取高放大倍数的扫描。所有光谱数据都以2 cm?1的光谱分辨率收集。尽管4 cm?1的分辨率可能对某些应用足够，并可能提高采集效率，但本研究使用2 cm?1作为固定的高分辨率设置，以敏感地捕捉微妙的制备依赖性光谱变化。图1

样品制备和中红外光谱化学成像工作流程。(a) MIRSI的组织处理示意图。大鼠肾脏和肝脏组织通过新鲜冷冻（FF）在最佳切割温度（OCT）化合物中制备，或通过福尔马林固定后进行石蜡包埋（FFPE）。所有组织都被切成10 μm厚，并安装在CaF2基底上。在成像之前，移除了包埋介质OCT或石蜡。(b) 用于宽场传输模式下950–1800 cm?1指纹光谱范围的高光谱成像的基于QCL的MIRSI系统示意图。(c) 在酰胺I区域（1608 cm?1）捕获的FF和FFPE肾脏组织的代表性中红外图像。刻度条表示100 μm。(d) 来自FF和FFPE肾脏组织的测量吸收光谱。每个光谱是从约100,000个像素平均得到的。背景中的颜色带突出显示了与不同生物分子相关的光谱区域。

光谱数据预处理

在高光谱3D数据收集之后，使用自定义的Python脚本处理数据集（图2）。对于每种样品类型（FF或FFPE肝脏或肾脏；总共四种类型），获取了十个感兴趣的区域（ROIs），每个区域的大小为0.650 × 0.650 mm2（每个ROI 480 × 480个光谱）。每种样品类型保留了八个ROI以进行进一步分析，总共每个样品有8 × 480 × 480–1.8 M个光谱。图2

光谱数据处理方法概述。(a) 从每个组织样本中选择了八个ROI。通过将Otsu阈值应用于在1608 cm?1处收集的单一中红外图像，提取了与组织相关的样本光谱。刻度条表示100 μm。接下来，对提取的光谱应用橡胶带基线校正以去除散射贡献。(b) 对于定量子带分析，对过滤后的、经过聚合物拟合的光谱信号应用二阶Savitzky–Golay导数。使用3σ规则识别功能性振动带，并使用复合Simpson积分进行量化。(c) 对于光谱数据分类，生成相关热图以说明样本之间和内部的相似性。吸收光谱经过Z分数标准化，然后进行PCA以降低维度。处理后的光谱通过无监督ML方法（UMAP）进行分类，随后进行逻辑回归以评估光谱特征的重要性。在光谱数据预处理之前，我们首先识别了没有组织的空白像素，并将它们从感兴趣的数据集中移除。使用Otsu阈值（应用于在1608 cm?1处收集的中红外图像，主要是光谱中最强的带）识别了每个ROI中的非组织像素。丢弃的非组织像素的平均值被设置为背景光谱，以计算噪声。接下来，我们取背景光谱的二阶导数并计算其标准差（σ），然后将其设置为背景噪声，用于区分显著的吸收峰和背景。从每个ROI中随机选择2000个与组织相关的像素以进行进一步分析，每个样品类型得到16,000个光谱的数据集。每个与组织相关的像素光谱通过应用橡胶带基线校正来去除散射贡献。25 为了可重复性，预处理和下游光谱分析在自定义的Python脚本中实现。使用基于Otsu的阈值从1608 cm?1的图像中识别与组织相关的区域，并从每个ROI中随机采样2000个光谱以进行进一步分析。每个提取的光谱都使用基于凸包插值的橡胶带算法进行基线校正，以减少宽背景和散射贡献。对于基于导数的峰值分析，光谱使用Savitzky–Golay滤波器进行平滑和微分，并使用从非组织背景光谱的二阶导数估计的3σ阈值来识别显著峰值。使用±2 cm?1的容忍窗口评估峰值出现。对于分类分析，在PCA、UMAP和逻辑回归之前，光谱通过Z分数标准化。

为了提高吸收带的分辨率并最小化基线变化，使用Savitzky–Golay滤波器计算每个吸收光谱的二阶导数（窗口长度 = 13，多项式阶数 = 2；scipy.signal）（图2b）。由于过滤的边缘效应，从原始的426个光谱点中修剪了26个光谱点。该程序锐化了在复杂生物样本中丰富的重叠振动带，并提高了峰值检测的准确性。通过二阶导数光谱，使用3σ规则识别出显著峰值，该规则能够识别出位于计算出的3σ范围之外的显著峰值和次级峰值。这里的σ值是根据被丢弃的非组织背景光谱计算得出的，确保峰值检测基于统计严谨性而非任意阈值。从每个感兴趣区域（ROI）中随机选取100个像素光谱用于峰值出现分析，并使用平均光谱进行子带高斯拟合（图2b）。为了量化特定振动带的出现频率，将每个ROI中包含显著峰值（通过3σ规则的带）的像素数量计算为峰值出现次数，允许±2 cm?1的容忍度。然后，将每个振动带的总出现次数表示为所有分析光谱中的计数，并在图3和图4中以箱线图的形式展示结果。这种方法反映了特征吸收特征在不同样本中的出现频率，提供了组织区域内光谱一致性和生化普遍性的统计表示。

肾脏新鲜（FF）和固定-福尔马林处理（FFPE）组织的比较光谱数据变化。展示了在酰胺I带（1608 cm?1）处捕获的三个代表性中红外图像（ROI），分别对应肾脏FF（a）和FFPE（b）组织。刻度条表示100 μm。使用3σ规则检测到的二阶导数光谱中的凹陷。强度图显示了从八个ROI中随机选取的120个像素光谱生成的平均中红外光谱，通过二阶导数分析识别出子带，并对FF（a）和FFPE（b）组织应用了高斯拟合。从八个ROI中检测到的吸收峰的出现情况被绘制出来（每个ROI由100个像素代表），分别对应FF（a）和FFPE（b）组织。每个数据点代表单个ROI的平均出现次数；灰色箱线图显示了峰值出现的中心值和分布范围。在底部的积分图中，深灰色条表示每个特定带计算的积分的平均值和标准差。

肝脏新鲜（FF）和固定-福尔马林处理（FFPE）组织的比较光谱数据变化。展示了在酰胺I带（1608 cm?1）处捕获的三个代表性中红外图像，分别对应肝脏FF（a）和FFPE（b）组织。刻度条表示100 μm。使用3σ规则检测到的二阶导数光谱中的凹陷。强度图显示了从八个ROI中随机选取的120个像素光谱生成的平均中红外光谱，通过二阶导数分析识别出子带，并对FF（a）和FFPE（b）组织应用了高斯拟合。从八个ROI中检测到的吸收峰的出现情况被绘制出来（每个ROI由100个像素代表），分别对应FF（a）和FFPE（b）组织。每个数据点代表单个ROI的平均出现次数；灰色箱线图显示了数据的中心值和分布范围。在底部的积分图中，深灰色条表示每个特定带计算的积分的平均值和标准差。通过使用复合Simpson规则（scipy.integrate）在定义的光谱窗口内进行数值积分，提取了每个子带的定量吸收信息，并根据已知的功能团光谱位置分配了振动带。用于积分的光谱区域列在表1中。

参考积分区间沿二阶导数吸收光谱

分配
峰值中心 [cm?1]
参考DNA
约966
糖原
约1030
DNA
约1035
DNA
约1082
糖原
约1154
蛋白质
约1168
酰胺III
约1238
酰胺III
约1308
蛋白质
约1400
蛋白质
约1448
脂质
约1462
酰胺II
约1516
酰胺II
约1546
酰胺I
约1658
脂质
约1744

光谱数据分类

对于光谱数据分类，每个ROI随机选取了2000个像素光谱（样本类型总共160,000个光谱）。计算了ROI之间的相关性，并以热图的形式显示，说明了同一样本类型内ROI之间的相似程度，并突出了不同样本之间的差异。吸收光谱经过Z分数标准化（均值=0，标准差=1）进行标准化处理，然后进行主成分分析（PCA）以减少维度，接着使用UMAP进行组别分离的可视化。最后，使用逻辑回归评估特征重要性，并识别出前40个信息量最大的波数（图2c）。

样本制备对肾脏和肝脏组织光谱完整性的影响

为了评估组织样本制备对中红外光谱数据集的影响，我们分别分析了使用新鲜（FF）或固定-福尔马林处理（FFPE）协议处理的大鼠肾脏和肝脏组织（图3和图4）。所有测量的组织在完成各自的FF或FFPE制备工作流程后，都切割成相同的标称厚度10 μm，确保在切片过程中厚度控制一致。尽管由于组织结构的异质性可能会导致有效光程长度的轻微局部变化，但这些变化主要影响整体吸收强度而非光谱特征。如补充信息图S1所示，组织区域内观察到的空间异质性主要由强度变化主导，这支持了厚度效应并不是导致本研究中报告的组织制备方法引起光谱特征差异的唯一原因。在肾脏组织中，FF切片始终表现出更强的整体吸收和更大的光谱多样性（更高的出现频率），与FFPE组织相比（图3）。为了用严谨的数据分析支持我们的观察结果，我们考虑了每个FF和FFPE样本的八个ROI（每个ROI 100个光谱）的光谱数据。根据我们的3σ规则，在FF肾脏组织中一致观察到十三个不同的峰值，DNA、蛋白质和脂质相关带得到了良好的保留（图3a）。相比之下，FFPE组织中只检测到八个带（图3b）。虽然蛋白质相关带（酰胺I和II）仍然可检测到，但DNA和脂质的信号显著减弱或消失。在光谱中还观察到一个位于1788 cm?1附近的弱特征；尽管它可能满足检测阈值，但由于无法将其可靠地解释为与组织相关的强信号，因此被排除在进一步的生物学解释之外。FF和FFPE切片之间的光谱差异不仅限于吸收强度的均匀降低。相反，FFPE处理选择性地改变了指纹区域内特定振动带的可检测性、相对突出性和出现频率，表明潜在的生化信息发生了非均匀的修改。重要的是，FFPE组织中DNA和脂质相关带的明显丢失不应被解释为它们的完全生化缺失。相反，这一观察反映了在相同分析条件下化学提取和光谱检测能力降低的结合。已知在FFPE处理过程中，脂质会在反复的二甲苯和乙醇洗涤过程中部分去除，导致脂质相关振动特征的减少。相比之下，核酸如DNA和RNA在组织基质中大部分得以保留，但在福尔马林固定过程中会发生化学修饰和交联，导致吸收强度降低和带形改变。由于FF和FFPE数据集使用了相同的处理流程，FFPE样本中信号幅度的降低和信噪比的降低使得DNA和RNA相关带即使存在也不太可能被检测到。图3a和b中的出现图总结了FF和FFPE样本的光谱带整体多样性。来自八个不同ROI的光谱中带出现的差异可以归因于肾脏切片横截面的空间组成变化，这些切片由不同的组织和细胞类型组成。此外，平均而言，FFPE中的酰胺1带的吸收强度比FF肾脏组织测量值低66.3%（(integralFF ? integralFFPE)/(integralFF)）。我们假设FFPE协议在化学上较为苛刻：反复的二甲苯和乙醇洗涤可能会提取或降解生物分子成分，导致信号强度降低和可检测到的峰值减少。之前已有使用各种化学成像技术的类似观察结果18–21。除了这些光谱差异外，代表性的中红外图像还揭示了明显的制备依赖性形态差异。FF切片经常显示出孔洞、断裂和不连续性，而FFPE切片则看起来更加完整和视觉上均匀。这些图像级别的观察与组织制备的明显物理后果一致。为了进一步评估空间异质性是否对观察到的光谱差异有贡献，我们分析了像素级聚类结果（补充信息图S1）。虽然t-SNE揭示了每个组织切片内的空间异质区域，但相应的簇平均光谱显示出高度一致的光谱轮廓，变化主要体现在吸收强度上，而不是峰值位置或形状上。这表明ROI内的异质性主要由局部强度变化主导，而不是内在的生化差异。因此，本研究中报告的制备依赖性光谱差异不能仅归因于厚度或空间变异性，而是反映了FFPE处理引起的真实生化改变。同样，FF肝脏组织在光谱范围内显示出更多样化和更强的分子特征，与FFPE组织切片相比（图4）。虽然酰胺I和II带通常很强，在FFPE肝脏组织中仍然可检测到，但在1400 cm?1以下的多个带丢失了。这一观察表明FFPE处理并不简单地均匀减弱光谱，而是优先抑制或改变了特定的生化特征，特别是在低波数指纹区域。考虑到每个FF和FFPE样本的八个ROI（每个ROI 100个光谱）的光谱数据，我们在FF肝脏组织中一致识别出十三个不同的峰值，而在FFPE样本的不同像素光谱中只捕获到七个峰值。图4a和b分别展示了FF和FFPE的显著峰值出现情况，总结了来自不同ROI的带多样性。尽管在ROI之间观察到一些变化，补充信息图S1表明这些差异主要是由吸收强度的变化引起的，而不是光谱轮廓的变化。我们还发现FFPE中酰胺1带的平均吸收强度比FF肝脏组织测量值低46.2%，这与我们在肾脏组织中的发现一致。肝脏是一个代谢复杂度高的器官，含有大量化学不稳定的分子。FFPE样本中光谱强度的降低和带的丢失可以归因于福尔马林固定的化学后果，包括蛋白质交联以及在乙醇和石蜡包埋过程中的脂质和不稳定成分的去除。例如，作为肝脏代谢标志物的糖原带（@1030 cm?1）仅在FF肝脏组织中观察到（如图4a所示）。总体而言，这些发现强调了FFPE在全面化学映射方面的局限性，并突出了FF制备在保留代谢活跃组织的生化复杂性以进行MIRSI分析方面的优势。

为了进一步研究样本制备对光谱特征区分能力的影响，我们首先计算了不同样本类型ROI之间的相关矩阵，并以热图的形式显示（图5a）。相关矩阵显示了同一样本类型不同ROI的光谱具有高度相似性，同时突出了由于组织处理导致的肝脏和肾脏组织之间的差异。

相关矩阵和UMAP聚类揭示了组织处理对化学成像中光谱区分能力的影响。(a) 相关性热图展示了同一样本类型内ROI的光谱相似程度，并突出了使用不同协议处理的组织之间的差异。(b) 来自FF和FFPE大鼠肾脏和肝脏组织的标准化光谱的UMAP投影。(c) 绘制了肝脏FF和FFPE样本的平均和标准化光谱，并识别出前40个具有区分能力的波数，并在光谱下方用黑线标出。(d) 绘制了肾脏FF和FFPE样本的平均和标准化光谱，并识别出前40个具有区分能力的波数，并在光谱下方用黑线标出。括号中的数字表示检测到的重要特征的数量。(e) 放大1000 cm?1到1060 cm?1的二阶导数光谱，显示了在FFPE样本中主要检测到的1026 cm?1处的独特吸收带。此外，我们对大鼠肾脏和肝脏组织的预处理光谱应用了UMAP。在通过PCA降低光谱维度后，共有20,000个光谱被用于UMAP分析。从总共八个感兴趣的区域（ROIs）中，每种样本类型（FF和FFPE处理的肝脏和肾脏）随机选择了5000个光谱。UMAP根据组织处理方法揭示了不同的聚类模式。无论组织类型是肝脏还是肾脏，FFPE处理后的样本光谱都形成了一个紧密聚集的单一簇。相反，FF样本的光谱保留了肾脏和肝脏组织之间的独特光谱特征（图5b）。鉴于所研究的器官——肝脏和肾脏具有不同的生物学和生理功能，FF组织光谱能够区分它们的化学成分是预期之中的。然而，FFPE组织光谱之间重叠的UMAP簇表明，化学处理过程去除了每种器官类型特有的关键光谱特征。为了识别最具区分性的光谱特征，我们将逻辑回归模型应用于UMAP聚类的光谱数据集，并确定了在肾脏和肝脏样本中排名最高的特征波数。排名前40的特征波数主要位于低波数区域（核酸带、与碳水化合物相关的带），以及酰胺I和II区域，这些是与功能性生物分子相关的关键振动模式（图5c和d）。这一结果进一步表明，FF和FFPE组织之间的差异不仅仅是由整体振幅衰减引起的，还受到指纹区域和酰胺区域相对光谱结构的微妙变化的影响。这些结果突显了FF组织在保留生物学相关特征方面的优越性，这对于应用化学成像进行生物医学研究和诊断应用至关重要。

除了信号衰减之外，FFPE处理还引入了一个在约1026 cm?1处的独特吸收带，这在任何新鲜冷冻（FF）样本中都没有观察到（图5e）。这一特征在FFPE处理的肝脏切片中一致被检测到，在肾脏切片中也部分存在，表明它与固定过程有关，而不是组织本身的组成。我们将其解释为与固定相关的光谱特征。已知甲醛固定涉及多步骤反应，包括形成可逆的甲基醇（–CH2OH）加合物，随后缩合成更稳定的交联结构，如亚甲基桥。先前的研究使用模型肽和质谱技术已经证明，这些反应会产生一系列修改后的蛋白质物种，而不是单一的主导产物。在这种情况下，约1026 cm?1处的带可能反映了与固定引起的化学修饰和/或结构重排相关的振动贡献，尽管无法做出明确的归因。重要的是，除了这个额外特征的出现，我们还观察到酰胺I和酰胺II区域的系统性光谱位移（图5c和d）。这种带位移在甲醛固定组织的振动光谱研究中已被广泛报道，通常归因于蛋白质构象、氢键和由交联引起的分子环境的变化。我们数据中的这些位移进一步支持FFPE处理会引起可测量的生化和结构改变。这些结果共同表明，FFPE处理不仅降低了原始光谱对比度，还引入了与固定相关的光谱特征。在解释旨在探测内在生化特征的光谱数据时，应仔细考虑这些效应。

拉曼光谱（RS）的补充见解进一步支持了本研究中观察到的处理诱导的光谱变化的解释。之前基于RS的研究比较了新鲜和FFPE组织，表明甲醛固定通常保留了主要的生化特征，同时引入了可测量的变化，包括与蛋白质交联和分子构象改变相关的强度变化和带位移。

这些观察结果与我们的MIRSI发现一致，即主要光谱特征在不同处理方法之间保持不变，而固定处理降低了光谱多样性，并引入了特定于处理的特征。总的来说，我们的发现强调了样本制备协议对光谱化学组织图像数据集的保真度和可解释性的重要作用。虽然FFPE因其形态保存和长期存储的优势而被广泛使用，但其涉及的强烈化学处理可能会损害不稳定的分子特征，并引入特定于固定的伪影，从而限制了分析深度并复杂化了基于AI的分类或生物标志物发现流程。相比之下，尽管FF制备在物流上要求更高，但它保留了生物学和生理学上具有信息量的分子特征。然而，正如中红外图像所示，FF切片的组织形态受到了影响。这不是一个重大障碍，因为可以使用成熟的光学宽场显微镜通过已建立的组织病理学技术轻松分析形态。随着MIRSI应用在生物医学研究中的不断扩展，仔细考虑样本制备协议对于保持原始化学组成至关重要，这可以实现准确的光谱分类并支持强大的机器学习应用。我们的结果表明，应根据成像研究的主要目标仔细选择样本制备策略。当保持生化保真度至关重要时，新鲜冷冻（FF）组织是更优的选择，因为它们更好地保留了原始分子组成和光谱多样性。相比之下，FFPE组织提供了更好的形态保存和长期稳定性，但可能会引入固定诱导的光谱特征，这可能会降低光谱变异性并掩盖微妙的生化特征。重要的是，我们注意到最佳制备条件取决于组织类型。组织组成的差异（例如，富含脂质与富含蛋白质的组织）会显著影响固定效率和光谱结果。因此，优化FF组织制备和装片协议至关重要，例如最小化冻融循环、控制切片温度和确保一致的基底接触，以保持结构完整性和光谱质量。值得注意的是，化学成像研究可以从具有先进分子保存技术的最新FF组织制备方法中受益。对于FFPE样本，我们建议严格标准化固定时间、石蜡处理和基于溶剂的脱蜡步骤，因为这些参数会显著影响光谱的可重复性。先前的研究还强调了固定时间、脱水协议和脱蜡效率的差异会导致可测量的光谱变化，这强调了需要控制和一致的工作流程。

结论

本研究表明，组织样本处理显著影响了中红外光谱化学成像中生化信息的保存。通过直接比较FF和FFPE大鼠肾脏和肝脏组织的中红外光谱，我们发现FF样本一致地保留了更多样化和更强烈的生化信号范围，相比之下FFPE组织则不然。值得注意的是，我们在FFPE样本中观察到了一个在1026 cm?1处的一致光谱带，这很可能是由固定引起的化学修饰和/或结构重排造成的。这些发现表明，FFPE处理不仅降低了原始分子特征，还可能引入特定于固定的伪影。随着化学成像向临床和AI集成生物医学应用的进步，优化和标准化整个化学成像研究社区的样本制备对于确保光谱保真度和准确的生化解释至关重要。

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能会影响本文报告的工作。

数据可用性

支持本研究发现的数据可在合理请求下从相应作者处获得。用于光谱处理、分析和可视化的所有代码都公开发布在GitHub上：https://github.com/YesilkoyLab/public-.git。补充信息（SI）也可获取。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6an00137h。

致谢

作者感谢威斯康星大学转化病理学研究计划（TRIP）实验室的支持，该实验室得到了UW病理学和实验室医学系、UWCCC（P30 CA014520）以及NIH主任办公室（S10 OD023526）的设施和组织学服务支持。F. Y.和P. C.感谢美国国立卫生研究院（R61CA281795）的财政支持。