《Biomaterials Science》：Beyond first responders: neutrophils shape biomaterial-guided regeneration
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长期以来，中性粒细胞被视为短寿命的效应细胞，主要负责清除病原体和诱导急性炎症。然而，新出现的证据重塑了这一范式，揭示了中性粒细胞显著的可塑性及其积极协调组织修复和再生的能力。中性粒细胞调节血管生成、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM
长期以来，中性粒细胞被视为短寿命的效应细胞，主要负责清除病原体和诱导急性炎症。然而，新出现的证据重塑了这一范式，揭示了中性粒细胞显著的可塑性及其积极协调组织修复和再生的能力。中性粒细胞调节血管生成、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑、巨噬细胞极化以及炎症的消退。已鉴定出不同的中性粒细胞亚群，包括促炎性和促消退表型，这突显了它们对微环境信号动态适应的能力。值得注意的是，中性粒细胞通过释放基质金属蛋白酶、生长因子、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）和专门的促消退介质（Specialized Pro-resolving Mediators, SPMs）来促进血管网络的形成。在生物材料植入的情况下，中性粒细胞是与植入装置相互作用的第一个免疫细胞，其行为关键性地塑造了异物反应（Foreign Body Response, FBR）并影响下游的再生结果。早期的组织工程策略旨在抑制中性粒细胞募集，而近期免疫调节生物材料的进展则寻求利用中性粒细胞的可塑性。这些方法包括促进及时的细胞凋亡和胞葬作用、调节活性氧和NET的形成，以及引导中性粒细胞向促再生表型极化。本篇综述讨论了目前对中性粒细胞异质性、其在血管化和组织再生中的作用，以及旨在调节中性粒细胞反应的新兴生物材料策略的认识。理解并有策略地引导中性粒细胞行为，可能代表了开发下一代再生疗法的关键一步。
1. 引言
传统观点认为中性粒细胞是短寿命、终末分化的免疫细胞，主要负责通过吞噬、脱颗粒和产生活性氧等机制清除病原体。然而，转录组学和单细胞分析的最新进展修正了这一观点。现有证据表明中性粒细胞具有显著的表型和功能多样性，其状态受局部细胞因子、代谢因子和缺氧条件的影响。在感染、癌症、缺血和无菌性损伤等多种情境下，已观察到多种不同的亚群，包括促炎性、促消退性、免疫抑制性和促血管生成性中性粒细胞。
除抗微生物活性外，中性粒细胞还积极参与组织修复。组织再生需要免疫反应、血管生成、细胞外基质重塑以及干细胞/祖细胞募集的协调作用。在愈合过程中，中性粒细胞帮助重建ECM、清除死亡细胞和碎片，并通过自身的细胞死亡和被清除过程来塑造巨噬细胞的行为。至关重要的是，中性粒细胞是形成新血管的关键参与者，这是组织正常愈合的关键步骤。通过释放如血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-9、促愈合的特殊介质以及中性粒细胞胞外陷阱等物质，中性粒细胞影响内皮细胞的迁移、新血管的生长和血管的成熟。
再生医学传统上优先考虑干细胞、生长因子和支架设计，常常忽略了免疫系统在组织修复中的关键作用。近期的研究表明，炎症是再生过程中一个受控且必不可少的部分，这促使免疫调节策略将早期炎症反应转向愈合。组织工程的快速进展改进了靶向修复方法，其中生物材料通过提供结构支持和模拟天然组织环境发挥着关键作用。
基于生物材料的组织工程已经从生物惰性支架的开发，发展到设计具有生物活性和免疫调节功能的平台。植入的生物材料或医疗设备是早期细胞介质。它们在材料界面的募集、活化状态和存留，关键性地影响着后续的巨噬细胞极化、纤维化包封和血管整合。损伤部位存在的免疫细胞类型和特性将影响修复过程的结果和质量，因为这些细胞可以通过分泌分子（如生长因子和细胞因子）创造有利于再生的微环境。组织再生成功的另一个基本因素是建立有效的血管化，以确保营养和氧气供应，从而保证植入生物材料和医疗设备的长期存活和功能。因此，生物材料的免疫调节（特别是通过炎症消退）和促血管生成效应是再生医学的关键因素。
当前的策略寻求抑制中性粒细胞浸润，但人们越来越认识到，精确调节（而非抑制）中性粒细胞活性可以优化再生结果。最近的研究表明，生物材料的物理化学性质，包括硬度、表面化学、拓扑结构和降解动力学，直接影响中性粒细胞的活化、NET形成、凋亡和极化。此外，能够随时间控制中性粒细胞募集和消退的工程化系统，在促进血管生成、干细胞募集和功能性组织修复方面显示出有希望的结果。这些发现确立了中性粒细胞作为连接早期炎症和建设性重塑的关键介质。
2. 中性粒细胞
中性粒细胞是先天免疫系统中最丰富的细胞类型，约占人类血液中所有白细胞的60%至70%。每天有1011个细胞在骨髓中产生和成熟。从那里，中性粒细胞进入血液循环，直到它们离开进入组织。当它们的寿命在组织内结束时，凋亡的中性粒细胞主要被巨噬细胞吞噬。中性粒细胞由造血细胞产生，经过一个包括早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状细胞和成熟中性粒细胞五个阶段的分化过程。不成熟的中性粒细胞以带状或环状核为特征，在应激或炎症期间从骨髓释放，并表现出增强的炎症和氧化爆发能力。终末分化的中性粒细胞被称为多形核细胞，其细胞质含有与其功能相关的特定蛋白质的颗粒和分泌囊泡。
2.1. 中性粒细胞动力学与募集
在稳态条件下，这些细胞存在于骨髓、脾脏、肝脏和肺等器官中，只有1-2%在循环中。目前关于中性粒细胞如何被引导至这些器官及其功能的知识仍然匮乏。据信，它们可能作为成熟中性粒细胞的储存库，可以快速响应炎症或感染，或者边缘化的粒细胞可能持续监测这些器官的组织损伤或微生物入侵。在炎症条件下，血液中的中性粒细胞在损伤后20分钟即可迁移至损伤部位。受损细胞释放危险信号，包括损伤相关分子模式和病原体相关分子模式。两种起始信号都可以激活相同的模式识别受体，启动中性粒细胞募集。中性粒细胞向感染或损伤部位的募集是一个受调控的多步骤过程，包括拴系、滚动、粘附、爬行和跨内皮迁移，主要发生在毛细血管后微静脉。它涉及由短期信号触发的初始阶段，以及由持久信号驱动的后续中性粒细胞浸润增加的放大阶段。
炎症刺激诱导内皮细胞表达选择素、粘附分子和趋化因子，启动中性粒细胞的募集和在血管壁上的滚动。滚动主要由选择素-配体相互作用介导，这使中性粒细胞在血流剪切力下减速，并允许它们感知活化信号。随后，内皮表面呈现的趋化因子通过G蛋白偶联受体触发快速的由内向外信号传导，导致中性粒细胞整合素如淋巴细胞功能相关抗原1和巨噬细胞抗原1的构象变化。这种激活增加了整合素的亲和力和效价，导致中性粒细胞与内皮配体如细胞间粘附分子1和血管细胞粘附分子1的牢固粘附。牢固粘附后，中性粒细胞经历粘附增强和血管内爬行，以找到适合跨内皮迁移的位置。跨内皮迁移可以通过旁细胞途径（通过内皮细胞连接）或跨细胞途径（直接穿过内皮细胞）发生，并由中性粒细胞整合素和内皮连接分子之间的协调相互作用介导。在穿过内皮后，中性粒细胞还必须穿透基底膜和周细胞层，通常发生在ECM密度降低的区域。这些后期阶段涉及额外的整合素、蛋白水解酶和细胞骨架重排，以促进中性粒细胞有效进入感染或受损组织，同时保持血管完整性。
2.2. 吞噬作用与杀菌活性
中性粒细胞的最初作用是通过吞噬、释放活性氧和颗粒蛋白、形成NETs以及分泌炎性细胞因子来消除病原体。在中性粒细胞识别病原体后，吞噬作用在吞噬溶酶体中发生，涉及微生物的包裹。当调理素受体激活激酶以重组细胞骨架进行内化时，该过程开始。吞噬作用后，中性粒细胞通过两个相互关联的抗菌机制消除内化的病原体：氧依赖性和氧非依赖性途径。氧依赖性反应由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶复合物的快速激活启动，该复合物在吞噬膜上组装，响应吞噬或细胞外刺激。活性氧化酶组装的装配需要胞质亚基的磷酸化和易位，这些过程受蛋白激酶C和丝裂原活化蛋白激酶信号传导的调节。激活的NADPH氧化酶将电子从胞质NADPH转移到分子氧，在吞噬体中产生活性氧。这种初级活性氧随后转化为高杀微生物性的产物，包括过氧化氢、羟基自由基和次氯酸，共同介导有效的病原体杀灭。尽管这种氧化爆发通常与微生物清除相关，但中性粒细胞也可以在无菌炎症条件下产生高水平的活性氧，这突出了氧化机制在炎症反应中更广泛的作用。
中性粒细胞含有特殊化的细胞内颗粒，储存着多种杀菌分子，在非氧化性抗菌防御中起着核心作用。遇到病原体时，这些颗粒要么与吞噬体融合介导细胞内杀灭，要么通过胞吐作用释放到细胞外起作用。颗粒来源的抗菌剂包括髓过氧化物酶、溶菌酶、乳铁蛋白、基质金属蛋白酶和几种蛋白酶，特别是中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G。其中，嗜天青颗粒是丝氨酸蛋白酶的主要储存库，例如中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、蛋白酶3和天青杀素，这些对于降解和杀灭被吞噬的微生物至关重要。吞噬作用后，颗粒-吞噬体融合将这些酶送入正在形成的吞噬溶酶体，其中吞噬体内的pH值动态变化对于最佳蛋白酶活性至关重要。吞噬体腔的初始碱化，由超氧阴离子歧化驱动，创造了有利于早期蛋白酶激活和高效微生物杀灭的条件。随着活性氧产生的减少，吞噬体在颗粒持续融合的过程中逐渐酸化。
2.3. 中性粒细胞胞外陷阱：机制与功能意义
除了常规的细胞内杀灭和单个细菌的降解外，中性粒细胞通过NETs进行细胞外细菌杀灭的概念在过去十年中受到了广泛关注。NETs代表了一种重要的抗菌机制，补充了中性粒细胞常规的细胞内杀灭。NETs由去凝聚的染色质组成，装饰有颗粒和胞质蛋白，在响应促炎刺激时主动排出到细胞外空间。这一过程被称为NETosis，最初被描述为一种刺激后数小时发生的细胞死亡形式。然而，使用活体显微镜的体内观察表明，中性粒细胞在NET释放后可以保持存活，生成无核细胞，这些细胞保留了吞噬和吞噬体成熟等功能，表明NET的形成并不必然导致中性粒细胞死亡。
NET形成的分子通路复杂且依赖于环境。响应于佛波酯或钙离子载体等刺激，蛋白激酶C的激活和钙内流促进中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶从颗粒转移到细胞核，驱动染色质去凝聚。这一过程需要Rac2活性和由NADPH氧化酶生成的活性氧，其激活了肽酰基精氨酸脱亚氨酶4，导致组蛋白瓜氨酸化和染色质展开。相比之下，由细菌或免疫复合物诱导的NETosis通过不同的信号级联进行，涉及整合素结合以及SFK和脾酪氨酸激酶的激活。虽然NETs有助于微生物的捕获和杀灭，但其核和颗粒成分的含量也可能暴露自身抗原并释放DAMPs，可能放大炎症并促进组织损伤。
3. 中性粒细胞的适应性
中性粒细胞传统上被视为短寿命细胞，在免疫系统中的作用范围有限。然而，最近的研究表明，中性粒细胞的平均循环寿命可以更长，这挑战了中性粒细胞是终末分化细胞同质群体的概念。最近中性粒细胞生物学的发展揭示了不同中性粒细胞亚群的存在，这些亚群构成了感染、炎症和癌症免疫学中更广泛的作用机制谱系。此外，中性粒细胞可以动态调整其转录和功能谱，这些谱系由微环境线索、代谢适应和表观遗传修饰塑造。
中性粒细胞异质性首次在1986年被描述，当时通过梯度分离程序分离出低密度中性粒细胞和高密度中性粒细胞。这两个群体在急性或慢性炎症性疾病患者的血液中很容易区分。在癌症中观察到不同的功能性中性粒细胞亚群，其中肿瘤相关中性粒细胞被描述为表现出N1（抗肿瘤）或N2（促肿瘤）表型的极化状态，受环境背景和特定肿瘤来源的细胞因子影响，类似于肿瘤相关巨噬细胞。最近的研究表明，心肌梗死后存在时间性的中性粒细胞极化，并认为类似于巨噬细胞，外周血中性粒细胞在体外可以被极化为促炎或抗炎表型。其他研究也表明，中性粒细胞在不同组织中表现出组织特异性的基因表达谱，表明局部微环境可以塑造中性粒细胞的功能特化。
中性粒细胞在多个维度上表现出相当大的异质性，包括：核形态、极化和密度。这种可塑性涵盖了从幼稚祖细胞到衰老中性粒细胞的分化阶段连续体。
4. 中性粒细胞与血管化
血管化和炎症的过程是相互依赖的；这些细胞类型之间存在实际的相互作用。事实上，免疫细胞从血管到组织的渗出是由内皮细胞介导的，内皮细胞表达几种白细胞粘附分子，而免疫细胞分泌的可溶性因子将影响内皮细胞的增殖、迁移和活化，并能创造一个导致组织血管化增加的微环境。血管化和血管生成是愈合的基本支持，因为新的脉管系统提供氧气和营养物质，促进组织再生。免疫系统的细胞在新血管形成过程中是关键角色，它们极化为不同表型的能力使其能够通过产生多种不同的因子来诱导或抑制血管生成过程。
成熟的中性粒细胞含有超过700种蛋白质，包括储存在细胞核和颗粒中的生长因子或促血管生成因子。这些蛋白质可以在激活时快速释放，并直接促进血管网络的重建。多项研究强调了中性粒细胞在血管化中的重要作用。在使用具有中性粒细胞募集缺陷的基因敲除动物的啮齿动物伤口愈合模型中，观察到新血管化的减少。在其他研究中，通过抗体消耗中性粒细胞会导致植入物中的血管化受损，而随后回输中性粒细胞可恢复血管化。在脑缺血模型中，消耗中性粒细胞抑制了VEGF诱导的血管生成。在氧诱导的视网膜病变模型中，中性粒细胞耗竭导致新血管化减少。在体外模型中，中性粒细胞显著增强了稳定微血管样网络的形成，并上调了促血管生成和成骨标记物的表达，支持了其超越早期炎性防御的再生潜力。
中性粒细胞是参与促进血管网络构建的重要免疫细胞之一，它们根据所处的炎症微环境采用不同的亚型。中性粒细胞通过不同的机制介导组织再血管化：用裂解和蛋白水解酶分解受损细胞和ECM；通过吞噬作用清除细胞碎片；凋亡和随后由巨噬细胞进行的胞葬作用；释放调节巨噬细胞和辅助性T细胞活性的免疫调节细胞因子；分泌促血管生成和组织重塑因子；NETs和活性氧的促血管生成作用；产生SPMs。
5. 中性粒细胞在再生过程中的潜力
中性粒细胞在维持许多器官组织内的平衡中起关键作用，类似于巨噬细胞，它们采用适应这些组织需求的特征。它们与先天性和适应性免疫细胞一起引导免疫反应，参与慢性炎症状况，并表现出再生特性，有助于不同器官的组织修复。中性粒细胞通过多种机制促进组织修复。一些修复功能，如基质金属蛋白酶-9的递送，似乎是非特异性的，发生在所有器官中，而在某些情况下，例如视神经的愈合或肺上皮细胞的再生，存在明确特定的效应功能。总的来说，这些发现挑战了中性粒细胞纯粹是促炎细胞的传统观点，并凸显了它们作为组织再生关键调节者的新兴作用。
5.1. 肝脏
肝脏不断暴露于肠道来源的成分，在生理条件下维持耐受状态。然而，过度刺激可引发炎症，促进慢性肝病的进展。中性粒细胞传统上与炎症期间的组织损伤有关，但最近的证据强调了它们在急性和慢性肝损伤中的修复作用。活体成像研究表明，中性粒细胞不仅清除细胞碎片，还通过形成新血管的结构套促进血管再生。中性粒细胞通过多种相互关联的机制促进肝脏再生。其主要作用之一是通过基质金属蛋白酶-8和基质金属蛋白酶-9降解纤维化成分，减少胶原积累并促进纤维溶解。慢性肝损伤的实验模型表明，中性粒细胞数量增加与纤维化减少相关，而中性粒细胞耗竭加剧了纤维化进程，突出了中性粒细胞在慢性肝病中的抗纤维化潜力。此外，在药物诱导的肝损伤中，中性粒细胞来源的活性氧通过激活巨噬细胞中的Ca2+–CaMKKβ–AMPK通路，驱动其从促炎表型向修复表型的转换，加速炎症消退和肝细胞再生。中性粒细胞来源的微RNA-223通过抑制巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶和Nod样受体蛋白3的表达来调节氧化应激和炎症信号传导，促进M2修复表型。SPMs进一步限制中性粒细胞趋化性，抑制细胞因子产生，并增强吞噬作用，在应激条件下防止肝细胞凋亡。最近证据还揭示了一种由白血病抑制因子受体介导的双向肝细胞-中性粒细胞通讯网络。最后，在局灶性坏死性损伤模型中，中性粒细胞迅速浸润受损区域，分解坏死肝窦，并促进血管生成。中性粒细胞产生的活性氧和过氧化氢使巨噬细胞向修复表型极化。
5.2. 心血管系统
急性心肌梗死仍然是欧洲发病率和死亡率的主要原因，其特征是缺血导致的氧和营养剥夺，导致广泛的心肌细胞死亡，并激活强大的炎症反应，从而启动心脏修复机制。中性粒细胞是心肌梗死后最早被募集到心脏的免疫细胞之一，越来越多的证据表明，除了在炎症消退中的作用外，中性粒细胞还具有促修复和促血管生成功能，有利于梗死后的心脏重塑。心肌梗死后，CXC趋化因子配体12–CXC趋化因子受体4信号的破坏促进中性粒细胞从骨髓动员到外周血，随后浸润到缺血心肌。在梗死组织内，中性粒细胞参与清除坏死心肌细胞和细胞碎片，从而促进伤口愈合。巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的吞噬诱导抗炎和促消退介质的产生，包括TGF-β1、IL-10、VEGF和SPMs，这些共同促进炎症消退和心脏修复。此外，垂死的中性粒细胞释放抗菌α-防御素，增强巨噬细胞的吞噬能力，同时减弱其促炎细胞因子的产生。实验研究表明，使用抗Ly6G抗体长期耗竭中性粒细胞会加剧AMI后的心功能不全，增加促纤维化细胞因子的表达，并加剧心肌纤维化。这些发现强调了及时的中性粒细胞凋亡和胞葬作用在促进巨噬细胞向修复表型极化（具有增强的碎片清除能力）中的重要性。此外，一部分被募集的中性粒细胞在梗死心肌内经历表型和转录组重编程，产生表达抗炎介质如精氨酸酶-1、IL-10和TGF-β1的N2样修复性中性粒细胞。中性粒细胞与巨噬细胞合作，也释放制瘤素M，直接作用于心脏成纤维细胞和心肌细胞，刺激血管生成并促进坏死组织的清除。血管生成是AMI后有效心脏修复的关键组成部分，中性粒细胞作为梗死心脏中膜联蛋白A1的主要来源促进巨噬细胞向促血管生成表型极化，该表型通过分泌VEGF-A支持血管形成。活性氧在AMI后的心脏愈合中也起着至关重要的作用，可促进死亡细胞和细胞碎片的清除。尽管在急性缺血阶段，多形核白细胞过量产生活性氧可能是有害的，但积累的证据表明，中性粒细胞来源的信号也可以通过募集和激活单核细胞来发挥修复作用。这些有益作用至少部分是通过巨噬细胞向修复表型的极化介导的，这一过程涉及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。
5.3. 肺
肺部在中性粒细胞运输方面是一个独特的器官，因为即使在稳态条件下，它也含有大量中性粒细胞。与其他组织不同，肺中的中性粒细胞募集不仅通过β2整合素依赖性的高内皮微静脉发生，也通过L-选择素和β2整合素非依赖性途径在肺泡毛细血管床内发生。在病理条件下，过度的中性粒细胞迁移会导致显著的解剖和功能损伤，包括细胞间连接的破坏、上皮细胞凋亡、剥脱和上皮通透性增加。这个损伤阶段随后是一个以上皮细胞增殖和再上皮化为特征的修复阶段，这在急性肺损伤中是恢复和生存的关键决定因素。尽管有损伤潜力，但积累的证据表明，中性粒细胞的积累也有助于肺上皮的修复和再生。除了抗菌
