综述：亚北极湖泊中蜗牛中间宿主体内的吸虫：关于分子多样性的最新研究进展

《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》：Trematodes in snail intermediate hosts of a subarctic lake: updated perspectives on molecular diversity

　　米哈尔·贝诺维茨（Michal Benovics）| 卡米拉·潘托哈（Camila Pantoja）| 佩特拉·昆迪德（Petra Kundid）| 克里斯蒂安·塞尔巴赫（Christian Selbach）| 米罗斯拉娃·索尔达诺娃（Miroslava Soldánová）
布拉迪斯拉发科梅尼乌斯大学自然科学学院动物学系，Ilkovi?ova 6号，842 15，布拉迪斯拉发，斯洛伐克

**摘要**
亚北极淡水生态系统传统上被认为寄生虫种类较少，但最近的分子研究逐渐挑战了这一观点。我们在挪威北部塔克瓦特恩湖（Lake Takvatn）的软体动物中间宿主体内寄生虫多样性方面进行了更新后的分子评估，这距离首次全面调查（2012-2013年）已经过去了十多年。2024年共检查了2,496只属于五个物种的软体动物。对软体动物体内阶段的分子分析发现了24种吸虫及其所属的七个科的物种级谱系。第一中间宿主体内的吸虫感染率为12.3%，其中Ampullaceana balthica的感染率（18.1%）高于Gyraulus acronicus（2.3%），而在其他软体动物宿主体内仅检测到少数感染（球形螺属中10例，Valvata属中1例）。软体动物还经常作为第二中间宿主，尤其是对于Cotylurus cornutus和Echinoparyphium recurvatum。尽管两次调查的总体物种丰富度相当（均报告24个分类单元），但群落组成显示出明显的变化：有15个分类单元在两次调查中都存在，而之前记录的9个分类单元未被再次发现，并且新识别出9个谱系，其中一些可能是科学上的新发现。两次调查中吸虫科的一致性表明，尽管存在物种级别的更替，但这些科的结构长期保持稳定。Ampullaceana balthica仍然是主要的吸虫传播宿主，承载了71%的检测到的分类单元；而之前被认为作用较小的Gyraulus acronicus则成为多种吸虫/谱系的重要第一和第二中间宿主。我们的结果表明，尽管宿主多样性较低，亚北极湖泊仍能维持相对较高的吸虫物种丰富度，并且吸虫群落的组成可能会随时间发生变化，而不是单向减少。宿主的可用性，特别是最终宿主鸟类，似乎是维持高纬度淡水生态系统吸虫传播的关键因素。这些发现突显了快照重采样方法在评估自然系统中寄生虫群落时间动态方面的价值。

**1. 引言**
双殖吸虫是后生动物寄生虫中最多样化的群体之一，是全球水生环境中寄生虫多样性的重要组成部分（Cribb等人，2001；Pérez-Ponce de León，2001；Esch等人，2002；Littlewood等人，2015）。除了其分类学上的丰富性外，吸虫在宿主种群动态和食物网结构中发挥着关键作用，影响生态相互作用、能量流动和生物量分布（Kuris等人，2008；Lafferty等人，2008；Preston等人，2013；Frainer等人，2018；Nadler等人，2023）。这种生态重要性主要源于它们复杂的生命周期，这种生命周期将多个营养级和生态系统边界的宿主联系起来。软体动物（主要是腹足类）作为必需的第一中间宿主处于这些生命周期的核心位置，随后将寄生虫传播给无脊椎动物和脊椎动物的第二中间宿主及最终宿主（Esch等人，2002；Galaktionov和Dobrovolskij，2003）。在蜗牛体内，吸虫通过孢子囊和/或红胞无性繁殖，并持续产生大量自由生活的感染阶段——尾蚴，这些尾蚴在许多物种中会主动寻找后续宿主。这使得蜗牛群落成为吸虫多样性的关键储存库（Sures等人，2025），同时也是传播途径和生态系统级生物多样性的重要指标（Hechinger和Lafferty，2005；Hechinger等人，2007）。蜗牛也可以作为某些吸虫的第二中间宿主，携带等待营养级传播的尾蚴，从而进一步连接底栖生境和更高营养级的生物。因此，吸虫的生命周期将宿主的可用性与更广泛的群落相互作用和水生食物网功能联系起来（Poulin和Morand，2004；Marcogliese，2005；Lafferty等人，2008）。这强调了在解释寄生虫多样性和传播模式时理解完整生命周期的重要性（Blasco-Costa和Poulin，2017）。

理解这些生态联系依赖于可靠的物种级鉴定。然而，由于物种间的形态相似性以及隐秘分类单元的存在，准确评估吸虫多样性长期以来一直受到阻碍。这些限制在幼虫阶段尤为明显，尤其是尾蚴阶段，仅凭形态特征往往无法进行可靠的物种级鉴定，尽管存在主要吸虫群的诊断特征（Hechinger，2023；Cribb等人，2025）。因此，分子方法变得至关重要，揭示了蜗牛中许多先前未被识别的谱系（例如，Georgieva等人，2013；Kundid等人，2024），以及包括高纬度淡水生境在内的水生生态系统中出乎意料的高吸虫丰富度（例如，Soldánová等人，2017；Gordy和Hanington，2019；Kudlai等人，2021；Pantoja等人，2021；Faltynková等人，2025及其中的参考文献）。

亚北极淡水生态系统为研究吸虫多样性提供了独特的背景。这些系统以强烈的季节性、漫长的冬季、短暂的高产夏季和相对简单的宿主群落为特征（Selbach和Paterson，2025），长期以来被认为支持寄生虫种类较少的动物群（Galaktionov，1996；Dobson等人，2015；Hoberg等人，2013；Kutz等人，2009）。然而，最近的分子研究表明，亚北极淡水生境可以维持多样化的吸虫群落，这些群落受到迁徙宿主（主要是鸟类）的扩散和适宜中间宿主的可用性的影响（Soldánová等人，2017；Gordy和Hanington，2019；Shaw等人，2020；Faltynková等人，2025及其中的参考文献）。在这种宿主有限的系统中，吸虫可能构成生物多样性的重要组成部分，并作为北部景观生态和环境变化的敏感指标（Faltynková等人，2025；Louvard等人，2025综述）。

本研究关注的挪威北部的塔克瓦特恩湖（69°07'N，19°05'E；海拔214米；面积14.2平方公里）是一个寡营养湖泊，也是亚北极地区研究最深入的淡水生态系统之一，长期以来一直作为生态学和寄生虫学研究的模型系统（Amundsen等人，2009；Amundsen等人，2019）。对该湖进行的唯一一次群落水平的分子调查显示，发现了异常高的多样性，包括24种吸虫及其遗传谱系（Soldánová等人，2017）。大部分多样性与软体动物相关，尤其是Ampullaceana balthica（以前称为Radix balthica；Lymnaeidae），它被确定为与19种吸虫分类单元兼容的关键第一中间宿主。相比之下，第二丰富的蜗牛Gyraulus acronicus（Planorbidae）中的感染很少，仅以尾蚴的形式被记录，其作为第一中间宿主的角色尚不确定，因为此前未在该物种体内检测到任何内部寄生虫阶段（Soldánová等人，2017），尽管它已知具有寄生吸虫的潜力。随后在塔克瓦特恩湖进行的分子研究集中在禽类血吸虫上，确认了一种名为Trichobilharzia sp. “peregra”的物种（Soldánová等人，2022），并识别出三个额外的血吸虫谱系（即与Trichobilharzia不同的遗传分化单系群），其中两个是新的记录，包括首次在Gyraulus acronicus中发现的两个谱系（Kibet等人，正在审稿中）。这些研究表明，塔克瓦特恩湖中的至少27种吸虫感染软体动物，并为未来高纬度地区吸虫多样性的比较提供了分子参考框架。进一步的研究表明，吸虫对该湖生态系统的寄生虫多样性和食物网结构及能量途径有显著贡献（Born-Torrijos等人，2020，2021；Shaw等人，2020；Moore等人，2024），支持了寄生虫是水生生态系统不可或缺组成部分的更广泛证据（Kuris等人，2008；Lafferty等人，2008）。

尽管研究努力不断增加，但蜗牛中的吸虫多样性及其时间持续性仍知之甚少，因为许多地理区域的物种清单仍然不完整，包括北部生态系统（Faltynková等人，2025综述），并且经常忽视了软体动物宿主在吸虫生命周期中的核心作用（Esch等人，2002）。亚北极生态系统还经历显著的环境变化和持续的气候变化（Kutz等人，2009；Hoberg等人，2012；Galaktionov，2017；Amundsen等人，2019；Morison等人，2023），包括冰盖和温度制度的变化。这些变化可以改变宿主的可用性和季节性传播窗口，从而影响寄生虫群落和传播动态（Marcogliese，2005；Galaktionov，2016；Galaktionov等人，2019；Selbach等人，2024）。由于长期评估很少，且通常关注寄生虫感染水平的变化而非多样性变化（Hammoud等人，2026），因此在长时间间隔后对吸虫多样性进行快照重采样为评估亚北极生态系统中寄生虫群落的稳定性和时间动态提供了宝贵的机会，尤其是在已有分子基线数据的情况下。

在这项研究中，我们提供了挪威塔克瓦特恩湖吸虫分子多样性的更新评估，重点关注淡水软体动物中间宿体内的感染情况。我们检查了几种腹足类物种，特别是Ampullaceana balthica（Lymnaeidae）和Gyraulus acronicus（Planorbidae），这两种在湖泊中常见的且生态上重要的蜗牛物种。我们的研究基于2024年7月、8月和10月收集的材料，这距离Soldánová等人最初的分子调查已经过去了十多年。特别是A. balthica被广泛认为是欧洲多种吸虫的重要第一中间宿主（Duan等人，2021；Schwelm等人，2021），包括高纬度地区（Faltynková等人，2025），而G. acronicus的吸虫群落仍研究不足（Faltynková等人，2016）。通过使用分子方法鉴定软体动物体内的阶段（孢子囊、红胞和尾蚴），以及存在的尾蚴来指示软体动物作为第二中间宿主的作用，我们的目标是：（i）重新评估十多年后的吸虫物种丰富度；（ii）评估吸虫群落的持续性和更替；（iii）进一步阐明这两种蜗牛物种作为亚北极湖泊生态系统中关键传播枢纽的生态作用。

**2. 材料与方法**
2.1. 采样和材料处理
塔克瓦特恩湖的软体动物群落包括五个物种：三种腹足类（Ampullaceana balthica（Lymnaeidae）、Gyraulus acronicus（Planorbiidae）和Valvata sp.（Valvatidae），以及两种小型蛤蜊（Pisidium casertanum和Sphaerium sp.（双壳纲，Sphaeriidae）（Soldánová等人，2017；本研究）。主要采样对象是A. balthica和G. acronicus，它们是沿岸带最常见且最容易采集的软体动物宿主，而较少见或难以采集的物种如Valvata sp.和球形螺属蛤蜊则根据机会进行采集。因此，采样努力并不针对所有宿主物种均等，而是反映了它们在野外的相对可用性和可检测性。这种采样策略反映了沿岸软体动物群落的结构及其在该系统中的已知重要性（参见Soldánová等人，2017）。宿主身份的确认基于之前的分子鉴定：A. balthica（同义词Radix balthica）和球形双壳类（Soldánová等人，2017）以及G. acronicus（Kibet等人，正在审稿中）。之前仅通过形态学鉴定为Valvata piscinalis的Valvata标本，在本研究中使用保存在96%分子级乙醇中的组织样本进行了分子验证。

采样于2024年7月、8月和10月在湖泊的三个沿岸地点进行（69°05'12.2"N，19°08'17.6"E；69°05'40.7"N，19°06'50.4"E；69°07'02.9"N，19°05'03.9"E），后两个地点A. balthica和G. acronicus的密度较高。蜗牛通过手工从浅水区（≤1米深度）的石头上采集，或使用筛子采样器（网孔大小1毫米）从2-10米深的湖底沿岸区域拖取。筛子中保留的大型植物材料随后被分类以回收相关的软体动物，包括Valvata sp.和球形双壳类。这种采样方法与之前对该湖的调查方法一致（Soldánová等人，2017），允许直接比较数据集。

软体动物被单独放入装有过滤湖水的烧杯中，在实验室温度（约20°C）下暴露48小时以刺激尾蚴的出现。然后使用标准鉴定钥匙（Faltynková等人，2007，2008）根据形态特征活体检查尾蚴并进行初步鉴定。暴露期后，所有软体动物都在Zeiss Stemi DV4立体显微镜（Carl Zeiss Microlmaging GmbH，德国哥廷根）下解剖，以检测孢子囊或红胞（潜伏感染）和尾蚴。尾蚴使用配备Bresser MicroCam II数码相机（Bresser GmbH，德国雷德）的光学显微镜进行拍照记录。

为了进一步评估采样的完整性并解释不同宿主物种之间的采样努力差异，在RStudio 2023.12.1（Posit Team，2024；R Core Team，2024）中使用iNEXT包（Hsieh等人，2025）进行了稀释分析，基于发生数据（存在-缺失），将单个蜗牛作为采样单元。为每个蜗牛宿主构建了单独的发生矩阵，排除了所有样本中都缺失的分类单元。采样完整性通过样本覆盖率来量化，使用稀释曲线和外推曲线来评估采样努力与物种多样性之间的关系。95%的置信区间是通过自助重采样估计得出的。可视化使用ggplot2包（Wickham, 2016）完成的。记录了感染宿主个体的数量和感染记录的总数，后者包括单个宿主体内的双重感染，因此超过了感染宿主的数量。根据Bush等人（1997）的方法，以感染宿主个体相对于检查个体总数的比例来计算吸虫科的流行率。由于并非所有感染都能可靠地鉴定到物种水平，因此使用科级分类来保留所有可用数据，并允许在样本之间进行一致比较。在A. balthica蜗牛中偶尔观察到Plagiorchis属的尾蚴，这些蜗牛同时携带同一分类单元的孢子囊和尾蚴，通常出现在健康状况较差的宿主体内。由于从未在缺乏软体动物内部阶段的蜗牛（孢子囊或雷迪亚）中发现Plagiorchis的尾蚴，这些情况被解释为宿主体内的囊化而不是在第二中间宿主体内的独立感染，因此从流行率估计中排除。Soldánová等人（2017）也注意到了类似的现象，导致一些Plagiorchis分离株被报告为尾蚴。所有检测到的感染都用96%的分子级乙醇保存以进行DNA分析。然而，并非所有感染都进行了分子分析，要么是因为扩增失败，要么是因为先前的研究已经证明了同种性。例如，在28条感染记录中只有2条Trichobilharzia sp. VIII的分离株被测序，并包含在Kibet等人的研究中（正在审稿中）。这一遗传谱系在Takvatn的先前分子研究中始终对应于同一物种，其中被报告为Trichobilharzia franki单倍型“peregra”或Trichobilharzia sp. “peregra”（Soldánová等人，2017；Soldánová等人，2022）。尽管如此，初步的形态学鉴定允许将感染可靠地分配到属水平，从而能够计算大多数分类单元的科级流行率。仅由生殖细胞或未成熟尾蚴组成的潜伏感染无法通过分子方法成功鉴定（补充表S1），因此从分类单元水平的流行率估计中排除。只有被鉴定到物种或假定物种水平谱系的分类单元被纳入丰富度比较中，未解决的感染未被视为单独的分类单元，以确保一致性并避免高估物种丰富度。分子凭证存放在捷克科学院生物学中心的寄生虫学实验室，位于捷克布杰约维采。

2.2. 基因组DNA提取、扩增和测序
在DNA提取之前，将储存在96%分子级乙醇中的尾蚴、雷迪亚、孢子囊或尾蚴用真空离心机干燥。然后使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，德国希伦）按照制造商的协议提取基因组DNA。DNA提取后，进行聚合酶链反应（PCR），总体积为20 μl，包含10 μl的FIREPol Master Mix Ready to Load（Solis BioDyne Oü，爱沙尼亚塔尔图）、0.5 μM的每种引物和3 μl的DNA模板以及无核酸酶的水。选择的扩增区域是为了能够将新获得的序列数据与先前调查的序列进行比较（Soldánová等人，2017），每种预期的吸虫属使用的相应引物在补充表S2中列出。使用Folmer等人（1994）描述的引物和扩增协议确认了选定的Valvata（腹足纲，Valvatidae）标本的物种身份。PCR产物通过电泳在1.5%琼脂糖凝胶中检测，并用GoodView（SBS Genetech，中国北京）染色。扩增产物使用EPPiC Fast（A&A Biotechnology，波兰格但斯克）按照制造商的协议进行纯化。对于双向测序，使用了Macrogen Europe的服务（荷兰阿姆斯特丹）。

2.3. 序列数据集组装和系统发育分析
新获得的序列用于评估收集的吸虫幼虫阶段的物种身份。为了确定收集标本的系统发育位置，从GenBank获得了来自同属物种或系统发育上接近物种的额外同源序列（检索到的序列列表在补充表S3中）。选择序列基于它们的重叠长度和足够的关联元数据，以支持序列标本的来源。共组装了六个序列数据集，包括每个物种/假定物种水平遗传谱系中最长的唯一同属序列（即Soldánová等人，2017；Lebedeva等人，2022；Izrailskaia等人，2024；Stanevi?iūt?等人，2025）：（i）用于评估Apatemon物种的系统发育位置和物种指定的数据集，包含部分COI序列（包括Australapatemon sp.同源物作为系统发育树的外群）；（ii）包含Cotylurus物种的部分COI序列的数据集（包括Apharyngostrigea pipientis同源物作为外群）；（iii）包含Diplostomum物种的部分COI序列的数据集（包括Tylodelphys aztecae同源物作为外群）；（iv）包含Echinoparyphium同源NAD1序列的数据集（包括Echinostoma revolutum同源物作为外群）；（v）包含Notocotylidae物种COI序列的数据集（包括Hippocrepis hippocrepis同源物作为外群）；（vi）包含各种Plagiorchis物种的非同源COI区域的序列的数据集（包括Orientocreadium elegans同源物作为外群）。由于Soldánová等人（2017）之前的研究中的Plagiorchis序列长度不足，因此从数据集中省略了这些序列，但使用了GenBank中可用的同种序列。每个数据集中的同源序列使用MAFFT（Katoh等人，2002）中实现的快速傅里叶变换算法进行比对，使用G-INS-i细化方法。每个比对都被视为密码子分区的，并且对于后续的系统发育分析，为密码子内的每个位置独立选择了GTR模型，包括伽马分布和不变位点的比例。系统发育树使用贝叶斯推断（BI）和最大似然（ML）方法在MrBayes 3.2（Ronquist等人，2012）和RAxML 8.1.12（Stamatakis，2006，2014）中构建。BI分析使用了Metropolis-coupled Markov链蒙特卡洛算法，进行了两次并行运行，一次冷运行和三次热运行，每次运行10^6代（Plagiorchis和Diplostomum数据集分别运行了2x10^6和5x10^6代），每100代采样一次树。在检查标准差分裂频率低于0.01后，丢弃了所有保存树的初始30%作为“燃烧期”。使用Tracer v. 1.7.1（Rambaut等人，2018）检查运行的收敛性和单个运行的参数。每个树节点的后验概率计算为恢复给定支系的样本频率。通过模拟103个伪重复样本来评估ML树的支系自助支持。

3. 结果
2024年在三次采样中检查了2,496个属于五个物种的软体动物。其中，307个个体作为第一中间宿主被感染（总体流行率为12.3%；表1）。然而，共检测到319条感染记录（12.8%），由于A. balthica中的双重感染（n=12；检查个体的0.8%），感染数量超过了感染宿主的数量，其中大多数感染涉及Plagiorchis属与其他吸虫分类单元的组合（n=10）。根据采样设计，该设计遵循Soldánová（2017）的方法，并与Takvatn湖之前的数据一致，软体动物群落主要由两种最常遇到的蜗牛物种主导，即A. balthica（n = 1,589）和G. acronicus（n = 701）（表1）。A. balthica中的吸虫流行率（18.1%）高于G. acronicus（2.3%）（表1），而Valvata属和球形蛤类的感染水平较低（表1），这反映了机会性采样。因此，两种关键蜗牛物种之间的寄生虫物种多样性差异得到了大样本量的支持。大多数感染记录通过分子方法成功鉴定（319条中的235条；74%；表1），其中大多数是具有尾蚴出现的显性感染（补充表S1）。在未鉴定的感染中，大多数来自A. balthica（72条记录），包括18条由潜伏孢子囊感染引起的感染（1.1%；补充表S1）。此外，G. acronicus中有5条感染，Valvata属和球形蛤类中各有1条感染无法通过分子方法鉴定（表1）。

表1. 2024年Takvatn湖中软体动物第一（孢子囊、雷迪亚和尾蚴）和第二（尾蚴）中间宿主中的吸虫感染和流行率（%）。
宿主科/物种
第一中间宿主
第二中间宿主
检查数量
感染数量（%）
分子鉴定感染数量（%）
分子鉴定感染数量（%）
腹足纲
Lymnaeidae
Ampullaceana balthica
1,589
287 (18.1)
299 (18.8)
224
181 (11.4)
8
Planorbidae
Gyraulus acronicus
701
16 (2.3)
16 (2.3)
97
3 (10.4)
2
Valvatidae
Valvata sp.
86
1 (1.2)
1 (1.2)
0
双壳纲
Sphaeriidae
Pisidium casertanum/ Sphaerium sp.
120
3 (2.5)
3 (2.5)
27 (5.8)
1
总计
2,496
307 (12.3)
319 (12.8)
235
261 (10.5)
11
a
包括单个宿主体内的双重感染在内的总感染数量。
为了评估不同宿主物种的采样完整性，进行了样本覆盖率和稀释分析（补充图S1）。Ampullaceana balthica显示出高样本覆盖率（98.6%），表明捕获了大多数吸虫多样性，而G. acronicus的覆盖率较低（68.8%），并且单一种类的比例较高，表明采样不完整。这种模式与稀释分析一致：A. balthica的曲线接近平台期，而G. acronicus的曲线随着采样努力的增加而继续上升，表明进一步采样可能会检测到更多物种（补充图S1）。由于检测到的感染数量极低（补充图S1，表1），P. casertanum/Sphaerium sp.和Valvata sp.的采样完整性估计不可靠，限制了基于覆盖率的估计器的适用性。
软体动物也作为第二中间宿主，有261个个体在A. balthica、G. acronicus和P. casertanum/Sphaerium sp.中携带尾蚴（总体流行率为10.5%；表1）。两种腹足类的流行率相似（11.1%），但球形蛤类的流行率较低（5.8%；补充表S1）。在Valvata属中没有检测到尾蚴感染，且在任何软体动物宿主体内都没有观察到多重感染（表1和补充表S1）。总共11个尾蚴分离株通过分子方法成功鉴定（占所有261个感染软体动物的4.2%；表1）。

3.1. 采样吸虫的多样性和系统发育
分子系统发育分析揭示了2024年记录的五个软体动物宿主体内的24种吸虫物种和物种水平谱系（以下简称“物种”）（详见下面的分子结果；表2）。这些包括之前在湖泊中通过分子方法鉴定的四种血吸虫谱系（详见Kibet等人正在审稿中的图4A–F、5J–L、6G–I中的尾蚴显微照片）。在Valvata sp.中还检测到一种未鉴定的Strigeidae（暂时命名为Strigeidae gen. sp.），但由于形态鉴定有限和缺乏成功的分子数据，其身份无法确定到科水平以上。两种关键蜗牛物种A. balthica和G. acronicus分别作为Notocotylidae、Schistosomatidae和Strigeidae代表的第一中间宿主，以及作为Strigeidae的第二中间宿主（表2）。

表2. Takvatn湖中软体动物中间宿主体内的吸虫：2012–2013年调查（Soldánová等人，2017）和2024年调查（本研究）的比较。第一和第二软体动物中间宿主基于已发表和新获得的数据显示。每次调查中的存在用符号×表示。保留了Soldánová等人（2017）的原始谱系名称以便直接比较；基于最近分子数据的更新鉴定用括号提供。
吸虫科/物种
第一软体动物中间宿主
第二软体动物中间宿主
Soldánová等人（2017）
本研究
Allocreadiidae
Allocreadium neotenicum–a
×
Crepidostomum farionis
Pisidium casertanum; Sphaerium sp.
×
Crepidostomum metoecus
Pisidium casertanum
/ Sphaerium sp.
××
Crepidostomum sp. 1c
Sphaerium sp.
×
Crepidostomum sp. 2c–a
×
Diplostomidae
Diplostomum phoxini
Ampullaceana balthica
×
Diplostomum sp. Lineage 3c
Ampullaceana balthica
×
Diplostomum sp. Lineage 4c
= D. petromyzifluviatilis
Ampullaceana balthica
××
Diplostomum sp. Lineage 5c
Ampullaceana balthica
×
Diplostomum sp. Lineage 6c
Ampullaceana balthica
××
Tylodelphys sp.
c
Ampullaceana balthica
×
Echinostomatidae
Echinoparyphium recurvatum
Ampullaceana balthica
Pisidium casertanum/ Sphaerium sp.
××
Notocotylidae
Notocotylus ikutai e
Ampullaceana balthica; Gyraulus acronicus–f
××
Notocotylus sp. 1g
Ampullaceana balthica–f
×
Notocotylus sp. 2g
Gyraulus acronicus–f
×
Plagiorchiidae
Plagiorchis sp. 1c
Ampullaceana balthica
××
Plagiorchis sp. 2c
Ampullaceana balthica
××
Plagiorchis sp. 3c
Ampullaceana balthica
××
Plagiorchis sp. 4c
Ampullaceana balthica
××
Plagiorchis sp. 5c
Ampullaceana balthica
××
Plagiorchis sp. 6c
Ampullaceana balthica
××
Plagiorchis sp. 7c
Ampullaceana balthica
××
Plagiorchis sp. 11
Ampullaceana balthica
×
Schistosomatidae
Trichobilharzia franki单倍型 "peregra" (= Trichobilharzia sp. VIII)
h
Ampullaceana balthica–f
××
Avian schistosomatid sp. I6 (= Schistosomatidae gen. sp. X)
h
Gyraulus acronicus–f
×
Schistosomatidae gen. sp. XXIIg,h
Ampullaceana balthica–f
×
Schistosomatidae gen. sp. XXIIIg,h
Gyraulus acronicus–f
×
Strigeidae
Apatemon gracilis
Ampullaceana balthica
××
Apatemon sp. 6
Gyraulus acronicus
×
Apatemon sp. T1g
Gyraulus acronicus
×
Apatemon sp.T2gGyraulus acronicus×Apatemon sp.cAmpullaceana balthica×Cotylurus cornutusAmpullaceana balthicaAmpullaceana balthica；Gyraulus acronicus××Strigeidae属未鉴定种Valvata属未鉴定种；没有证据表明软体动物参与了生命周期。bPisidium casertanum和Sphaerium属在本次调查中未能区分；P. casertanum在Soldánová等人（2017年）的研究中被确定为宿主。c在Soldánová等人（2017年）的研究中提出的新物种；Diplostomum属的3-6谱系由Blasco-Costa等人（2014年）基于分子数据在冰岛发现。d根据Soldánová等人（2017年）的研究中的生命周期数据和宿主特异性推断出的第一个中间宿主。e在Soldánová等人（2017年）的研究中鉴定为Notocotylus属。f生命周期中没有第二个中间宿主。h根据Kibet等人（正在审稿中）的研究更新了禽类血吸虫的分类；Trichobilharzia franki单倍型“peregra”由Jouet等人（2010年）基于分子数据在冰岛发现；Avian schistosomatid sp. I6由Aldhoun等人（2012年）基于分子数据在捷克共和国发现。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图4. Strigeidae科活尾蚴的显微照片：(A–B) Apatemon gracilis ex Ampullaceana balthica；(C–D) Cotylurus cornutus ex A. balthica；(E–F) Strigeidae属未鉴定种 ex Valvata属。（A, C, E）尾蚴的总体视图，比例尺100 μm；(B, D, F）身体细节，箭头指示穿透腺的位置，比例尺50 μm。下载：下载高分辨率图像（618KB）下载：下载全尺寸图像图5. Faltynková等人（2023年）定义的Apatemon sp. 6的活尾蚴显微照片（Strigeidae科）ex Gyraulus acronicus。(A) 尾蚴的总体视图；(B) 身体细节；(C) 带有口刺的前部区域；(D) 分叉结构细节。比例尺：(A) 100 μm；(B–D) 50 μm。作为第一中间宿主的软体动物中物种最丰富的科是Plagiorchiidae（8种），其次是Strigeidae（5种未鉴定种）和Schistosomatidae（4种；Kibet等人，正在审稿中）（表2）。Ampullaceana balthica容纳了最高的吸虫多样性，寄主了六个科中的大多数分类单元（表2）。在该宿主体内最普遍的科是Plagiorchiidae（6.7%），其次是Strigeidae（3.5%）和Diplostomidae（2.6%），其余的Schistosomatidae、Notocotylidae和Echinostomatidae的流行程度相当（1.4–1.8%；补充表S1）。相比之下，G. acronicus支持的总体多样性较低，包含三个吸虫科，包括两种Schistosomatidae、两种Strigeidae和一种Notocotylidae（表2），后两者是该宿主体内最普遍的科（1.0%；补充表S1）。Sphaeriid蛤仅被一种allocreadiid感染，而Valvata属仅发现了一种未鉴定的Strigeidae感染（表2）。作为第二中间宿主的软体动物中仅检测到两个吸虫科，每个科各代表一个物种。Cotylurus cornutus（Strigeidae）的尾蚴在A. balthica和G. acronicus中均有发现，流行程度相似（分别为11.4%和10.4%），而Sphaeriid蛤仅被Echinoparyphium recurvatum（Echinostomatidae）感染（5.8%）（表1和补充表S1）。两种宿主体内的尾蚴感染强度不同。在A. balthica中，感染强度从1到50个尾蚴不等（平均=4.0 ± 5.1），几乎一半的受感染蜗牛（48.6%）仅携带1-2个尾蚴，而高感染强度（每只蜗牛15-50个尾蚴）较为罕见（占所有案例的0.6%）。在G. acronicus中，感染强度从1到25个尾蚴不等（平均=2.5 ± 3.5），大多数受感染的蜗牛（78.1%）携带1-2个尾蚴，高感染强度（每只蜗牛11-25个尾蚴）较为罕见（占所有案例的1.4%）。在感染E. recurvatum的Sphaeriid蛤中，感染强度从1到5个尾蚴不等（平均=2.6 ± 1.5）。系统发育重建用于评估收集到的属内的物种多样性，或对于Notocotylidae科，则是科内的物种多样性。对于大多数分类单元，下面按属（以及Notocotylidae科）组织了单独的结果。Crepidostomum属是一个例外，因为仅从两个P. casertanum/Sphaerium属蛤标本中恢复了rediae，并根据部分COI基因序列明确鉴定为C. metoecus（尾蚴的显微照片不可用），因此未对该物种进行系统发育重建。来自Takvatn湖的禽类血吸虫谱系的结果在Kibet等人（正在审稿中）中呈现，包括尾蚴的显微照片（见图4A–F, 5J–L, 6G–I）。3.1.1. Plagiorchis（Plagiorchiidae）用于评估Plagiorchis物种多样性的最终比对基于78个部分COI Plagiorchis序列构建，涵盖18个物种/谱系（添加了Orientocreadium elegans作为外群），涵盖了741个明确比对的核苷酸位置。两种系统发育分析（BI和ML）生成的树具有相同的拓扑结构，因此仅展示BI树及其后验概率和自助法支持值（图1）。系统发育树明确确认了Takvatn湖A. balthica中存在七个Plagiorchis物种，包括六个根据Soldánová等人（2017年）定义的物种（Plagiorchis sp. 1–6；图2A–F）和一个根据Kundid等人（2024年）定义的物种（Plagiorchis sp. 11；图2G）。然而，由于序列长度不足（尾蚴的显微照片不可用），单个蜗牛标本中的Plagiorchis sp. 7序列未包括在系统发育分析中。除了Plagiorchis sp. 7外，同种标本之间仅记录了轻微的种内变异。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图1. 使用贝叶斯推断重建的78个Plagiorchis物种序列的系统发育树。该树基于741 bp长的部分COI基因区域比对，并以Orientocreadium elegans作为外群。节点处的圆圈表示后验概率（上半部分）和自助法支持值（下半部分），根据上方角落的图例。分支长度表示每个位置的替换次数。新生成的序列以粗体显示。括号表示新生成序列的编号或来源国家（从GenBank检索的序列）。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图2. Ampullaceana balthica中的Plagiorchis spp.（Plagiorchiidae）活尾蚴的显微照片。(A) 根据Soldánová等人（2017年）定义的Plagiorchis sp. 1；(B) 根据Soldánová等人（2017年）定义的Plagiorchis sp. 2；(C) 根据Soldánová等人（2017年）定义的Plagiorchis sp. 3；(D) 根据Soldánová等人（2017年）定义的Plagiorchis sp. 4；(E) 根据Soldánová等人（2017年）定义的Plagiorchis sp. 5；(F) 根据Soldánová等人（2017年）定义的Plagiorchis sp. 6；(G) 根据Kundid等人（2024年）定义的Plagiorchis sp. 11。根据Soldánová等人（2017年）定义的Plagiorchis sp. 7的显微照片不可用。比例尺：50 μm。3.1.2. Apatemon（Strigeidae）用于评估Apatemon物种多样性的最终比对基于28个部分COI Apatemon序列构建，涵盖六个物种/谱系（添加了Australapatemon sp.作为外群），涵盖了729个明确比对的核苷酸位置。两种系统发育分析（BI和ML）生成的树具有相同的拓扑结构，因此仅展示BI树及其后验概率和自助法支持值（图3）。系统发育树显示在收集的标本中存在四个Apatemon分类单元（图4, 图5, 图6）。在所有检测到的Strigeidae中，最普遍的物种是A. gracilis（图4A–B），仅感染A. balthica（未计算流行程度，但大多数分离株属于该物种，共52个中的52个；补充表S1）。该物种也表现出轻微的种内遗传变异，尽管GenBank中没有用于构建树的COI区域的同属序列，但使用Moszczynska等人（2009年）的引物扩增的其他COI区域确认了收集标本的物种身份。第二个物种是根据Faltynková等人（2023年）定义的Apatemon sp. 6，仅在三个G. acronicus蜗牛个体中检测到（图5）。此外，两个G. acronicus分别感染了Apatemon sp. T1和Apatemon sp. T2（图6A–C和图6D–F）。这两个物种在分析的部分COI区域表现出显著的遗传差异（729 bp中有1.92%的差异），并且在形态上也有所不同（图6）。系统发育分析表明它们与Apatemon sp. 6是姐妹群。从单个G. acronicus标本（分离株479）获得的ITS1–5.8S–ITS2序列与GenBank中存储的Apatemon sp. 6的直系序列（OQ102389）相同。两种Apatemon物种（即Apatemon sp. T1，分离株91和Apatemon sp. T2，分离株90）之间的未校正p距离均为3.98%。下载：下载高分辨率图像（710KB）下载：下载全尺寸图像图3. 使用贝叶斯推断重建的28个Apatemon物种序列的系统发育树。该树基于729 bp长的部分COI基因区域比对，并以Australapatemon sp.作为外群。节点处的圆圈表示后验概率（上半部分）和自助法支持值（下半部分），根据上方角落的图例。分支长度表示每个位置的替换次数。新生成的序列以粗体显示。括号表示新生成序列的编号或来源国家（从GenBank检索的序列）。下载：下载高分辨率图像（899KB）下载：下载全尺寸图像图6. Gyraulus acronicus中的Apatemon spp.（Strigeidae）活尾蚴的显微照片。(A–C) Apatemon sp. T1：(A) 尾蚴的总体视图；(B) 身体细节；(C) 分叉结构细节。(D–F) Apatemon sp. T2：(D) 尾蚴的总体视图；(E–F) 咬盘区域细节。比例尺：(A, D) 100 μm；(B, C, E, F) 50 μm。3.1.3. Cotylurus（Strigeidae）用于评估Cotylurus物种多样性的最终比对基于31个部分COI Cotylurus序列构建，涵盖Stanevi?iūt?等人（2025年）定义的七个物种（添加了Apharyngostrigea pipientis作为外群），涵盖了356个明确比对的核苷酸位置。两种系统发育分析（BI和ML）生成的树具有相同的拓扑结构，因此仅展示BI树及其后验概率和自助法支持值（图7）。系统发育树显示A. balthica中存在一个Cotylurus物种（图4C–D）；然而，在同种标本中观察到显著的种内遗传变异。下载：下载高分辨率图像（904KB）下载：下载全尺寸图像图7. 使用贝叶斯推断重建的31个Cotylurus物种序列的系统发育树。该树基于793 bp长的部分COI基因区域比对，并以Apharyngostrigea pipientis作为外群。节点处的圆圈表示后验概率（上半部分）和自助法支持值（下半部分），根据上方角落的图例。分支长度表示每个位置的替换次数。新生成的序列以粗体显示。括号表示新生成序列的编号或来源国家（从GenBank检索的序列）。下载：下载高分辨率图像（622KB）下载：下载全尺寸图像图8. 使用贝叶斯推断重建的135个Diplostomum物种序列的系统发育树。该树基于356 bp长的部分COI基因区域比对，并以Tylodelphys aztecae作为外群。节点处的圆圈表示后验概率（上半部分）和自助法支持值（下半部分），根据上方角落的图例。分支长度表示每个位置的替换次数。新生成的序列以粗体显示。括号表示新生成序列的编号或来源国家（从GenBank检索的序列）。下载：下载高分辨率图像（622KB）下载：下载全尺寸图像图9. Ampullaceana balthica中的Diplostomum spp.（Diplostomidae）活尾蚴的显微照片。(A–B) 根据Blasco-Costa等人（2014年）定义的Diplostomum sp. Lineage 4（同义词D. petromyzifluviatilis）；(C–D) Diplostomum sp.血统6（根据Blasco-Costa等人，2014年的研究）：(A, C) 后尾蚴的总体视图，比例尺为100微米；(B, F) 身体细节，比例尺为50微米。3.1.5. Echinoparyphium（Echinostomatidae）用于评估Echinoparyphium物种多样性的最终比对基于32个部分ND1 Echinoparyphium序列构建，涵盖了七个物种（并添加了Echinostoma revolutum的直系同源物作为外群），涵盖了425个明确比对的核苷酸位置。两种系统发育分析（BI和ML）生成的树具有相同的拓扑结构，因此仅展示BI树，并附有后验概率和自助法支持值（图10）。所有收集的Echinoparyphium标本均被鉴定为E. recurvatum（图11A–B），并表现出轻微到显著的种内变异。从A. balthica中收集的两个标本（O65和A38）在遗传上与其他E. recurvatum个体不同，在系统发育分析中位于基部位置。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图10. 使用贝叶斯推断重建的32个Echinoparyphium物种的系统发育树。该树基于部分COI基因区域的425 bp比对，并以Echinostoma revolutum作为外群。节点处的圆圈表示后验概率（上半部分）和自助法支持值（下半部分），具体依据右上角的图例。分支长度代表每个位置的替换次数。新生成的序列以粗体显示。括号表示分离株编号（对于新生成的序列）或来源国家（对于从GenBank检索的序列）。下载：下载高分辨率图像（652KB）下载：下载全尺寸图像图11. Echinostomatidae和Notocotylidae科活后尾蚴的显微照片。(A–B) Echinoparyphium recurvatum ex Ampullaceana balthica；(C–D) Notocotylus ikutai ex Gyraulus acronicus。(A, C) 后尾蚴的总体视图，比例尺为100微米；(B, F) 身体细节，比例尺为50微米。3.1.6. 用于评估Notocotylidae物种多样性的最终比对基于50个部分COI Notocotylus、Pseudonotocotylus和Pseudocatatropis序列构建（根据Izrailskaia等人，2024年的研究），涵盖了六个物种/谱系（并添加了Hippocreppis hippocreppis的直系同源物作为外群），涵盖了723个明确比对的核苷酸位置。两种系统发育分析（BI和ML）生成的树具有相同的拓扑结构，因此仅展示BI树，并附有后验概率和自助法支持值（图12）。大多数经过分子分析的Notocotylus标本被鉴定为N. ikutai（图11C–D）。只有两个标本，一个来自A. balthica，另一个来自G. acronicus，被认定为两个系统发育上不同的物种，分别标记为Notocotylus sp. 1和Notocotylus sp. 2（表2；后尾蚴的显微照片不可用）。由于GenBank中缺乏具有正确物种鉴定的Notocotylid直系同源序列，进一步确定物种受到了限制。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图12. 使用贝叶斯推断重建的31个Notocotylid分类单元的系统发育树。该树基于部分COI基因区域的793 bp比对，并以Hippocrepis hippocrepis作为外群。节点处的圆圈表示后验概率（上半部分）和自助法支持值（下半部分），具体依据右上角的图例。分支长度代表每个位置的替换次数。新生成的序列以粗体显示。括号表示分离株编号（对于新生成的序列）或来源国家（对于从GenBank检索的序列）。3.2. 不同调查中吸虫物种丰富度和组成的比较与2012-2013年进行的分子调查（Soldánová等人，2017年）相比，Takvatn湖中的吸虫多样性在科水平上基本一致（图13，表2）。Soldánová等人（2017年）报告了来自七个科的24种吸虫物种或物种级别的遗传谱系，这些物种存在于多种节肢动物中间宿主和鱼类脊椎动物宿主体内。然而，四个分类单元（Apatemon sp.、Diplostomum sp. Lineage 3、Diplostomum sp. Lineage 5和Tylodelphys sp.）并未在软体动物中直接观察到，但根据生命周期证据推断它们使用A. balthica作为必需的第一个中间宿主（表2）。此外，两个allocreadiid分类单元（Allocreadium neotenicum和Crepidostomum sp. 2）在早期调查中缺乏特定的软体动物宿主分配（表2）。然而，这些物种很可能使用湖中仅有的两种小型球壳蛤作为第一个中间宿主，这与其他allocreadiid物种的证据（Soldánová等人，2017年）以及欧洲已发表的生命周期数据（Petkevi?iūt?等人，2023年）一致。应用这些标准并排除Valvata sp.中唯一未解决的strigeid后，两次调查均包含24个与软体动物相关的分类单元，从而可以进行物种丰富度的时间比较（图13，表2），尽管这种等同性部分受到研究间推断或排除方法差异的影响。下载：下载高分辨率图像（304KB）下载：下载全尺寸图像图13. 2012-2013年（Soldánová等人，2017年）和2024年（本研究）在Takvatn湖记录的分子鉴定吸虫的时间比较的图形解释，基于可用记录显示了两次调查之间物种组成的明显差异。图中棕色显示的分类单元根据生命周期证据在早期调查中被推断使用软体动物作为第一个中间宿主，而其余分类单元直接在软体动物中观察到。来自腹足类Valvata sp.的Strigeidae属物种（本研究）未包含在图中（但见表2），因为其分子身份和其他检测到的分类单元的差异无法确认。尽管总体丰富度相当，但两次调查之间的物种组成存在差异（图13，表2）。有15个分类单元是共有的，占Soldánová等人（2017年）先前在软体动物中报告的吸虫群的63%。其余的多样性反映了两次调查之间的相互更替：2012-2013年记录的九个分类单元在2024年未被检测到，相反，本研究新检测到的九个不同分类单元在早期调查中缺失（图13，表2）。六个新记录的分类单元代表科学上的新物种谱系（Kibet等人，正在审稿中；本研究）。然而，这种表面上的物种丰富度等同性（24 vs 24个分类单元）应谨慎解释。在A. balthica中，五个先前报告的分类单元在2024年未被重新发现，包括Diplostomum phoxini、Diplostomum Lineage 3和5、Tylodelphys sp.以及Apatemon sp.，尽管这些分类单元在之前的研究中是推断出来的而不是直接观察到的（Soldánová等人，2017年）。相反，新记录的分类单元包括Notocotylus sp. 1（本研究）和Schistosomatidae属物种XXII（Kibet等人，正在审稿中），而大多数plagiorchiid谱系在两次调查中都存在，仅增加了一个谱系（Plagiorchis sp. 11）（图13，表2）。在G. acronicus中，Soldánová等人（2017年）的调查中没有记录到该物种作为第一个中间宿主的感染，而在2024年检测到了六个谱系（两个schistosomatids、三个strigeids和一个notocotylid）（表2）。此外，Cotylurus cornutus的后尾蚴在本研究中的流行率显著更高（73个受感染的个体；701个检查的蜗牛中的10.4%；表1），而在早期调查中仅观察到两个受感染的个体（0.6%；Soldánová等人，2017年）。4. 讨论本研究展示了Takvatn湖水生蜗牛中双生吸虫的高分子多样性，共记录了24个物种（包括四个鸟类血吸虫分类单元，其中两个是潜在的新遗传谱系，可能代表科学上的新物种或缺乏分子数据的已知物种（Kibet等人，正在审稿中），这是在一个亚北极淡水系统中发现的。结合Soldánová等人（2017年）的先前发现，这相当于在这次亚北极系统中两次调查中记录的吸虫分类单元总数达到33个，其中包括仅在早期调查中记录而在本材料中未再发现的九个物种或物种级别的谱系（图13）。然而，这一综合估计反映了两次独立调查的累积观察结果，而不是单一时间点的结果。尽管如此，这种相对较高的吸虫物种丰富度挑战了寄生虫多样性随纬度升高而减少的普遍假设（Rohde，1992年），并突显了亚北极生态系统支持复杂多宿主寄生虫组合的能力。尽管无冰季节相对较短、温度较低以及北部生态系统的宿主群落简单，Takvatn湖中的吸虫群落与更温带的淡水系统中的吸虫群落相当，尽管由于采样努力、空间规模、宿主组成和检测方法的不同，这种比较应谨慎解释。例如，对丹麦21个淡水湖泊的吸虫进行的分子调查显示，在多种蜗牛宿主体内发现了22种吸虫（Duan等人，2021年）；在鲁尔河流域的五个人工湖泊中检测到36种吸虫（Selbach等人，2020年）；在阿尔伯塔省的六个湖泊中鉴定出79种吸虫（Gordy等人，2020年），表明北部湖泊生态系统中也存在高寄生虫多样性。类似的多样化吸虫组合也在中欧淡水保护区湖泊和温带水库系统中发现（40种；Schwelm等人，2021年），表明丰富的吸虫群落并不限于较低纬度。与这些多湖泊的温带调查相比，本研究中吸虫物种的丰富度来自一个单一湖泊，该湖泊的软体动物群落较为贫乏，主要由Ampullaceana balthica组成，它单独容纳了71%的吸虫分类单元（24种中的17种）。因此，高寄生虫多样性并不一定需要高软体动物多样性或大规模的空间采样。即使是一个亚北极湖泊，只要有合适的丰富中间宿主存在，也能维持丰富的吸虫组合，这表明宿主的可用性而非纬度本身可能塑造了北部和亚北极淡水生态系统中的吸虫多样性模式。本研究是对Soldánová等人（2017年）调查十多年后的直接跟进，该调查报告了Takvatn湖中与软体动物宿主相关的24种吸虫物种或物种级别的谱系。我们的结果也揭示了24种吸虫分类单元，尽管总体物种丰富度在两次调查之间保持相当，但群落组成在物种或谱系水平上发生了明显变化。大约三分之一的先前记录的分类单元未被检测到（一些仅在早期调查中来自非软体动物宿主），同时出现了类似数量的新谱系，表明存在显著的时间更替，而不是物种数量的净增加或减少。这些明显的损失和增加应谨慎解释，因为它们可能部分反映了生命周期采样的不完全性以及两次调查之间检测概率和采样努力的差异。此外，还应考虑两次调查之间纳入标准的小差异。本研究采用了一种快照重采样方法，提供了使用可比的采样设计和宿主覆盖范围直接比较十年时间尺度上寄生虫群落组成的罕见机会。鉴于关于寄生虫多样性的时间可比数据集的普遍稀缺，此类重复研究对于区分自然系统中的群落稳定性和物种更替至关重要（Hammoud等人，2025年）。与物种/谱系级别的比较相比，所有吸虫科在两次调查中都持续存在，表明尽管个别谱系被替换，但较高的分类结构在长期上保持稳定。Takvatn湖的吸虫群落主要由鸟类传播的物种主导（只有Crepidostomum metoecus使用鱼类作为最终宿主；Soldánová等人，2017年），最终鸟类宿主的存在、丰度或迁徙模式的变化可能强烈影响在特定时期检测到的谱系。湖泊中的调查记录了21种水鸟，包括12种繁殖物种，形成了一个相对稳定的核心群落，而其他物种作为短暂访客出现（Klemetsen & Knudsen，2013年）。这种常驻和短暂鸟类物种的结合，加上Takvatn湖靠近主要沿海鸟类区域（如Balsfjord，约20公里），可能增加了潜在最终宿主的多样性和时间更替。采样强度的差异、测序分离株的数量以及我们研究中幼虫阶段的更好检测也可能导致了观察到的更替。然而，通过应用类似的采样设计、栖息地和季节覆盖范围，并专注于Soldánová等人（2017年）之前的相同主要软体动物宿主，这些差异被最小化了，同时本研究中的采样努力更大（即A. balthica的1,589个个体对比667个个体，G. acronicus的701个个体对比326个个体）。采样工作因此反映了软体动物群落的自然组成，最常见的宿主被更密集地采样。尽管如此，对于较少见的宿主来说，采样工作存在一定的差异，这可能会影响稀有或低流行率吸虫类群的检测，但不太可能影响在关键蜗牛宿主物种中观察到的吸虫多样性总体模式。此外，如先前针对相应类群的研究中所采用的，通过扩增和分析同源基因组标记，我们能够以相当可靠的水平评估遗传（以及潜在的分类）多样性。宿主特异性模式进一步阐明了这些动态。Ampullaceana balthica仍然是湖泊系统中的主要传播中心，容纳了大多数类群。相比之下，G. acronicus在Soldánová（2017）的研究中作为第一中间宿主的重要性可以忽略不计，但在本研究中它容纳了属于多个吸虫科的类群，并且表现出明显更高的后尾蚴发生率，这可能部分反映了与早期调查相比检查的个体数量更多。稀释分析表明，与A. balthica相关的吸虫多样性几乎被完全采样，而尽管检查的G. acronicus个体数量相对较多，但其采样仍然不完整。因此，利用G. acronicus的吸虫多样性可能仍然被低估了，这可能反映了较低的感染率和在这种宿主体内较低的检测概率。尽管如此，Takvatn湖中的物种丰富度不太可能是采样强度的假象，而可能代表了一个保守的估计。这些结果进一步表明，即使总体多样性保持不变，这两种关键蜗牛物种在传播网络中的功能角色也会随时间变化。总体而言，亚北极湖泊中的吸虫组合在时间上是动态的，但在结构上是持续的，群落模式主要由物种更替（明显的损失和增加）而不是总体多样性的变化所主导，并且受到宿主可用性的强烈影响，特别是最终鸟类宿主。这一模式由Plagiorchis属的物种所说明。先前的研究在Takvatn湖的A. balthica中发现了七种Plagiorchis物种（Soldánová等人，2017年），十年后再次检测到了所有这七种，并增加了Plagiorchis sp. 11。Kundid（2024年）最近从中欧的Ampullaceana lagotis中描述了这一谱系。尽管它代表了一个新识别的Plagiorchis谱系，但其分布范围和潜在的扩散模式与高度移动的最终宿主有关（Kundid等人，2024年）。在Plagiorchis属中，这些通常是高等脊椎动物（Krasnolobova 1987；Tkach，2008）。在这种情况下，可以推测Plagiorchis sp. 11是由迁徙鸟类（如鸭科或鹬科）引入亚北极湖泊的，这些鸟类已知在Takvatn筑巢和繁殖（Klemetsen和Knudsen，2013年），或者相反，是由这些宿主从较高纬度地区迁移到中欧的。这一推测还得到了某些迁徙鸟类物种在两个中欧湖泊和Takvatn湖中作为Plagiorchis spp.潜在宿主的发现的支持（例如，鹬科；Klemetsen和Knudsen，2013年；Kundid等人，2024年）。然而，Plagiorchis sp. 11仅在三个A. balthica蜗牛中被记录到，由于其生命周期尚未完全描述，目前尚不能确定这种吸虫是最近引入湖泊的，还是由于其在该宿主体内的低流行率而被忽视的。如果这种物种确实仅与暂时存在的迁徙鸟类相关，那么由于最终宿主的可用性有限，它可能无法完成其生命周期（Galaktionov等人，2019年）。大多数其他Plagiorchis物种（Plagiorchis sp. 4除外）也在其他北欧国家（芬兰、冰岛和爱尔兰）被报道过，其尾蚴的形态由Kudlai等人（2021年）描述。因此，我们的研究提供了Plagiorchis sp. 4尾蚴形态的首个证据。我们的结果首次证明，Takvatn湖中唯一存在的扁卷螺G. acronicus是几种Apatemon类群的可感中间宿主。尽管扁卷螺在其他北欧国家（例如芬兰、冰岛和立陶宛；Faltynková等人，2023年）被认为是Apatemon的常见宿主，但它们之前尚未被报道为该湖泊中任何吸虫物种的第一中间宿主（Soldánová等人，2017年）。与A. balthica相比，只有少量的G. acronicus蜗牛感染了吸虫（701个检查个体中的2.3%），尽管如此，这一比例仍高于Soldánová等人（2017年）的早期调查结果，并且与该宿主体内相对较高的后尾蚴发生率（10.4%）形成对比。与Plagiorchis类似，2024年检测到的Apatemon多样性高于之前（Soldánová等人，2017年），包括一个与早期研究一致的物种（A. gracilis）和三个新的物种。其中两个新检测到的类群（即Apatemon sp. 6和Apatemon sp. T1）与其同种个体相比仅表现出轻微的种内遗传变异。不幸的是，Apatemon sp. T2仅由一个标本代表，因此无法评估种内变异。这三个物种形成了一个得到良好支持的单系群，尽管它们的关系尚未完全确定。然而，种间遗传差异是明显的（Apatemon sp. T1和Apatemon sp. T2之间约为2%，这两个物种与Apatemon sp. 6之间约为4%（729-bp长的COI序列）。物种的独特性还得到了不同尾蚴形态的支持。Apatemon sp. T1具有细长的圆柱形身体，尾部茎明显增大，而Apatemon sp. T2则明显呈梨形，较短，尾部茎呈球状，尾叉较长。后者还表现出明显的橙色中体质量和一个带有星状表皮结构的暗色后部质量。相比之下，Apatemon sp. T1更为透明，缺乏明显的后部尾部结构，并且前部器官上有可见的棘刺（未显示）。Apatemon属内的系统学问题仍然存在。成虫阶段在形态上高度一致，分子数据仍然不完整，特别是代表所有假定类群的同源序列集不完整，阻碍了可靠的系统发育重建（Blasco-Costa等人，2016年；Faltynková等人，2023年）。此外，一些物种（即Apatemon sp. 1、sp. 2、sp. 3和sp. 4）仅通过序列数据来表征（Locke等人，2010年），而其他物种则包括限于尾蚴阶段的形态信息（即Apatemon sp. 5和sp. 6；Faltynková等人，2023年）。尽管COI是一种在动物分子系统学中广泛使用的高度可变蛋白质编码基因（Avise，2000年），但依赖单一标记可能会夸大物种界定，系统发育关系可能会根据分析的基因而有所不同（Blasco-Costa等人，2016年；Soldánová等人，2017年；Faltynková等人，2023年）。正如Bray等人（2022年）所强调的，尽管分子数据是客观的，但关于物种边界的解释本质上是主观的，特别是当基于分子的系统发育分析可能因使用的遗传标记不同而产生不同的拓扑结构时（例如在Apatemon中的例子，Blasco-Costa等人，2016年；Faltynková等人，2023年）。因此，物种界定阈值仍然不确定，通常使用线粒体COI区域来进行物种划分（Blasco-Costa等人，2016年；Soldánová等人，2017年；Faltynková等人，2023年）。这一分类问题在我们的数据中也很明显：Apatemon sp. T1和Apatemon sp. T2在系统发育上与Apatemon sp. 6密切相关（ITS区域相似度为100%，COI相似度超过96%），但它们的形态表明它们是不同的物种。确认需要额外的分子标记和成虫形态的检查，后者在吸虫分类学中提供了关键的诊断特征（Gibson等人，2002年；Cribb等人，2025年）。由于Soldánová等人（2017年）使用的同源基因组区域未能成功扩增，因此无法测试这两种类群Apatemon sp. T1和Apatemon sp. T2是否之前曾在Takvatn湖中被报道过。尽管如此，至少有两种检测到的物种是首次在Takvatn湖中被报道。鉴于它们的低流行率，它们可能在之前的调查中被忽视了（尽管本研究检查的G. acronicus标本数量大约是Soldánová等人（2017年）的两倍），或者是由作为Apatemon物种最终宿主的迁徙鸟类引入的（例如，Dubois 1968年；Blasco-Costa等人，2016年；Presswell，2022年），这与上述Plagiorchis的情况类似。如果这种物种确实仅与暂时存在的迁徙鸟类相关，那么由于最终宿主的可用性有限，它可能无法完成其生命周期（Galaktionov等人，2019年）。大多数其他Plagiorchis物种（Plagiorchis sp. 4除外）也在其他北欧国家（芬兰、冰岛和爱尔兰）被报道过，其尾蚴的形态由Kudlai等人（2021年）描述。因此，我们的研究提供了Plagiorchis sp. 4尾蚴形态的首个证据。我们的结果首次证明，Takvatn湖中唯一存在的扁卷螺G. acronicus是几种Apatemon类群的可感中间宿主。尽管扁卷螺在其他北欧国家（例如芬兰、冰岛和立陶宛；Faltynková等人，2023年）被认为是Apatemon的常见宿主，但它们之前尚未被报道为该湖泊中任何吸虫物种的第一中间宿主（Soldánová等人，2017年）。与A. balthica相比，只有少量的G. acronicus蜗牛感染了吸虫（701个检查个体中的2.3%），尽管如此，这一比例仍高于Soldánová等人（2017年）的早期调查结果，并与该宿主体内相对较高的后尾蚴发生率（10.4%）形成对比。与Plagiorchis类似，2024年检测到的Apatemon多样性高于之前（Soldánová等人，2017年），包括一个与早期研究一致的物种（A. gracilis）和三个新的物种。其中两个新检测到的类群（即Apatemon sp. 6和Apatemon sp. T1）与其同种个体相比仅表现出轻微的种内遗传变异。不幸的是，Apatemon sp. T2仅由一个标本代表，因此无法评估种内变异。这三个物种形成了一个得到良好支持的单系群，尽管它们的关系尚未完全确定。然而，种间遗传差异是明显的（Apatemon sp. T1和Apatemon sp. T2之间约为2%，这两个物种与Apatemon sp. 6之间约为4%（729-bp长的COI序列）。物种的独特性还得到了不同尾蚴形态的支持。Apatemon sp. T1具有细长的圆柱形身体，尾部茎明显增大，而Apatemon sp. T2明显呈梨形，较短，尾部茎呈球状，尾叉较长。后者还表现出明显的橙色中体质量和一个带有星状表皮结构的暗色后部质量。相比之下，Apatemon sp. T1更为透明，缺乏明显的后部尾部结构，并且前部器官上有可见的棘刺（未显示）。Apatemon属内的系统学问题仍然存在。成虫阶段在形态上高度一致，分子数据仍然不完整，特别是代表所有假定类群的同源序列集不完整，阻碍了可靠的系统发育重建（Blasco-Costa等人，2016年；Faltynková等人，2023年）。此外，一些物种（即Apatemon sp. 1、sp. 2、sp. 3和sp. 4）仅通过序列数据来表征（Locke等人，2010年），而其他物种包括限于尾蚴阶段的形态信息（即Apatemon sp. 5和sp. 6；Faltynková等人，2023年）。尽管COI是一种在动物分子系统学中广泛使用的可变蛋白质编码基因（Avise，2000年），但依赖单一标记可能会夸大物种界定，系统发育关系可能会根据分析的基因而有所不同（Blasco-Costa等人，2016年；Soldánová等人，2017年；Faltynková等人，2023年）。正如Bray等人（2022年）所强调的，尽管分子数据是客观的，但关于物种边界的解释本质上是主观的，特别是当基于分子的系统发育分析可能因使用的遗传标记不同而产生不同的拓扑结构时（例如在Apatemon中的例子，Blasco-Costa等人，2016年；Faltynková等人，2023年）。因此，物种界定阈值仍然不确定，通常使用线粒体COI区域来进行物种划分（Blasco-Costa等人，2016年；Soldánová等人，2017年；Faltynková等人，2023年）。这一分类问题在我们的数据中也很明显：Apatemon sp. T1和Apatemon sp. T2在系统发育上与Apatemon sp. 6密切相关（ITS区域相似度为100%，COI相似度超过96%），但它们的形态表明它们是不同的物种。确认需要额外的分子标记和成虫形态的检查，后者在吸虫分类学中提供了关键的诊断特征（Gibson等人，2002年；Cribb等人，2025年）。由于Soldánová等人（2017年）使用的同源基因组区域未能成功扩增，因此无法测试这两种类群Apatemon sp. T1和Apatemon sp. T2是否之前曾在Takvatn湖中被报道过。尽管如此，至少有两种检测到的物种是首次在Takvatn湖中被报道。鉴于它们的低流行率，它们可能在之前的调查中被忽视了（尽管本研究检查的G. acronicus标本数量大约是Soldánová等人（2017年）的两倍），或者是由作为Apatemon物种最终宿主的迁徙鸟类引入的（例如，Dubois 1968年；Blasco-Costa等人，2016年；Presswell，2022年），这与上述Plagiorchis的情况类似。在最近引入的情况下，Takvatn湖中这些新的吸虫发现可能表明最终鸟类宿主的频率更高或新的迁移模式。在本研究中，鉴定出一种Cotylurus物种C. cornutus，表现出明显的种内遗传变异。在Echinoparyphium recurvatum中也观察到了类似的模式，这两种类群都利用软体动物作为第一和第二中间宿主。在先前研究中已经报道了Cotylurus物种内部明显的线粒体结构，各种单系遗传变异后来被解释为同种，即在我们的研究中，所有收集的标本都属于C. cornutus（Pyrka等人，2022年；Stanevi?iūt?等人，2025年）。在棘口吸虫科中也有类似的显著种内线粒体变异，包括E. recurvatum，其中线粒体基因序列的差异反映了种群级别的结构而不是物种级别的分化（Saijuntha等人，2011a,b；Georgieva等人，2014年；Pantoja等人，2021年）。因此，在缺乏一致的形态或宿主相关差异的情况下，我们在C. cornutus和E. recurvatum材料中观察到的遗传多样性很可能代表了种内种群结构而不是隐秘物种形成。Diplostomum属的类群数量比之前的调查少。Soldánová等人（2017）报告了五种与A. balthica相关的类群，包括一个已描述的物种和四个遗传谱系，后者最初由Blasco-Costa等人（2014年）在冰岛描述，其尾蚴的形态描述由Faltynková等人（2014年）提供。在本研究中，只确认了两种，即Diplostomum谱系6和谱系4，后者根据最近的分子修订目前被认定为D. petromyzifluviatilis（Lebedeva等人，2022年）。谱系3和5之前仅在鱼类中作为后尾蚴被检测到，A. balthica被推断为第一中间宿主，但在我们的材料中没有发现。由于这些类群从未在蜗牛中直接观察到，并且在早期研究中可能以低流行率出现，因此在不检查鱼类宿主的情况下无法验证它们的当前存在。D. phoxini物种也未被检测到，可能在之前的调查中是偶然出现的，因为其生命周期通常涉及鲤科第二中间宿主（特别是特定宿主Phoxinus phoxinus）（D?nges，1969年），而这些宿主在Takvatn湖中不存在（Amundsen等人，2009年）。这些发现表明，Diplostomum物种在湖泊中的出现可能受到适宜鱼类宿主的可用性的限制，而不是由于缺乏合适的蜗牛宿主。本研究共记录了三种Notocotylid类群，其中N. ikutai最为普遍，并表现出显著的遗传变异（从11个测序标本中记录了七种不同的COI单倍型）。这种物种在Soldánová等人（2017年）的早期调查中也在A. balthica中被记录到，但当时仅被识别为Notocotylus sp.。随后，从寄生在Anas penelope中的成年标本中获得的Notocotylus的新序列使其被正式描述为N. ikutai（Sasaki等人，2021年）。其他两种物种各自在一只蜗牛个体中被记录到：Notocotylus sp. 1在A. balthica中，Notocotylus sp. 2在G. acronicus中。这两种物种之前都未在Takvatn湖中被记录到，鉴于它们的非常低流行率，它们可能被忽视了，或者只是最近引入湖泊的。根据Izrailskaia等人（2024年）对Notocotylus属的修订，Notocotylidae科包括15个属。尽管COI序列对于解决系统发育关系和物种界定是可靠的，但由于缺乏同属物种的同源序列，无法精确鉴定Notocotylus sp. 1和Notocotylus sp. 2。因此，鉴于它们的系统发育差异，这两个类群可能代表不同的Notocotylid属。Takvatn湖中的两种扁卷螺和两种扁卷螺都作为四种禽类血吸虫的第一中间宿主，其中两种在A. balthica中发现，两种在G. acronicus中发现。最普遍的是Trichobilharzia sp. VIII sensu Kibet等人（正在审阅中）（同义词Trichobilharzia franki haplotype “peregra”），在1,589只A. balthica蜗牛中记录到了28只（占1.8%）。尽管这一感染率略高于欧洲通常报告的禽类血吸虫感染率（通常<1%；Soldánová等人，2013年；Horák等人，2015年），但仍处于预期范围内，表明该物种在Takvatn湖中已经稳定存在。Soldánová等人（2017年）已经在A. balthica中检测到这种血吸虫，虽然它在欧洲广泛分布，但主要存在于北部地区，包括冰岛和挪威（Jouet等人，2010年；Kibet等人，正在审稿中）。此外，还发现了一个未被归类到已知物种的遗传谱系，即Kibet等人定义的Schistomatidae属未命名种（正在审稿中），该谱系之前由Aldhoun等人（2012年）在捷克共和国报告为Avian schistomatid sp. I6。只有两只G. acronicus蜗牛被感染，每只蜗牛携带不同的血吸虫物种，分别是Schistostomatidae属未命名种XXII和XXII，这代表了Takvatn湖的新动物区系记录（Kibet等人，正在审稿中）。禽类血吸虫依赖水禽作为终末宿主，而这些水禽在湖泊中数量众多且定期繁殖（Klemetsen和Knudsen，2013年），这可能有助于它们的持续存在和传播。因此，新发现的谱系可能是亚北极地区的特有物种，但由于鸟类传播的可能性，也不能排除它们在其他地区的存在。它们似乎主要分布在北部地区，这可能是因为检测概率较低，因为禽类血吸虫的感染率通常较低，而且调查很少针对小型扁卷螺类进行。

**结论**
本研究提供了Takvatn湖十年间的吸虫多样性快照重新采样结果，是少数对独特亚北极淡水系统中长期吸虫群落动态进行评估的研究之一。与Soldánová等人（2017年）的先前调查不同，我们的目标不是重建吸虫的生活周期，而是评估物种多样性的变化，重点关注第一中间宿主。结果表明，在多次调查中持续检测到了A. balthica中的大量吸虫，而大约三分之一的吸虫群落与十年前的评估结果有所不同。目前尚需验证这些变化是由于我们快照重新采样未能捕捉到的年度波动所致，还是反映了更长期的生态过程，例如迁徙鸟类宿主动态的变化。虽然仅从蜗牛中检测到幼虫阶段并不能证明生活周期的完成，但大多数谱系的反复出现表明它们在该系统中持续循环。这种相对稳定性与气候多变温带地区报告的更为动态的寄生虫组合形成对比，可能反映了适应亚北极环境中受限但可预测的传播窗口的特征（例如，Nikolaev等人，2020年、2021年、2023年）。重要的是，我们的结果还显示，之前在Soldánová（2017年）的研究中被认为作用较小的扁卷螺Gyraulus acronicus实际上是多种吸虫物种和谱系的有效第一中间宿主，并且既作为第一中间宿主也作为第二中间宿主参与传播途径。因此，它在整体寄生虫多样性中的贡献在早期研究中被低估了，应被视为湖泊传播网络的重要组成部分。尽管宿主群落有限，Takvatn湖支持的吸虫多样性仍然相对较高，与其他北部淡水系统（如冰岛；Faltynková等人，2025年）相当，突显了该湖泊作为寄生虫生物多样性库的生态重要性。未来的监测，特别是对较少见的软体动物宿主（如G. acronicus和Valvata sp.）的监测，对于更好地理解宿主特异性作用以及亚北极湖泊中吸虫群落动态和传播过程的长期模式和稳定性至关重要。

**作者贡献声明**
Camila Pantoja：撰写、审稿与编辑、调查
Christian Selbach：撰写、审稿与编辑、资源整理
Petra Kundid：撰写、审稿与编辑、可视化、调查
Miroslava Soldánová：撰写初稿、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学设计、调查、资金获取、概念构思
Michal Benovics：撰写初稿、可视化、方法学设计、调查、数据分析、数据管理、概念构思

**未引用参考文献**
Katoh, 2002; Matach等人, 2025; Pérez-Ponce de León, 2001; Saijuntha等人, 2011

**数据可用性声明**
本研究生成的序列已存入GenBank，访问编号见补充数据（补充表3[接受后将添加]。用于系统发育分析的对齐序列可向相应作者索取。

**财务支持**
本研究得到了捷克科学基金会（项目编号24-11738S）和捷克科学院生物学中心寄生虫学研究所（RVO 60077344）的支持。