《Journal of Cystic Fibrosis》：CFTR facilitates fluid secretion by ferret alveolar type 2 cells
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李媛杨|姚长福|贾瓦希尔·哈吉巴巴扎德|马亚博|凯瑟琳·德雷克|奥卢瓦达拉西米·阿坦达|胡哲青|巴里·R·斯特里普|刘晓明|约翰·F·恩格尔哈特美国阿拉巴马大学伯明翰分校医学系肺病、过敏与重症监护医学科，伯明翰，AL 35294摘要背景囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）在肺泡
李媛杨|姚长福|贾瓦希尔·哈吉巴巴扎德|马亚博|凯瑟琳·德雷克|奥卢瓦达拉西米·阿坦达|胡哲青|巴里·R·斯特里普|刘晓明|约翰·F·恩格尔哈特
美国阿拉巴马大学伯明翰分校医学系肺病、过敏与重症监护医学科，伯明翰，AL 35294
摘要
背景
囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）在肺泡II型（AT2）细胞中的功能及其在维持肺泡液平衡中的作用仍存在争议。一些研究表明，CFTR在肺泡中的表达有助于液体吸收，而其他研究则指出其参与液体分泌。
方法
我们利用原代雪貂AT2细胞建立了类器官和气液界面（ALI）培养体系。通过scRNA测序分析了类器官的细胞组成。利用这些模型，我们研究了CFTR的功能以及G551D突变体对氯离子和液体转运的影响，以及这些过程如何调节顶表面液（ASL）的稳态体积。
结果
scRNA测序证实，类器官中99%以上为AT2细胞和过渡型AT2细胞。福斯科林诱导的肿胀在野生型类器官中表现出强烈的CFTR依赖性液体分泌，而在CFTR-G551D囊性纤维化（CF）类器官中则没有这种现象，但可以通过CFTR激活剂VX-770（Ivacaftor）得到恢复。电生理学研究表明，CF ALI培养物中的CFTR介导的氯离子分泌受损，而VX-770可部分恢复这一功能。在有利于分泌的条件下，CFTR介导的电流较为明显；而在有利于吸收的条件下则非常微弱。CF培养物中的ASL高度显著降低，而VX-770处理后部分得到恢复。
结论
我们从雪貂原代AT2细胞培养中获得的结果表明，CFTR主要促进氯离子和液体的分泌而非吸收。这一体外模型系统有助于阐明CFTR在远端肺部的功能，为CF的发病机制提供见解，并可作为治疗测试的平台。
引言
肺泡的巨大表面积被一层薄薄的液体覆盖，即肺泡壁液（AWL），这对维持表面张力和抵御病原体至关重要。AWL体积和组成的精确调节对呼吸健康至关重要[1]，而这种微妙平衡的失调是多种严重肺部疾病的特征，包括急性肺损伤（ALI）[2]、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）[3]和囊性纤维化（CF）[4]。然而，AWL稳态的维持在很大程度上依赖于肺泡上皮内离子通道的协同作用，尤其是在肺泡II型（AT2）细胞中。除了在产生表面活性剂方面发挥关键作用外，AT2细胞还是跨肺泡屏障的离子和液体转运的主要调节者[2,5]。AT2细胞的功能障碍与无法消除肺泡水肿、慢性炎症以及特发性肺纤维化和CF等疾病中的结构损伤有关[3,6]。
AT2细胞表达多种关键离子通道，尤其是上皮钠通道（ENaC）和囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）阴离子通道[7]。这些通道共同作用，通过驱动钠离子和水的重吸收来调节肺泡内薄液层的体积和组成，这一过程对维持适当的气体交换至关重要[1]。虽然CFTR在传导气道中的氯离子分泌作用已被充分证实，但其在远端肺部的功能仍存在争议。一些研究表明它主要介导分泌[1]，而另一些研究则表明它参与氯离子的重吸收和液体清除[5]。这种不确定性突显了我们对肺泡生理学及CF等疾病机制理解上的关键空白。
由于啮齿动物模型无法完全复制人类CF的肺部病理学特征，因此研究CFTR在远端肺部的功能受到了限制[8,9]。在大型动物模型（尤其是猪）中的研究表明，CFTR在远端肺部具有功能性表达，并参与肺泡液体的调节[10],[11],[12],[13]。雪貂虽然体型较小，但其解剖结构和生理特征与人类肺部有显著相似性，是研究CF肺病的优秀模型[14,15]。这使得它能够用于研究CF肺病的发病机制并定义细胞层面的CFTR功能[16],[17],[18]。尽管在了解传导气道特定类型细胞（[16,17]）和较小支气管（[19]）中的CFTR功能方面已取得进展，但其在AT2细胞中的作用仍不明确。尽管通过对小鼠[20,21]和猪[10],[11],[12],[13]的肺泡液分泌研究获得了一些见解，但用于研究其他大型物种中AT2细胞功能的模型系统仍然有限。
在本报告中，我们开发了一种新的、可靠的类器官和气液界面（ALI）培养系统，该系统来源于野生型和CFTR-G551D雪貂AT2细胞[15]。这些培养物既可以作为AT2细胞进行研究，也可以诱导分化为AT1细胞。这一体外模型系统通过类器官肿胀测定、2D培养中的ASL体积测量以及电生理学测量，直接评估了AT2来源上皮中的CFTR功能。
章节摘录
雪貂AT2细胞类器官的培养
为了建立一种可靠的体外模型来研究雪貂AT2来源的上皮细胞，我们制定了分离和维持原代雪貂AT2细胞的培养方案。通过对雪貂远端肺组织的免疫荧光（IF）染色，发现了不同的上皮细胞群，包括SPC? AT2细胞、AGER? AT1细胞和KRT5?基底细胞（图1A）。通过显微解剖去除可见的支气管和细支气管，以减少支气管上皮细胞的污染。
讨论
在本报告中，我们详细描述了使用原代雪貂细胞研究AT2细胞生理学的可靠平台的开发与表征。将该系统应用于WT和CFTR-G551D雪貂来源的细胞后，我们提供了多项证据，证明CFTR在雪貂AT2细胞中的主要作用是介导氯离子和液体的分泌。福斯科林诱导的肿胀在WT类器官中可以明显观察到，而在CFTR-G551D类器官中则不存在，但可以通过CFTR激活剂VX-770部分恢复。
动物
所有动物实验均获得了爱荷华大学和阿拉巴马大学伯明翰分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本研究中使用的转基因动物模型包括ROSA-TG雪貂和CFTRG551D/G551D CF雪貂[15,41]。动物根据基因型分组，未进行随机化处理。由于使用转基因雪貂时难以实现性别均衡，因此未考虑性别作为变量。
伦理批准声明
本研究中使用的动物实验方案符合美国国立卫生研究院（NIH）的标准，并获得了爱荷华大学和阿拉巴马大学伯明翰分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有雪貂均来自Marshall Farms（纽约州North Rose），并饲养在爱荷华大学或阿拉巴马大学伯明翰分校的动物设施中。
作者贡献
LY：数据采集、分析、解释、撰写、修订；CY：scRNA测序和生物信息学分析；JH：数据采集、分析、修订；YM：数据采集、分析；KD：scRNA测序；OA：数据采集、分析；ZH：数据采集、分析；BRS：scRNA测序和生物信息学解释；XL、JFE：概念提出、分析、解释、修订、编辑、总体监督。
数据可用性声明
本研究生成的数据可在已发表的文章及其补充文件中找到；如需额外数据，可向相应作者提出合理请求。
资助
本工作得到了美国国立卫生研究院（资助JFE）和囊性纤维化基金会（资助JFE和BRS）的支持；此外还得到了NHLBI合同75N92025C00007（资助JFE）以及囊性纤维化基金会研究发展计划NAREN24R20（资助BRS）的资助。
利益冲突声明
所有作者声明与本研究无直接的利益冲突。
