GalNAc修饰五组分脂质纳米粒用于肝脏靶向递送p65 siRNA，通过靶向NF-κB减轻肝损伤中的细胞因子风暴

《Journal of Materials Chemistry B》：GalNAc-modified five-component lipid nanoparticles for liver-targeted delivery of p65 siRNA to alleviate cytokine storm in liver injury via NF-κB targeting

摘要 急性肝损伤（ALI）常引发全身性细胞因子风暴，其中NF-κB亚基p65在肝细胞炎症进展中起核心作用。递送p65 siRNA至肝细胞可有效抑制细胞炎症和凋亡。然而，siRNA本身不稳定且缺乏组织特异性。脂质纳米粒（LNPs）作为一种成熟的递送系统具有固有的肝脏趋向性，但其靶向效率仍欠佳。为增强肝细胞特异性递送，研究人员开发了一种半乳糖-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）修饰的五组分脂质纳米粒（G-LNP），用于p65 siRNA的肝脏靶向递送。GalNAc修饰通过去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）介导的内存作用实现主动靶向，从而改善肝脏蓄积和细胞内化。优化后的G-LNP制剂（1% DSPE–PEG2000–GalNAc）粒径为87 nm，多分散指数（PDI）低，包封效率高。在体外实验中，G-LNP–siP65以ASGPR依赖的方式显著增强AML-12肝细胞的转染效率，下调p65 mRNA表达，减轻CCl4诱导的氧化应激（增加SOD、降低MDA），并减少促炎细胞因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）的释放。体内生物发光成像证实，与未修饰的LNP相比，G-LNP–Luc在肝脏中的蓄积更优且更持久。此外，在CCl4诱导的ALI小鼠模型中，G-LNP–siP65处理显著降低血清ALT/AST水平，恢复氧化还原平衡，并抑制肝脏NF-κB表达，从而明显改善组织病理学损伤。系统安全性评估显示，其溶血活性可忽略不计，血液学参数良好，表现为中性粒细胞百分比降低和血清CRP水平下降。综上，GalNAc修饰的五组分脂质纳米粒为p65 siRNA递送提供了一个强效、安全的肝脏靶向平台，通过NF-κB沉默有效减轻细胞因子风暴和肝损伤。该策略有望为基于核酸的急性及慢性肝病治疗提供新途径。

研究背景与问题

急性肝损伤（ALI）是临床常见的危重病症，其发病过程中常伴随全身性细胞因子风暴，导致多器官功能障碍甚至死亡。核因子κB（NF-κB）信号通路，特别是其亚基p65，是连接肝损伤信号与炎症反应的核心转录因子，在驱动肝细胞炎症进展中扮演关键角色。靶向沉默p65基因表达，理论上可有效抑制炎症级联反应，从而缓解肝损伤。然而，小干扰RNA（siRNA）作为治疗性核酸药物，存在体内不稳定、易被降解、缺乏组织靶向性及难以主动进入细胞等固有缺陷，限制了其临床应用。

脂质纳米粒（LNP）是当前最为成熟的核酸药物递送系统，已成功应用于COVID-19 mRNA疫苗等产品。LNP虽具有天然的肝脏趋向性，但其靶向效率主要依赖于被动脉冲机制，即通过载脂蛋白E（ApoE）吸附后与肝细胞低密度脂蛋白受体（LDLR）结合，效率仍有待提升。为克服这一局限，主动靶向策略成为研究重点。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是C型凝集素受体，在肝细胞膜上高表达，能特异性、高亲和力地结合半乳糖及其衍生物。其中，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）因其C2位羟基的乙酰化修饰，展现出比半乳糖更强的ASGPR结合能力，已被多个已上市或进入临床的siRNA药物（如Givlaari）验证为高效的肝脏靶向配体。

基于此，研究人员提出科学假设：将GalNAc配体整合到LNP系统中，构建GalNAc修饰的五组分脂质纳米粒（G-LNP），有望通过ASGPR介导的主动靶向作用，显著提高p65 siRNA在肝脏的富集效率和肝细胞的摄取率，从而实现更高效的NF-κB基因沉默，最终在ALI模型中有效缓解细胞因子风暴和组织损伤。这项研究旨在验证该靶向递送系统的构建、表征、靶向效率、治疗效能及安全性，为肝病核酸治疗提供新的平台策略。本研究发表在材料化学领域的知名期刊《Journal of Materials Chemistry B》上。

关键技术方法概述

为开展此项研究，研究人员首先通过碱（KOH）催化脱乙酰反应合成了靶向配体GalNAc(tri)–PEG₂₀₀₀–DSPE，并通过核磁共振氢谱（¹H NMR）验证其结构。随后，采用微流控混合技术制备了一系列不同GalNAc配体摩尔比例（0.1%, 0.5%, 1%, 2%）的五组分LNP，核心组分包括可离子化脂质DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇、DMG–PEG₂₀₀₀及上述GalNAc配体。通过动态光散射（DLS）表征粒径、PDI和Zeta电位，透射电镜（TEM）观察形貌，并使用RiboGreen试剂盒测定包封率，以筛选最优配方。体外研究使用小鼠肝细胞系AML-12，通过荧光素酶报告基因实验评估转染效率，并利用ASGPR竞争性抑制剂（去唾液酸胎球蛋白或游离GalNAc）验证靶向机制。通过CCl₄刺激建立肝细胞损伤模型，使用CCK-8法检测细胞活力，qRT-PCR检测p65 mRNA表达，并测定氧化应激标志物（MDA、SOD）和促炎细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）。体内研究使用雌性BALB/c小鼠，通过腹腔注射CCl₄建立急性肝损伤模型，并随机分为对照组、模型组、LNP–siP65治疗组和G-LNP–siP65治疗组。通过尾静脉注射负载荧光素酶mRNA的LNP进行活体生物发光成像，评估纳米粒的体内分布。治疗结束后，采集血清检测肝功能指标（ALT、AST）、氧化应激和炎症因子，并取肝组织进行苏木精-伊红（H&E）染色病理学评估和NF-κB mRNA表达分析。安全性方面，进行了体外兔红细胞溶血实验，并分析了治疗组小鼠的血液学参数和血清C反应蛋白（CRP）水平。所有动物实验均遵循广西医科大学动物护理与福利委员会的指导原则并获得批准。

研究结果

3.1 GalNAc-LNPs的制备与表征

研究人员成功合成了DSPE–PEG₂₀₀₀–GalNAc(tri)配体，并通过¹H NMR证实了乙酰保护基的成功脱除。通过微流控技术制备了不同配体比例的LNP，表征结果显示，所有配方粒径在78-116 nm之间，PDI低于0.2，包封率高于89%。其中，含有1% GalNAc配体的配方（G-LNP–Luc3）在粒径（约87 nm）、单分散性和荧光素酶mRNA转染效率方面达到最佳平衡，因此被选为后续研究的优化配方（G-LNP）。

3.2 GalNAc修饰LNPs在细胞摄取和肝靶向分布中的作用

细胞毒性实验表明，在治疗剂量范围内，G-LNP对AML-12细胞无显著毒性。荧光素酶报告实验显示，在多个浓度下，G-LNP–Luc的转染效率均显著高于未修饰的LNP–Luc，最高提升达2.8倍。生物信息学分析表明，在急性肝损伤模型中，ASGPR的关键亚基Asgr1和Asgr2的mRNA表达保持稳定，为靶向策略提供了可行性。更重要的是，使用ASGPR竞争性抑制剂预处理细胞后，G-LNP–Luc的转染效率被显著抑制，而未修饰LNP不受影响，直接证明了GalNAc修饰通过ASGPR途径增强肝细胞靶向和内存作用。

3.3 p65 siRNA介导的损伤肝细胞炎症减轻

研究人员制备了负载p65 siRNA的LNP（LNP–siP65）和G-LNP（G-LNP–siP65），两者均具有良好的理化性质。在CCl₄损伤的AML-12细胞模型中，G-LNP–siP65处理能更有效地提高细胞活力，下调p65 mRNA表达。同时，与LNP–siP65相比，G-LNP–siP65能更显著地提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，并更有效地减少促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的释放。这表明G-LNP通过高效递送siP65，在抑制NF-κB通路的关键节点上，同时调控了氧化应激和炎症反应两大病理过程。

3.4 GalNAc修饰LNPs在体内的肝靶向分布作用

体内生物分布实验通过活体成像清晰显示，尾静脉注射后，负载荧光素酶mRNA的G-LNP–Luc在肝脏区域的生物发光信号强度显著高于未修饰的LNP–Luc，且信号维持更持久。离体器官成像进一步证实，G-LNP–Luc在注射后1小时和8小时均主要在肝脏富集，在其他主要器官（脾、心、肺、肾）中信号微弱。定量分析表明，G-LNP在肝脏的蓄积量显著高于未修饰LNP，明确验证了GalNAc修饰显著增强了LNP的肝脏靶向富集和滞留能力。

3.5 体外溶血和体内安全性评估

溶血实验表明，在治疗浓度下，LNP–siP65和G-LNP–siP65的溶血率均低于3%，与阴性对照相当，表明其无溶血活性。在ALI小鼠模型中，与模型组相比，G-LNP–siP65治疗能更显著地降低血清C反应蛋白（CRP）水平。血液学分析显示，G-LNP–siP65能更有效地将模型组升高的中性粒细胞百分比和计数恢复至接近正常水平，同时对红细胞计数、血细胞比容和血红蛋白等参数无不良影响。这些结果综合表明，GalNAc修饰的LNP具有良好的血液相容性，并能减轻系统炎症反应。

3.6 GalNAc-LNPs递送p65 siRNA在急性肝损伤模型中的体内疗效

在CCl₄诱导的ALI小鼠模型中，G-LNP–siP65展现出卓越的治疗效果。在改善肝功能方面，其降低血清ALT和AST水平的效果优于LNP–siP65。在调节氧化还原平衡方面，G-LNP–siP65能更有效地恢复肝脏SOD活性，降低MDA含量。在抑制炎症反应方面，G-LNP–siP65对促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的降低幅度也大于LNP–siP65。这些体内疗效与G-LNP卓越的肝靶向递送效率直接相关。

3.7 ALI小鼠肝组织病理学及分子分析

肝组织H&E染色显示，模型组肝脏结构紊乱，肝细胞肿胀、空泡化，炎症细胞浸润严重。G-LNP–siP65治疗能最有效地改善这些病理损伤，降低组织学损伤评分。分子水平上，qRT-PCR证实G-LNP–siP65能更有效地抑制肝组织中NF-κB的mRNA表达。同时，肝组织匀浆检测也证实，G-LNP–siP65在提升组织SOD活性、降低MDA及促炎细胞因子水平方面，疗效均优于未修饰的LNP–siP65。

讨论与结论总结

综合讨论部分，本研究通过多维度评估框架，系统阐述了G-LNP–siP65对抗急性肝损伤的多重保护机制。结果表明，该递送系统不仅能有效逆转组织病理损伤，还能显著抑制炎症反应、恢复氧化还原平衡，且展现出良好的生物安全性。这些发现为推进基于高效肝脏靶向递送系统的基因干预疗法提供了关键证据，进一步凸显了GalNAc-LNP平台在肝病靶向治疗中的独特优势和广阔转化前景。更广泛而言，本工作展示了一种通过合理设计增强核酸治疗特异性和效力的策略，为开发更有效、更具临床可行性的肝病靶向疗法开辟了道路。

研究结论（翻译自原文）

本研究通过整合的多层次评估框架，系统阐明了G-LNP–siP65对抗急性肝损伤的多维保护机制。实验结果表明，该递送系统不仅在组织病理学层面有效逆转了肝损伤，还显著抑制了炎症反应并恢复了氧化还原平衡。此外，体外溶血实验和体内血液学参数均未显示异常，表明其具有良好的生物安全性。总而言之，这些发现为通过肝脏靶向递送系统推进高效的基因干预疗法提供了关键证据，进一步凸显了GalNAc-LNP平台在肝病靶向治疗中的显著优势和广泛转化潜力。更广泛地看，这项工作例证了一种合理的策略设计，以增强核酸治疗的特异性和疗效，为开发更有效、临床更可行的肝病靶向疗法开辟了途径。