菊苣（Cynara cardunculus）叶片中主要倍半萜内酯——西纳罗皮克林（cynaropicrin）的稳定性研究

《Pest Management Science》：Stability studies of cynaropicrin–major sesquiterpene lactone of Cynara cardunculus leaves

　　摘要

背景
刺山柑（Cynara cardunculus）叶片中的主要倍半萜内酯——刺山柑内酯（cynaropicrin）具有植物毒性，是可持续杂草管理的有希望的候选物质。然而，其在农业和土壤条件下的环境稳定性及其转化产物的生物活性仍知之甚少。本研究调查了其在高温（50°C）和不同pH值（5和8）下的稳定性，这些条件模拟了农业中的极端情况，以及其在土壤环境中的行为。

结果
刺山柑内酯在50°C和pH 5的条件下可稳定存在长达72小时，但在pH 8的条件下会显著降解，7天内浓度降低了80%。在碱性条件下，脱酰刺山柑内酯（deacylcynaropicrin）成为主要的降解产物。在土壤中，刺山柑内酯在7天内完全降解，产生了脱氢刺山柑内酯（dehydrocynaropicrin）和一种新的化合物4,15-二氢脱氢刺山柑内酯（4,15-dihydro-dehydrocynaropicrin）。生物测定表明，这两种降解产物对欧防风（P. oleracea）的植物毒性均高于刺山柑内酯本身。

结论
本研究首次强调了刺山柑内酯的稳定性，表征了其降解产物的结构及其植物毒性，揭示了环境因素和微生物的强烈影响。这些发现突显了其生态重要性和在可持续杂草控制方面的潜力。? 2026 作者。本文由John Wiley & Sons Ltd代表化学工业协会（Society of Chemical Industry）出版。

1 引言
杂草对全球农业构成了重大挑战，它们与作物竞争必需资源，降低产量，并导致巨大的经济损失。历史上，合成除草剂一直是杂草管理的主要手段。然而，它们的广泛使用引发了环境问题，包括土壤和水体污染以及抗除草剂杂草种类的出现。为了解决这些问题，化感作用作为一种可持续杂草控制的潜在方法引起了人们的兴趣。化感物质是天然存在的生物活性化合物，能够影响邻近植物的生长、存活和繁殖。这些物质作为天然防御机制，在植物毒性的背景下，可以对杂草具有选择性，同时提供比合成除草剂更环保的替代方案。与传统除草剂不同，化感物质会自然降解，从而减少长期生态影响。
化感物质在土壤中的有效性受多种环境和生物因素的影响，包括气候条件、土壤性质以及与微生物的相互作用。一旦释放到土壤中，这些化合物会经历保留、转化和运输过程，这些过程可能会改变它们的植物毒性。在许多情况下，微生物降解会导致化感物质活性的降低。Xiao等人（2020年）的研究表明，来自水稻（Oryza sativa L.）的酚类化合物最初抑制了生菜（Lactuca sativa L.）种子的萌发。然而，随着微生物活动的进行，这些化合物的抑制作用减弱了。相反，某些降解产物可能表现出比其母体化合物更强的生物活性。对苯并噁嗪类化合物（benzoxazinoids）的降解进行了广泛研究，包括2-O-葡萄糖基-4-羟基-(2H)-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮（DIBOA-Glc）、2,4-二羟基-(2H)-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮（DIBOA）和2,4-二羟基-7-甲氧基-(2H)-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮（DIMBOA），发现它们的转化产物如苯并噁唑啉-2-酮（benzoxazolin-2-one）、6-甲氧基苯并噁唑啉-2-酮（MBOA）、2-氨基苯氧嗪-3-酮（APO）和2-氨基-7-甲氧基苯氧嗪-3-酮（AMPO）具有更强的植物毒性。这些化合物的生物活性已针对多种植物物种进行了评估，包括小麦（Triticum aestivum L.）、洋葱（Allium cepa L.）、番茄（Lycopersicon esculentum Will.）、莴苣（Lactuca sativa L.）、黑麦草（Lolium rigidum L.）和野燕麦（Avena fatua L.）。其中，APO显示出最高的植物毒性潜力，这挑战了DIBOA和DIMBOA等苯并噁嗪类化合物是主要活性成分的假设。
倍半萜内酯是一类具有已知植物毒性的天然产物，使其成为可持续杂草管理的有希望的候选物质。这些化合物主要存在于菊科植物中，特别是在刺山柑（Cynara cardunculus）中，其含量很高。在刺山柑叶片中，倍半萜内酯占干重的94.5%，其中刺山柑内酯是主要成分（87.5%）。我们研究团队之前的研究已经报道了刺山柑叶片中倍半萜内酯的植物毒性，无论是纯化形式还是作为粗提物的一部分，都显示了它们对多种杂草的有效性。我们的先前研究评估了刺山柑叶片提取物中富含的倍半萜内酯对欧防风（P. oleracea）的植物毒性作用机制，并提出了在水培条件下的作用模式。据我们所知，目前尚无关于这些化合物在土壤基质中转化过程及其降解产物植物毒性的文献。为了填补这一知识空白，本研究调查了刺山柑内酯在非生物因素（特别是温度和pH值）下的化学稳定性及其在土壤中的转化情况。鉴于刺山柑内酯是刺山柑叶片中的主要倍半萜内酯，分析了其降解谱，并鉴定了相应的转化产物。此外，还评估了标准农业土壤对刺山柑内酯降解的直接影响。通过小麦胚芽鞘生物测定和对常见杂草欧防风的测试，评估了这些降解产物的植物毒性，从而阐明了土壤介导的转化对刺山柑内酯应用潜力的影响。本研究首次鉴定出脱氢刺山柑内酯和4,15-二氢脱氢刺山柑内酯作为降解产物，后者是文献中首次报道的新化合物，并全面比较了刺山柑内酯及其降解产物的植物毒性。这些发现对于理解刺山柑的化感潜力以及基于其生物活性化合物开发生物除草剂具有重要意义。

2 材料与方法
2.1 一般实验程序
傅里叶变换红外（FTIR）光谱使用PerkinElmer Spectrum TWO IR光谱仪记录，主要吸收峰以波数（ν?, cm?1）表示。核磁共振（NMR）光谱在Bruker光谱仪（德国卡尔斯鲁厄）上以400 MHz频率获得，使用CDCl3（Merck，美国新泽西州拉赫韦）作为溶剂，其残余峰作为内标（1H的δ为7.26 ppm，13C的δ为77.0 ppm）。NOESY-1D光谱在500 MHz频率下记录，以确定立体中心的相对取向。
2.2 刺山柑内酯和土壤特性
刺山柑内酯由卡迪斯大学（University of Cadiz）的化感研究小组提供。用于降解性研究的通用培养基Blumenerde?适用于种植所有类型的室内和室外开花植物，其特性如表1所示。
表1. Blumenerde?通用培养基的特性和成分
| 组分 | 浅色泥炭 | 黑色泥炭 | 蔬菜堆肥 | 椰子纤维 |
|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|
| pH (H2O) | 6.75 | 6.75 | 6.75 | 6.75 |
| 电导率 (mS/m) | 120 | 120 | 120 | 120 |
| 有机物/干物质 | 55% | 55% | 55% | 55% |
| 堆积密度 | 0.38 | 0.38 | 0.38 | 0.38 |
| 分类A | 重金属含量低于该分类的授权限值 | 重金属含量低于该分类的授权限值 | 重金属含量低于该分类的授权限值 | 重金属含量低于该分类的授权限值 |
2.3 刺山柑内酯在非生物条件下的稳定性研究
对于pH稳定性研究，应用了两种条件：pH 5和pH 8，分别代表农业土壤中典型的酸性和碱性极端情况。在另一个实验中，评估了在50°C下的温度稳定性，模拟作物条件下的极端情况。为了达到所需的pH值，使用了99.8%的冰醋酸（Labchem，西班牙巴塞罗那）和无水醋酸钠（99%，Labchem，西班牙巴塞罗那）（浓度分别为0.100 M和0.160 M）调节pH至5，以及磷酸盐缓冲液[0.472 M Na2HPO4·12H2O（98–102%，Labchem，西班牙巴塞罗那）和0.013 M NaH2PO4（98%，Labchem，西班牙巴塞罗那）调节pH至8。稳定性研究以1 ppm的刺山柑内酯初始浓度进行，分别加入三个试管中（0.5、1、24、48和72小时），每个时间点重复三次。试管在25°C下孵育，并使用Heidolph试管振荡器（Schwabach，德国）以440 rpm的速度振荡。收集的样品使用PTFE过滤器（0.22 μm，Phenomenex，美国加州托伦斯）过滤，并使用UPLC-QTOF进行分析。对于温度稳定性研究，使用加热板并持续搅拌以保持硅油浴在50°C。实验条件包括刺山柑内酯浓度、孵育时间和样品收集时间，与上述相同。结果表示为每个时间点的刺山柑内酯浓度与初始浓度的比值（C/C0）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，随后使用Dunnett检验比较不同时间点与时间零点的差异（*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001）。
2.4 刺山柑内酯在土壤中的稳定性研究
使用Blumenerde?通用培养基进行刺山柑内酯在土壤中的稳定性研究。将2.5 ppm的刺山柑内酯（溶于超纯水中，1.5 mL）加入含有0.4 g土壤的试管中。三个试管在25°C下以440 rpm的速度振荡，孵育预定的时间点（0.5、1、24、48、72和168小时）。孵育后，试管以4000 g离心10分钟并收集上清液。收集的样品使用PTFE过滤器（0.22 μm，Phenomenex，美国加州托伦斯）过滤，并使用UPLC-QTOF进行分析。结果以C/C0比值表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Dunnett检验进行统计比较（*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001）。部分土壤在121°C和2 atm的压力下使用高压灭菌器灭菌22分钟。使用层流罩重复之前的实验，以确保无菌条件。
2.5 刺山柑内酯降解产物的分离
在刺山柑内酯稳定性实验中分离了降解产物。关于非生物因素下的稳定性，发现刺山柑内酯浓度在pH 8下降低，因此进行了放大实验（24个试管，C0 = 1 ppm）。用于分离化合物的溶剂为HPLC级。甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和丙酮来自Fischer Chemicals（比利时Geel）。水为Wasserlab（西班牙Barbatáin）的Ultramatic系统提供的I型水。使用Strata?-X 33 μm反相柱（Phenomenex，美国加州托伦斯）进行样品制备和纯化。薄层色谱（TLC）使用Silica Gel 60 RP-18 F254S铝片（Merck，德国达姆施塔特）进行。反相色谱（Strata?-X柱）使用流动相为超纯水和甲醇（60:40 v/v）、超纯水和甲醇（40:60 v/v）、甲醇和丙酮，得到四个组分。薄层色谱用于在四个组分上鉴定降解产物，最终在超纯水和甲醇（60:40 v/v）流动相的分组中鉴定出降解产物。高效液相色谱（HPLC）使用Merck-Hitachi D-7000系统（日本东京）和折射率检测器（Elite LaChrom L-2490；Hitachi，日本东京）以及Gemini 5 μm C18 110 ?柱（Phenomenex，美国加州托伦斯），以超纯水和甲醇（60:40 v/v）流动相（1 mL/min流速）进行纯化。通过1H和13C-NMR光谱确认了分离化合物的纯度和结构。对于标准土壤中的刺山柑内酯降解，也进行了更大规模的实验（24个试管，1.2 g土壤，4.5 mL 10 ppm刺山柑内酯溶液）。孵育后，试管以4000 g离心10分钟并收集上清液。收集的样品使用PTFE过滤器（0.22 μm，Phenomenex，美国加州托伦斯）过滤，并使用UPLC-QTOF进行分析。结果以C/C0比值表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Dunnett检验进行统计比较（*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001）。一部分土壤在121°C和2 atm压力下使用高压灭菌器灭菌22分钟。使用层流罩重复之前的实验，以确保无菌条件。
2.6 新化合物的实验数据
化合物1（刺山柑内酯）、2（脱酰刺山柑内酯）和3（脱氢刺山柑内酯）之前已在文献中报道，并通过将其光谱数据与现有数据比较进行了鉴定。这些化合物的1H和13C NMR光谱包含在支持信息中以供参考。新化合物4（4,15-二氢脱氢刺山柑内酯）的数据：HRMS(m/z)：C19H22O6Na的计算值为369.1314 [M + Na]+；实测值为369.1323。红外光谱（ν?max, cm?1）：3463、2919、1765、1738。1H和13C核磁共振数据列在表3中。

2.7 通过UPLC-QTOF定量倍半萜内酯

使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF，Waters XEVO G2S QTOF，美国马萨诸塞州）进行定量分析，采用正离子电喷雾离子化方式，源温度为120°C，脱溶剂温度为450°C，气体脱溶剂流速为850 L/h，气体锥流速为20 L/h，锥电压为40 V。质量分辨率达到22,000，质量范围为150–800 Da。色谱柱为Kinetex 1.7 μm F5 100 ? 100 × 2.1 mm（Phenomenex，美国加利福尼亚州托伦斯）。UPLC-MS/MS分析所用的溶剂为UHPLC/MS级。甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、丙酮和甲酸均来自Fischer Chemicals（比利时吉尔）。水为Wasserlab（西班牙巴尔巴塔因）生产的I型水。流动相由溶剂A（水，0.1%甲酸）和溶剂B（甲醇，0.1%甲酸）组成，流速设置为0.4 mL/min。线性梯度程序如下：0–0.5 min，30% B；0.5–1 min，升至50% B；1–2.5 min，升至70% B；2.5–3 min，升至95% B；3–4 min，降至30% B。进样量为5 μL。倍半萜内酯和刺槐苦苷标准品溶解在甲醇中，浓度为1000 ppm，然后用水稀释至1–1000 ppb以绘制校准曲线。样品通过0.22 μm孔径的膜过滤器（Phenomenex，美国）过滤。

2.8 小麦胚芽鞘生物测定

所有实验均按照Rial等人的方法进行，并做了一些修改。刺槐苦苷及其降解产物在10、30、100、300和1000 μM的浓度下进行测试，预先溶解在0.1%二甲亚砜（99.9%，PanReac AppliChem，西班牙巴塞罗那）中，然后稀释在含有2%蔗糖（99%，PanReac AppliChem，西班牙巴塞罗那）的磷酸盐-柠檬酸缓冲液[K2HPO4·3H2O（99–102%，PanReac AppliChem，西班牙巴塞罗那）]中，pH值为5.6。商业除草剂Logran?（Syngenta，瑞士）在相同条件和浓度下作为阳性对照。通过数字化胚芽鞘图像并使用Photomed Equipment软件进行处理来测量其伸长率。结果以相对于对照值的百分比偏差显示。零表示对照，正值表示促进作用，负值表示抑制作用。

2.9 对Portulaca oleracea的植物毒性

评估了刺槐苦苷及其降解产物对Portulaca oleracea的植物毒性。生物测定方法如Rial等人所述，但有所修改。刺槐苦苷及其降解产物在1000、300、100、30和10 μM的浓度下制备，预先溶解在二甲亚砜（每毫升缓冲液5 μL二甲亚砜）中，然后稀释在2-[N-morpholino]乙磺酸（99.5%，Sigma Aldrich Co，美国密苏里州圣路易斯）缓冲液（pH 6）中。作为阳性对照的是Stomp?Aqua商业除草剂的活性成分pendimethalin（98%，Fisher Scientific，美国新罕布什尔州），使用相同的浓度。种子在25°C下黑暗条件下培养8天。使用Fitomed系统及其相关软件自动采集数据并进行分析。结果以相对于对照值的百分比偏差显示。零表示对照，正值表示促进作用，负值表示抑制作用。

2.10 统计分析

IC50值是通过非线性回归确定的。通过将浓度对时间的对数数据调整为线性回归来获得降解常数（k）和半衰期（t1/2）。两种情况均使用了GraphPad Prism 5软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。

3 结果与讨论

3.1 不同pH值和温度条件下刺槐苦苷的稳定性研究

评估了pH值和温度作为非生物因素对刺槐苦苷化学稳定性的影响。选择50°C作为极端农业条件，因为它超过了典型的农业温度。此外，选择了pH 5和pH 8来分别代表农业环境中常见的酸性和碱性土壤。建立了72小时的培养期，在0、0.5、1、24、48和72小时的时间点监测刺槐苦苷的浓度，以评估这些非生物因素的影响。不同温度和pH条件下的稳定性研究结果分别显示在图1和图2中。图1显示了在50°C下72小时内刺槐苦苷（1）的稳定性曲线，数值表示每个时间点的刺槐苦苷（1）浓度与初始浓度（C0）的比值。C0为1 ppm。图2显示了在pH 5和pH 8下72小时内刺槐苦苷（1）的稳定性曲线，数值同样表示每个时间点的刺槐苦苷（1）浓度与初始浓度（C0）的比值。统计显著性用*表示：P < 0.05，**表示：P < 0.01，***表示：P < 0.001。如图1所示，刺槐苦苷（1）在50°C下72小时的培养期内保持稳定，没有统计学上的显著变化。温度是一个已知会影响化合物降解的非生物因素，因为它可以增加土壤温度和微生物活性，特别是在富含有机物的土壤中。该实验研究了刺槐苦苷在水中的热稳定性，以确定温度本身是否会影响其稳定性，而无需考虑与土壤性质的相互作用。结果表明，温度本身并未显著改变刺槐苦苷的稳定性，且没有研究发现类似的降解机制在农业温度条件下发生。这些发现与倍半萜内酯eremantholide C的稳定性特征一致，后者在各种温度条件下都表现出稳定性（在40°C下加速6个月，在90°C下强制3天）。

在pH稳定性研究（图2）中，刺槐苦苷（1）在pH 5下的降解最小，0.5小时时浓度减少了7%，72小时时减少了12%，表明在酸性条件下具有高稳定性。然而，我们未能在溶液中检测到任何降解产物。然而，在pH 8下，刺槐苦苷（1）在24小时内保持稳定，之后开始降解，72小时时减少了38%。为了进一步研究这种降解，进行了放大实验以分离足够的降解产物进行结构表征和植物毒性评估。HPLC纯化确认化合物2是刺槐苦苷（1）的主要降解产物。化合物2的1H-NMR光谱（图S2.1–S2.6）与化合物1的1H-NMR光谱（图S1.1–S1.6）相比有一些差异。H-3′a、H-3′b和H-4′的信号消失了，这表明C-8处的酯基发生了皂化作用，这一点通过质谱得到的分子式得到了证实。其13C-NMR光谱（S2）也支持这一结构，C-8处的四个碳原子消失了。所有光谱数据与文献中描述的去酰基刺槐苦苷（2）的特征一致（图3）。图3显示了pH 8降解实验中刺槐苦苷的降解产物：刺槐苦苷（1）和去酰基刺槐苦苷（2）的化学结构。纯化并鉴定出化合物2后，将其浓度曲线与化合物1进行了比较，并将培养期延长至168小时（图4）。图4显示了在pH 8下168小时内刺槐苦苷（1）的降解曲线和去酰基刺槐苦苷（2）的积累情况。数值表示每个时间点的刺槐苦苷（1）与去酰基刺槐苦苷（2）浓度与初始浓度（C0）的比值。0.5小时后，化合物2出现，浓度为30.2 ppb。24小时后，化合物1的浓度显著下降，同时化合物2的浓度上升。7天后，化合物1降解了80%，浓度降至最低的202 ppb，而化合物2的浓度达到峰值700 ppb。降解遵循一级动力学，半衰期（t1/2）为100.1 ± 5.5小时（表2）。表2显示了在pH 8下刺槐苦苷降解的降解速率常数（k）和半衰期（t1/2）。

3.2 刺槐苦苷在土壤中的稳定性

在标准农业条件下，评估了刺槐苦苷（1）在土壤中的稳定性，培养期为168小时。样品在0、0.5、1、24、48、72和168小时进行分析，并分离出降解产物进行鉴定。为了首次评估刺槐苦苷及其降解产物的稳定性，我们使用了商业土壤，以确保条件可控且特征明确，从而便于获得可重复的结果。刺槐苦苷在标准土壤中培养的前0.5小时内保持稳定（图6）。1小时后浓度显著减少了14.2%，随后逐渐下降。在24、48和72小时培养时，浓度分别减少了31.9%、35.5%和44.6%。168小时后，刺槐苦苷的浓度低于定量限。化合物1在土壤中的降解遵循一级动力学。土壤中的降解速率常数（k）为0.00755 ± 0.00095 h?1，相应的半衰期（t1/2）为91.8 ± 12.3小时（表2），方差系数为0.94，与其他关于土壤中化合物降解的研究结果相似。化合物1在土壤中更快的降解表明有微生物的参与。这种转化过程通常与接触土壤的化感物质的结构变化有关，主要是由于pH值、氧化还原电位和微生物的作用。在这种情况下，所用标准土壤含有55%的有机物，微生物依赖这些有机物生存，因此存在的微生物群可能是化合物1转化为新化合物的原因。

在验证了标准土壤中化合物1浓度下降后，进行了更大规模的降解研究。这一放大实验使我们能够获得更多的化合物1降解产物，从而便于确定它们的化学结构和植物毒性。HPLC纯化显示化合物1降解为两种不同的化合物，分别命名为化合物3和化合物4。这些化合物的化学结构通过1H和13C核磁共振光谱进行了表征（图5）。图5显示了从刺槐苦苷（1）标准土壤降解实验中分离出的降解产物的化学结构：脱氢刺槐苦苷（3）和4,15-二氢脱氢刺槐苦苷（4）。降解产物3的1H-NMR光谱（图S3.1–S3.6）与化合物1的1H-NMR光谱（图S1.1–S1.6）有相似之处，但δ 4.55处的信号（H-3）缺失（化合物1的1H-NMR光谱，S1；化合物3的1H-NMR光谱，S3）。这一信号的缺失表明C-3处的羟基被氧化成了羰基。这一酮基的存在在13C-NMR光谱（图S3.1–3.6）中的δ 203.5处得到了证实。此外，化合物1中δ 5.48（H-15a）和δ 5.36（H-15b）的信号在化合物3中分别移动到了δ 6.34和δ 6.00，这表明C-3处的双键与酮基发生了共轭。根据这些光谱数据，产物3的结构被确定为脱氢刺槐苦苷，Ingallina等人曾描述过这种天然产物（图5）。图4比较了化合物4的1H-NMR光谱（图S4.1–S4.8；表3）与化合物1的1H-NMR光谱（S1），发现δ 4.55处的信号缺失（H-3）。与化合物3类似，这是由于C-3处的羟基失去了氢原子，形成了酮基。在该13C-NMR光谱（S4）中，通过δ 218.2处的信号确认了该酮基的存在，该信号与HMBC实验中δ 2.39处的信号相关。此外，化合物1中δ 5.48（H-15a）和δ 5.36（H-15b）处的信号未被观察到，这表明C-4处的环外双键被氢化形成了一个甲基。这种转变通过δ 1.28处三个质子的双峰信号以及δ 2.37处的新信号得到证实，后者对应于化合物4中的H-4，并在COSY实验中显示出相关性。为了确定甲基15的立体化学结构，进行了两次NOE-1D实验。照射H-6信号后，H-8和H-4信号增强了NOE效应，而照射H-5时未观察到增强效应，这表明这些质子具有相同的相对β-取向。这一观察结果使得能够确定甲基15的α-取向，这与H-4和H-2β之间的W耦合（J = 1.2 Hz）一致。与其他化合物相比，剩余信号的化学位移和耦合常数相似，表明该化合物其他中心的立体化学结构与起始材料相同。所有这些归属都是通过COSY、HSQC和HMBC实验确定的，并显示在表3中。据我们所知，降解产物4（4,15-二氢-脱氢香叶酚）的结构是新的，在本研究中首次被阐明（图5）。其化学结构通过UPLC-MS/MS得到了验证，测得分子量为369.1357 g/mol（C19H22O6Na）[M+Na+]。表3显示了化合物4的1H化学位移（δ，ppm）、耦合常数（J，Hz）和多重性，以及13C化学位移（δ，ppm）（400 MHz，CDCl3）。

在纯化和鉴定降解产物后，也在化合物1的稳定性曲线中发现了这些产物（图6和表4）。图6显示了香叶酚（1）及其在标准土壤中孵育168小时后的降解产物（脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）的出现情况。数值表示每个时间点化合物1、3和4的浓度与初始香叶酚浓度（C/C0）的比率。C0为2.5 ppm。表4显示了香叶酚（1）及其降解产物脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）在标准土壤中孵育168小时后的浓度（ppb）。

降解产物在化合物1的稳定性曲线中也被识别出来（图6和表4）。图6显示了香叶酚（1）及其在标准土壤中孵育168小时后的降解产物脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）的出现情况。数值表示每个时间点化合物1、3和4的浓度与初始香叶酚浓度（C/C0）的比率。C0为2.5 ppm。表4显示了香叶酚（1）及其降解产物脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）在标准土壤中孵育168小时后的浓度（ppb）。

根据化合物1的稳定性曲线和降解产物的出现情况，化合物3在孵育0.5小时后就被观察到。24小时后，其浓度显著升高（75 ppb），在72小时后达到最大值162 ppb（表4）。化合物3在168小时的孵育期结束时完全耗尽。化合物4在孵育48小时后出现，在168小时时达到最大浓度851 ppb。关于化合物1转化为化合物3和4的情况，孵育72小时后，化合物1的浓度从2375 ppb下降到1310 ppb（减少了44.6%），而化合物3的浓度为162 ppb，化合物4的浓度为425 ppb（降解产物占24.7%）。这表明这两种主要化合物是主要的降解产物。剩余的19.9%可能归因于无法分离出的次要降解产物。化合物1浓度的降低可能归因于促进其转化的各种土壤特性。正如本研究所展示的，pH值在香叶酚的稳定性中起着重要作用，在pH 8时促进了其降解并转化为化合物2。随后对标准土壤中包含化合物1的混合物的pH值进行分析，发现pH值为5.1，在此pH值下化合物1是稳定的；因此，没有检测到化合物2。从土壤环境中化合物1转化为化合物3和4的情况表明，这种转化可能是由土壤微生物介导的，而不是由pH相关机制引起的。为了验证微生物的参与，进行了resazurin测定来评估土壤中的代谢活性微生物。结果显示，在最初的24小时内活性显著增加（详见支持信息中的图S5和图S5.1）。最初观察到化合物3的出现，随后化合物4开始出现，但在48小时后化合物3的浓度没有增加。这可能表明化合物4是由化合物3产生的，因此一个假设的降解途径可能是从香叶酚（1）的氧化开始，产生化合物3，然后进一步还原产生化合物4（图1）。

在纯化和鉴定降解产物后，它们也在化合物1的稳定性曲线中被识别出来（图6和表4）。图6显示了香叶酚（1）及其在标准土壤中孵育168小时后的降解产物脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）的出现情况。数值表示每个时间点化合物1、3和4的浓度与初始香叶酚浓度（C/C0）的比率。C0为2.5 ppm。表4显示了香叶酚（1）及其降解产物脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）在标准土壤中孵育168小时后的浓度（ppb）。

根据化合物1的稳定性曲线和降解产物的出现情况，化合物3在孵育0.5小时后就被观察到。24小时后，其浓度显著升高（75 ppb），在72小时后达到最大值162 ppb（表4）。化合物3在168小时的孵育期结束时完全耗尽。化合物4在孵育48小时后出现，在168小时时达到最大浓度851 ppb。关于化合物1转化为化合物3和4的情况，孵育72小时后，化合物1的浓度从2375 ppb下降到1310 ppb（减少了44.6%），而化合物3的浓度为162 ppb，化合物4的浓度为425 ppb（降解产物占24.7%）。这表明这两种主要化合物是主要的降解产物。剩余的19.9%可能归因于无法分离出的次要降解产物。化合物1浓度的降低可能归因于促进其转化的各种土壤特性。正如本研究所展示的，pH值在香叶酚的稳定性中起着重要作用，在pH 8时促进了其降解并转化为化合物2。随后对标准土壤中包含化合物1的混合物的pH值进行分析，发现pH值为5.1，在此pH值下化合物1是稳定的；因此，没有检测到化合物2。从土壤环境中化合物1转化为化合物3和4的情况表明，这种转化可能是由土壤微生物介导的，而不是由pH相关机制引起的。为了验证微生物的参与，进行了resazurin测定来评估土壤中的代谢活性微生物。结果显示，在最初的24小时内活性显著增加（详见支持信息中的图S5和图S5.1）。最初观察到化合物3的出现，随后化合物4开始出现，但在48小时后化合物3的浓度没有增加。这可能表明化合物4可能是由化合物3产生的，因此一个假设的降解途径可能是从香叶酚（1）的氧化开始，产生化合物3，然后进一步还原产生化合物4（图1）。

在土壤中香叶酚的降解途径被提出。Macías等人（2004年）对苯并噁唑啉类化合物2,4-二羟基-7-甲氧基-(2H)-1,4-苯并噁唑啉-3(4H)-酮（DIMBOA）的降解进行了研究。化合物1的半衰期比DIMBOA长（t1/2 ≈ 31分钟），但在相似的实验条件下与DIBOA的半衰期相似（t1/2 ≈ 24–62小时）。这表明香叶酚在环境中的持久性比DIMBOA更强，但与DIBOA的持久性相似。植物毒性化学物质的降解可能导致这种活性的丧失或增强，这取决于化合物的化学结构，因为羟基、甲氧基和羧基等官能团可能会发生水解。

与之前关于化感物质与土壤相互作用的研究一致，化感物质降解为新化合物的过程与土壤微生物有关。研究了倍半萜内酯isoalantolactone在土壤中的持久性，该化合物在90天后完全消失，很可能是由于与土壤中的腐殖质结合和微生物分解。为了确认观察到的降解是由土壤中的微生物引起的，使用高压灭菌器在121°C和2 atm的压力下对土壤进行了22分钟的灭菌处理。随后，使用层流罩重复了之前的实验以确保无菌条件。如图7所示，化合物1的浓度在整个实验过程中保持稳定，这排除了土壤或非生物条件导致香叶酚转化为化合物3和4的可能性。图7显示了香叶酚（1）在灭菌标准土壤中孵育168小时后的稳定性曲线。这些结果与之前的研究一致，强调了土壤微生物群落在生物活性化合物转化中的核心作用。特别是对Solanum rostratum凋落物的研究表明，与灭菌条件相比，未灭菌土壤中的化感抑制作用显著降低，表明本地微生物积极降解或转化化感物质。这种微生物活动与代谢物谱的变化有关，包括酚类化合物的减少和已知具有降解潜力的微生物类群的富集。同样，我们在灭菌土壤中未观察到香叶酚的转化及其在非生物条件下的持久性，进一步支持其转化为化合物3和4主要是由土壤微生物介导的，而不是由物理化学因素如pH值引起的。

为了表征香叶酚降解产物的植物毒性，进行了小麦胚芽鞘生物测定和对杂草Portulaca oleracea的评估。小麦胚芽鞘生物测定可以快速灵敏地确定生物活性化合物的植物毒性。图8显示了香叶酚（1）、去酰基香叶酚（2）、脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）的小麦胚芽鞘生物测定结果。图8显示了香叶酚（1）、降解产物（去酰基香叶酚（2）、脱氢香叶酚（3）、4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）以及商业除草剂（HBC）对小麦胚芽鞘伸长的植物毒性效应。数值表示与对照组的平均百分比差异±标准偏差。字母a和b分别表示P < 0.01和0.01 < P < 0.05的显著性。所有评估的化合物都表现出植物毒性，其活性与商业除草剂在第一个浓度（1000 μM）时相似。然而，在第二个浓度时，所有四种化合物的活性都降低了，范围从62%到76%。每种化合物的IC50值显示在表5中。

表5显示了降解产物、香叶酚和商业除草剂（HBC）的小麦胚芽鞘生物测定中的IC50值。

化合物 IC50 R2
1 207.3 ± 1.1b 0.987
2 223.2 ± 1.1a 0.979
3 143.0 ± 1.2d 0.971
4 181.1 ± 1.1c 0.979
HBC 46.3 ± 1.1e 0.973

字母表示处理（化合物1-4和HBC）之间的显著差异（P < 0.05），其中‘a’代表最高值。这些结果表明化合物3是最活跃的化合物，其次是化合物4和化合物1。化合物1和化合物2的结果与Scavo等人（2019b）的报告一致，他们报告了这些化合物对小麦胚芽鞘伸长的类似抑制作用。化合物3和4的植物毒性也是首次报道的。鉴于化合物2、3和4在小麦胚芽鞘生物测定中的植物毒性，还评估了它们对杂草P. oleracea的植物毒性。由于该物种对倍半萜内酯的高度敏感性，也评估了它们对杂草P. oleracea的植物毒性。化合物1（香叶酚）的降解产物对杂草P. oleracea的植物毒性也进行了评估。

为了表征香叶酚降解产物的植物毒性，进行了小麦胚芽鞘生物测定和对杂草Portulaca oleracea的评估。小麦胚芽鞘生物测定允许快速灵敏地确定生物活性化合物的植物毒性。图8显示了香叶酚（1）、去酰基香叶酚（2）、脱氢香叶酚（3）和4,15-二氢-脱氢香叶酚（4）对小麦胚芽鞘伸长的植物毒性效应。数值表示与对照组的平均百分比差异±标准偏差。字母a和b分别表示P < 0.01和0.01 < P < 0.05的显著性。所有评估的化合物都表现出植物毒性，其活性与商业除草剂在第一个浓度（1000 μM）时相似。然而，在第二个浓度时，所有四种化合物的活性都降低了，范围从62%到76%。每种化合物的IC50值显示在表5中。本研究首次报道了这些降解产物对欧芹（P. oleracea）的植物毒性作用。观察到的植物毒性作用与化合物的化学结构相关。化合物1转化为化合物4后，其植物毒性增强。化合物3的植物毒性高于化合物1，这可能是由于C-3位置上存在羰基而非羟基所致。羟甲基丙烯酸基团似乎对毒性没有显著影响，因为化合物1和化合物2的毒性水平相似。然而，这一官能团可能会影响其他物理化学性质，如溶解度和生物利用度。脱氢辛拉瑞辛（化合物3）和4,15-二氢脱氢辛拉瑞辛（化合物4）的植物毒性高于辛拉瑞辛（化合物1），这对生态学和农学具有重要意义。在土壤环境中，辛拉瑞辛的降解可能导致其除草效果随时间发生变化，降解产物在抑制杂草方面发挥更重要的作用。降解产物的持久性可能源于它们结构中保留了α-甲基-γ-内酯结构，这一结构通常被认为是大多数倍半萜内酯活性的关键。化合物3还含有一个与双键共轭的羰基，这可能解释了其更高的毒性。这表明，苦苣菜（C. cardunculus）的化感作用不仅归因于辛拉瑞辛，还与其在土壤中的动态降解产物有关。

**4 结论**

我们的研究阐明了辛拉瑞辛在各种非生物和生物条件下的降解途径，发现了三种具有显著植物毒性的降解产物，其中一种在文献中是首次报道的。本研究首次探讨了倍半萜内酯辛拉瑞辛（1）在温度和pH等非生物因素以及标准土壤中的生物相互作用下的行为。辛拉瑞辛（1）在50°C和pH 5的条件下72小时内保持稳定，表明极端的农业温度和酸性土壤条件对其稳定性影响不大。然而，在pH 8的条件下，72小时后辛拉瑞辛浓度下降了38%。因此，研究延长至168小时，发现脱酰辛拉瑞辛（化合物2）是主要的降解产物。在土壤中，辛拉瑞辛在168小时内完全降解，生成脱氢辛拉瑞辛（化合物3）和4,15-二氢脱氢辛拉瑞辛（化合物4），后者是首次被鉴定出的降解产物。辛拉瑞辛在土壤中的降解遵循一级动力学。与仅pH 8条件相比，土壤中辛拉瑞辛的降解速率更快，这表明有微生物参与其中。研究结果表明，土壤参数（尤其是微生物活性和碱性pH）显著影响辛拉瑞辛的转化，从而加深了我们对其在农业环境中生态影响的理解。就植物毒性而言，降解产物3和4的毒性高于化合物1和2，有效抑制了根部和茎部的生长。这些结果表明，土壤中的转化不仅改变了辛拉瑞辛的浓度，还产生了具有更强植物毒性的降解产物。这突显了辛拉瑞辛在土壤环境中化感作用的动态特性，并强调了利用苦苣菜进行可持续杂草管理的潜力。这是首次通过表征其降解产物、研究其动力学并评估其植物毒性来探讨倍半萜内酯稳定性的研究。本研究揭示了这类化合物的重要特性。这些天然产物在文献中被广泛认为在许多植物的植物毒性中起关键作用，因此为开发基于植物的除草剂提供了宝贵见解。需要注意的是，这些降解研究是在受控实验室条件下进行的。需要在田间条件下进一步研究，考虑不同土壤类型、水分水平和微生物群落动态等因素，以全面了解辛拉瑞辛及其降解产物的环境归趋。

**致谢**

本研究由安达卢西亚自治区大学、研究与创新委员会（Consejería de Universidad, Investigación e Innovación, Junta de Andalucía）资助，项目编号为（2021-073/PAI/PAIDI/PR, PROYEXCEL_00860）。该研究还得到了葡萄牙科学技术基金会（Funda??o para a Ciência e a Tecnologia, FCT）对Daniela Rosa博士项目的资助（SFRH/BD/143845/2019, https://doi.org/10.54499/SFRH/BD/143845/2019; COVID/BD/153537/2024, https://doi.org/10.54499/COVID/BD/153537/2024），以及通过FCT资助的地中海农业环境与发展研究所（Mediterranean Institute for Agriculture Environment and Development, MED）项目（UID/05183/2025, https://doi.org/10.54499/UID/05183/2025; https://doi.org/10.54499/UIDB/05183/2020; https://doi.org/10.54499/LA/P/0121/2020）的资助。此外，该研究还得到了“CEBAL for Investiga??o, Transferência e A??o Sustentável (CITAS) - Programa de RHAQ: Refor?o da Investiga??o e Transferência de Conhecimento para o Desenvolvimento Sustentável”（REF: ALT2030-FSE+-01783000）项目的支持，该项目属于阿尔恩特茹2030区域计划（ALT2030-2024-12），并由欧洲社会基金Plus（ESF+）资助。

**利益冲突**

作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**

支持本研究结果的数据可在本文的补充材料中找到。