用于抑制胆碱酯酶的香豆素磺酸盐骨架的研制：针对阿尔茨海默病治疗的实验与计算研究

《RSC Advances》：Development of coumarin-sulfonate scaffolds for cholinesterase inhibition: experimental and computational studies toward Alzheimer's disease therapy

　　有效胆碱酯酶抑制剂的发展仍然是阿尔茨海默病（AD）症状管理的关键策略；然而，能够同时抑制AChE和BChE的结构多样化的支架的识别仍然有限。在这方面，香豆素-磺酸盐杂化物由于其可调的电子和空间特性，为探索结构-活性关系提供了一个有前景的框架。在本研究中，通过两步程序合成了一系列九种香豆素-磺酸盐衍生物（1-9），并使用Ellman测定法评估了它们对乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的抑制活性。在测试的化合物中，衍生物3（2,4,6-三甲基苯磺酸盐）表现出最高的抑制活性，其IC50值分别为AChE的6.476 nM和BChE的11.948 nM，表明具有强大的双重抑制作用。化合物2也显示出强烈的双重活性，而化合物5对BChE的选择性相对较高。结构-活性关系（SAR）分析显示，芳基磺酸盐取代基的电子特性和空间体积显著影响了酶的抑制作用。此外，还进行了计算研究，以提供配体-酶相互作用的定性见解，支持实验观察到的活性趋势。总体而言，这些结果突显了香豆素-磺酸盐衍生物作为胆碱酯酶抑制剂的有前景的支架，并为针对AD相关目标的进一步结构优化提供了基础。

1. 引言

阿尔茨海默病（AD）是一种慢性神经退行性疾病，其特征是缓慢而逐渐的衰退，导致老年人出现痴呆症，影响着全球数百万人的生活。AD在临床上表现为进行性的记忆和认知障碍，通常伴随着神经精神症状。该疾病的分子特征是细胞外β-淀粉样蛋白聚集物的积累以及由过度磷酸化的tau蛋白组成的神经纤维缠结的形成，这两者都导致了突触功能障碍和神经元丢失。尽管进行了大量的研究努力，AD仍被认为是一种由遗传、生化和环境因素共同决定的多因素疾病；目前尚无有效的疾病修饰治疗方法。这种方法的重要性在于，人们关注酶及其抑制剂作为解决AD中胆碱能缺陷和认知功能障碍的潜在治疗途径。解释阿尔茨海默病病理生理学的最早和最具影响力的假设之一是胆碱能假说，该假说将认知障碍与大脑中胆碱能神经传递的损伤联系起来。这一假说得到了数据的支持，这些数据记录了乙酰胆碱释放的受损，以及学习和记忆关键区域中胆碱酯酶活性的变化。乙酰胆碱由两种类似的酶代谢：乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE），这两种酶在组织分布和调节神经递质的作用上有所不同。在正常大脑中，大部分乙酰胆碱的水解是由AChE介导的。同时，BChE的作用是次要的，但在疾病进展过程中，AChE的活性显著降低。相比之下，BChE的活性增加，从而强调了这两种酶在AD病理学中的作用。

临床使用的胆碱酯酶抑制剂可以增加突触中的乙酰胆碱水平，仍然是轻度至中度AD的主要症状治疗方法。尽管这些药物有效，但它们的疗效因疾病的进展而异且具有短暂性，而其副作用是限制其使用的另一个因素。Tacrine是第一个被开发出来的同时抑制AChE和BChE的抑制剂，用于AD治疗，它证明了胆碱能增强的概念，但由于毒性问题而被撤出市场，为开发更安全的药物铺平了道路。尽管在AD治疗方面取得了显著进展，但这些治疗方法并不能阻止疾病的进展，这证实了继续开发新的胆碱酯酶抑制剂（特别是同时抑制AChE和BChE的抑制剂）的必要性。最近的药物化学进展强调了含有磺酸盐的支架作为开发阿尔茨海默病治疗用胆碱酯酶抑制剂的有前景的结构基团的重要性。引入磺酸盐官能团可以通过氢键、静电相互作用和改善的物理化学性质来增强酶-配体相互作用，从而促进在AChE和BChE的催化口袋内的结合。几项最近的研究报道了多种基于磺酸盐的衍生物的合成和生物学评估，包括萘-2-磺酸噻唑半卡巴宗、巴比妥酸盐-磺酸盐结合物、喹啉-8-磺酸盐、席夫碱磺酸盐、腙磺酸盐和金酮磺酸盐衍生物，这些衍生物对胆碱酯酶表现出显著的抑制活性，在某些情况下具有微摩尔到纳摩尔的效力（图1）。除了酶抑制作用外，分子对接研究还证实了与催化活性位点关键残基的有利相互作用，而某些化合物还显示出多功能特性，如碳酸酐酶抑制、神经保护作用和调节氧化应激相关途径。总体而言，这些发现突显了含有磺酸盐的框架作为抗阿尔茨海默病药物发现中的多功能药效团的重要性，支持将它们纳入生物活性支架中，以开发新型和更有效的双重胆碱酯酶抑制剂。

2. 实验部分

2.1. 香豆素-磺酸盐酯的合成通用程序

在第一步中，将浓硫酸（98%，100 mL）冷却至10°C，并在反应容器中加入m-二羟基苯（10.0 g，90.8 mmol），溶解在乙酰乙酸乙酯（13.0 mL，102.7 mmol）中，形成均匀溶液。将此溶液在持续搅拌下逐滴加入冷却后的硫酸中。加入完成后，将反应混合物在室温下搅拌16小时。完成后，将混合物倒入冰水中并继续搅拌过夜。收集得到的固体，用水彻底洗涤。将粗产物溶解在5%氢氧化钠溶液中并过滤以去除不溶性杂质。然后用10%硫酸酸化滤液，直到pH值降至6以下。收集沉淀产物，用冷水洗涤并干燥，得到白色针状晶体4-甲基-7-羟基香豆素。

在第二步中，将4-甲基-7-羟基香豆素（1.00 g，5.32 mmol）溶解在干燥的二氯甲烷（20 mL）中并搅拌。逐滴加入三乙胺（0.75 mL，5.37 mmol）作为碱。使用冰浴将反应混合物冷却至0-5°C以保持低温。在冷却条件下搅拌30分钟后，逐滴加入适当的芳基磺酰氯（1.17 g，5.85 mmol）在干燥的二氯甲烷（10 mL）中的溶液，同时保持低温。加入后，让反应混合物逐渐升温至室温，并搅拌直到通过薄层色谱（TLC）确认反应完全进行。然后用二氯甲烷（3 × 20 mL）提取反应混合物，并用饱和盐水洗涤三次以去除残留的水溶性杂质。将有机层在无水硫酸钠上干燥并过滤。在减压下去除溶剂，得到粗磺化香豆素。通过从甲醇中重结晶纯化粗产物，得到所需的香豆素磺酸盐酯衍生物。

2.2. AChE和BChE抑制活性的测定

使用Ellman测定法根据改进的光谱法测定制备化合物对AChE和BChE的抑制活性。该方法基于通过酶促水解产生的硫代胆碱与5,5′二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）之间的相互作用来监测5-巯基-2-硝基苯甲酸的还原。乙酰硫代胆碱碘化物和丁酰硫代胆碱碘化物分别用作eeAChE（电鳗AChE）和eqBChE（马血清BChE）底物。将测试化合物的储备溶液制备成1 mg/mL的二甲基亚砜（DMSO）溶液，并用超纯水进一步稀释至所需浓度。对于抑制测定，将酶溶液与不同浓度的抑制剂在缓冲液（Tris-HCl缓冲液，pH 8.0用于AChE；磷酸盐缓冲液用于BChE）中孵育5分钟。然后加入DTNB溶液，之后适当的底物开始酶促反应。孵育反应混合物，并在反应开始后5分钟内用微板光谱仪测量412 nm处的吸光度变化。在没有抑制剂的情况下测得的活性被视为100%活性（对照）。抑制百分比值是相对于此对照计算的，研究人员通过绘制剩余酶活性与不同抑制剂浓度的关系图来创建抑制曲线。这些图表用于确定IC50值，即使酶活性减半所需的抑制剂浓度。Tacrine作为参考抑制剂用于在相同测试条件下进行的实验。

2.3. 计算机模拟研究

2.3.1 诱导契合分子对接

本研究采用了完整的计算方法来确定AChE和BChE酶的结合口袋尺寸，通过Sherman及其团队在2018年发表的研究中开发的诱导契合分子对接（IFD）方法来确定它们对香豆素衍生物的亲和力。该方法遵循了其他地方报告的方法论。对接研究是在Schr?dinger分子建模套件中的Maestro 13.9中进行的。AChE（PDB ID: 4TVK）和BChE（PDB ID: 4TPK）的3D晶体结构是从RCSB蛋白质数据库获得的。在对接之前，使用蛋白质准备向导（Protein Preparation Wizard）准备了这两种蛋白质结构，包括添加缺失的氢原子并将质子化状态设置为生理pH值，并纠正结构错误。使用OPLS4力场进行后优化和能量最小化，帮助它们达到极低的能量状态。通过将网格框中心对准酶活性位点的共结晶配体来建立对接网格，从而识别对接区域。LigPrep模块通过在pH 7.0 ± 2.0下生成适当的电离状态来创建配体结构，正确模拟了对接模拟的生理条件。

2.3.2 MM-GBSA结合自由能计算

通过MM-GBSA计算确定蛋白质-配体复合物的结合自由能值，使用ΔGbind作为结合自由能的测量指标。该系统使用分子力学能量计算和隐式溶剂化模型来确定配体-受体结合的强度。计算使用了Schr?dinger套件中的Prime/MM-GBSA模块，应用了OPLS4力场和VSGB溶剂化模型来评估溶剂化效应。这些分析提供了一种比较对接复合物能量稳定性的方法，包括AChE和BChE酶。

2.3.3 分子动力学模拟

使用D. E. Shaw的Desmond模拟包进行了分子动力学（MD）模拟，以研究最有前景的蛋白质-配体复合物的时间依赖稳定性和动态行为。最终选择了一种化合物进行深入的动态研究，基于分子对接和MM-GBSA的结果，该化合物对两个目标都具有最佳的亲和力。蛋白质-配体复合物是通过Desmond系统构建器构建的，然后放置在一个正交模拟盒中，复合物与盒子边缘的最小距离为10 ?。该系统在TIP3P水模型中进行了溶剂化，并用Na+和Cl?离子中和，以近似生理盐浓度0.15 M。随后使用OPLS4力场进行了能量最小化，以消除不利的接触并稳定系统，以便进行生产运行。之后，在恒定温度（300 K）和压力（1 bar）条件下进行了250 ns的分子动力学（MD）模拟，使用了标准的Desmond协议。在模拟过程中，采用了2.5 fs的时间步长和RESPA积分器以节省计算时间。在模拟过程中，监测了蛋白质-配体之间的相互作用。通过计算蛋白质主链Cα原子和配体重原子的均方根偏差（RMSD），评估了结构稳定性，这为配体在模拟期间的构象稳定性和结合提供了详细的见解。

2.3.4

ADME性质预测

为了评估所选香豆素衍生物（1-9）的药代动力学性能和类药性质，进行了计算机模拟的ADME分析。将QikProp模块集成到Maestro 13.9中，用于预测与吸收、分布、代谢和排泄相关的重要参数。QikProp通过将候选化合物与大约95%的上市药物的属性进行基准比较，来预测各种物理化学和药代动力学性质。上述评估显示了所研究的香豆素衍生物的口服生物利用度、代谢稳定性和类药性。

3. 结果与讨论

3.1. 化学

4-甲基-7-羟基香豆素是通过在硫酸存在下，用乙酰乙酸酯与m-二羟基苯进行Pechmann缩合反应合成的，随后通过碱性处理和重结晶进行纯化。通过使用三乙胺作为碱，在干燥的二氯甲烷中使4-甲基-7-羟基香豆素与适当的芳基磺酰氯反应，获得了磺酸盐衍生物。反应产物通过萃取、洗涤、干燥和重结晶分离出来，得到相应的香豆素磺酸酯晶体（方案1）。

香豆素磺酸酯（1-9）的合成。合成的香豆素衍生物通过FTIR、1H-和13C-NMR光谱进行了全面表征，获得的数据与提出的结构一致。FTIR光谱在3374 cm?1处显示了一个宽的吸收带，这归因于O–H伸缩振动。重要的是，这个带以及1251–1073 cm?1区域观察到的强吸收，对应于SO伸缩振动，清楚地表明了羟基（–OH）的磺化。芳香C–H伸缩出现在3071 cm?1，而香豆素核的特征内酯羰基（CO）出现在1691 cm?1。1566和1457 cm?1处的峰被归因于芳香CC伸缩振动。1380 cm?1处的带对应于甲基弯曲振动，627 cm?1处的吸收是由于芳香C–H的平面外弯曲。观察到的化学位移与典型的香豆素衍生物相符。H-3质子通常以δ 6.0–6.5 ppm的范围作为单峰共振，由于其孤立的烯烃性质。H-5和H-6质子通常出现在δ 7.0–8.0 ppm的范围，显示出邻位耦合（J ≈ 8–9 Hz），正如本研究中观察到的。当H-7位置被取代时（如本例中的磺化），不会显示质子信号，进一步支持了在该位置的取代。13C-NMR光谱显示了香豆素骨架的特征信号。内酯羰基碳（C-2）出现在δ 159.9 ppm处。氧化的芳香碳（C-4、C-7和C-8a）出现在δ 151–154 ppm范围内。其余的芳香和烯烃碳在δ 110–134 ppm之间共振，与共轭的香豆素和苯系统一致。脂肪族甲基碳出现在δ 18.7 ppm处。

3.1.1

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基4-溴苯-1-磺酸盐（1）

白色结晶固体，熔点171–173 °C；产率：77%；FTIR（cm?1）：3374, 3071, 1691, 1566, 1457, 1380, 1251, 1073, 627；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.76–7.67 (m, 4H, Ar–H), 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar–H), 7.08–7.03 (m, 1H, Ar–H), 6.95 (d, J = 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.30 (s, 1H, H-3), 2.42 (s, 3H, –CH3)；13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 159.9, 154.0, 151.6, 151.2, 133.9, 132.9, 130.3, 125.9, 119.1, 118.5, 115.3, 110.9, 18.7；[M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C16H12BrO5S 394.9588；实测值为394.9569。

3.1.2

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基4-甲氧基苯-1-磺酸盐（2）

白色结晶固体，熔点127–129 °C；产率：79%；FTIR（cm?1）：3382, 3091, 1700, 1594, 1493, 1372, 1267, 1086, 697；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.78 (d, J = 8.9 Hz, 2H, Ar–H), 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar–H), 7.10 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.99 (d, J = 8.9 Hz, 2H, Ar–H), 6.86 (d, J = 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.28 (d, J = 1.4 Hz, 1H, H-3), 3.91 (s, 2H, –OCH3), 2.42 (d, J = 1.4 Hz, 3H, –CH3)；13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 164.5, 160.1, 153.9, 151.7, 151.6, 130.8, 126.1, 125.7, 118.9, 118.8, 115.1, 114.6, 111.0, 55.8, 18.7；[M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C17H15O6S 347.0589；实测值为347.0578。

3.1.3

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基2,4,6-三甲基苯-1-磺酸盐（3）

白色结晶固体，熔点163–165 °C；产率：68%；FTIR（cm?1）：3334, 2968, 1731, 1603, 1492, 1364, 1187, 661；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.56 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar–H), 7.09 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 7.00 (s, 2H, Ar–H), 6.83 (d, J = 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.26 (s, 1H, H-3), 2.58 (s, 6H, –CH3-2′,6′), 2.41 (s, 3H, –CH3-4′), 2.34 (s, 3H, –CH3-4)；13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 160.2, 153.9, 151.8, 151.6, 144.5, 140.4, 132.1, 130.1, 125.7, 118.8, 118.7, 115.0, 110.6, 22.8, 21.2, 18.7；[M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C19H19O5S 359.0953；实测值为359.0947。

3.1.4

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基2,5-二氯苯-1-磺酸盐（4）

白色结晶固体，熔点182–184 °C；产率：81%；FTIR（cm?1）：3092, 2849, 1701, 1602, 1498, 1380, 1275, 1102, 709；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.92 (d, J = 1.2 Hz, 1H, Ar–H), 7.73–7.43 (m, 3H, Ar–H), 7.19 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H, Ar–H), 7.06 (d, J = 2.4 Hz, 1H, Ar–H), 6.28 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-3), 2.41 (d, J = 1.3 Hz, 3H, –CH3)；13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 160.0, 154.1, 151.7, 151.0, 135.7, 134.5, 133.7, 133.6, 132.2, 131.7, 126.2, 119.4, 118.4, 115.5, 110.8, 18.9；[M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C16H11Cl2O5S 384.9704；实测值为384.9692。

3.1.5

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基4-氯苯-1-磺酸盐（5）

白色结晶固体，熔点166–168 °C；产率：86%；FTIR（cm?1）：3366, 3079, 1721, 1607, 1470, 1372, 1251, 1198, 627；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.85–7.76 (m, 2H, Ar–H), 7.58 (d, J = 8.7, 1H, Ar–H), 7.54 (dd, J = 8.7, 1.0 Hz, 2H, Ar–H), 7.06 (dt, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H, Ar–H), 6.94 (d, J = 2.1 Hz, 1H, Ar–H), 6.29 (s, 1H, H-3), 2.42 (s, 3H, –CH3)；13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 159.9, 154.0, 151.6, 151.2, 141.7, 133.4, 133.7, 133.6, 132.2, 131.7, 126.2, 119.4, 118.4, 115.5, 110.8, 18.9；[M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C16H12ClO5S 351.0094；实测值为351.0078。

3.1.6

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基2-甲基苯-1-磺酸盐（6）

白色结晶固体，熔点133–135 °C；产率：76%；FTIR（cm?1）：3062, 1732, 1605, 1490, 1372, 1056, 699；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.83 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H, Ar–H), 7.61–7.51 (m, H-5, 2H, Ar–H), 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 1H, Ar–H), 7.34–7.28 (m, 1H, Ar–H), 7.09 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H, Ar–H), 6.87 (d, J = 2.4 Hz, 1H, Ar–H), 6.27 (d, J = 1.4 Hz, 1H, H-3), 2.79 (s, 3H, –CH3-6′), 2.41 (d, J = 1.4 Hz, 3H, –CH3-4)；13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 160.1, 153.9, 151.7, 151.5, 138.8, 134.7, 133.7, 132.9, 130.5, 126.5, 125.8, 118.9, 118.6, 115.1, 110.6, 20.5, 18.7；[M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C17H15O5S 331.0640；实测值为331.0629。

3.1.7

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基2-氯苯-1-磺酸盐（7）

白色结晶固体，熔点151–153 °C；产率：79%；FTIR（cm?1）：3094, 1714, 1608, 1345, 1189, 663；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.96 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H, Ar–H), 7.66 (dd, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H, Ar–H), 7.65–7.59 (m, 1H, Ar–H), 7.57 (d, J = 8.8 Hz, 1H, Ar–H), 7.43–7.37 (m, 1H, Ar–H), 7.05 (d, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H, Ar–H), 6.28 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-3), 2.41 (d, J = 1.3 Hz, 3H, –CH3); 13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 160.0, 155.0, 151.6, 151.2, 135.6, 133.4, 133.7, 132.9, 132.4, 127.3, 125.9, 119.1, 118.5, 115.2, 110.7; [M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C16H12ClO5S 351.0094；实测值为351.0086。

3.1.8

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基萘-2-磺酸盐（8）

白色结晶固体，熔点162–164 °C；产率：84%；FTIR（cm?1）：3289, 1696, 1525, 1360, 1243, 1162, 627；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 8.42 (d, J = 1.9 Hz, 1H, Ar–H), 8.03 (d, J = 8.8 Hz, 1H, Ar–H), 7.99–7.92 (m, 2H, Ar–H), 7.86 (dd, J = 8.8, 1.9 Hz, 1H, Ar–H), 7.76–7.70 (m, 1H, Ar–H), 7.68–7.61 (m, 1H, Ar–H), 7.53 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar–H), 7.09 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.93 (d, J = 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.25 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-3), 2.39 (d, J = 1.3 Hz, 3H, –CH3); 13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 160.0, 153.9, 151.6, 151.5, 135.6, 131.7, 131.7, 130.6, 130.0, 129.9, 129.5, 128.2, 128.1, 125.8, 122.6, 118.9, 118.7, 115.2, 111.0, 18.7; [M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C20H15O5S 367.0640；实测值为367.0628。

3.1.9

4-甲基-2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基4-乙酰胺环己-2,4-二烯-1-磺酸盐（9）

白色结晶固体，熔点214–216 °C；产率：73%；FTIR（cm?1）：3390, 3079, 1696, 1493, 1372, 1275, 1088, 705；1H NMR（600 MHz, CDCl3）δ 7.81 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar–H), 7.74 (d, J = 8.8 Hz, 2H, Ar–H), 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar–H), 7.49 (s, 1H, NH), 7.13 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.86 (d, J = 2.3 Hz, 1H, Ar–H), 6.30 (d, J = 1.5 Hz, 1H, H-3), 2.44 (s, 3H, –COCH3), 2.13 (s, 3H, –CH3); 13C NMR（151 MHz, CDCl3）δ 168.6, 160.1, 153.8, 151.7, 151.5, 143.6, 130.0, 129.0, 125.7, 119.1, 119.0, 118.8, 115.1, 111.0, 24.8, 18.7; [M + H]+的准确质量（ESI）：计算值为C18H16NO6S 374.0698；实测值为375.0786。

3.2. 胆碱酯酶抑制活性

九种化合物（1-9）在低纳摩尔范围内对AChE和BChE表现出强烈的抑制作用。AChE的IC50范围从6.476 nM到53.307 nM，而BChE的IC50范围从11.948 nM到53.307 nM（表1）。重要的是，有几种类似物（例如2、3和6）对这两种酶的抑制作用比参考抑制剂塔克林更强。化合物3显示出平衡的双重抑制特性，其IC50（AChE）/IC50（BChE）比率约为0.54，而化合物2显示出类似的趋势（SI ≈ 0.75）。相比之下，化合物5的IC50比率约为2.6，表明在这一系列中相对更倾向于抑制BChE。数据显示，最有效的胆碱酯酶抑制剂是那些具有4-甲基香豆素-7-芳基磺酸盐骨架的化合物（图3）。此外，对芳基磺酸基团的微小改变会显著影响活性。进行了详细的结构-活性关系（SAR）评估，以研究取代基对芳香环的影响。表1

合成化合物（1-9）对AChE和BChE活性的抑制作用

化合物
IC50 (nM) AChE
R2
IC50 (nM) BChE
R2

1
43.312
0.978
36.473
0.972

2
13.075
0.984
17.325
0.978

3
6.476
0.958
11.948
0.996

4
28.875
0.989
30.130
0.985

5
53.307
0.997
20.382
0.981

6
19.250
0.993
18.236
0.999

7
31.500
0.973
46.200
0.970

8
27.720
0.995
53.307
0.981

9
33.000
0.994
49.500
0.993

Tacrinea
30.130
0.981
40.764
0.968

a
用作AChE和BChE酶的阳性对照。图3

化合物3的IC50图，其对AChE和BChE的抑制作用最强。

3.2.1

对位取代基的电子效应

对位取代的衍生物（1、2、5和9）都表现出一个明确的趋势，即这些基团的电子供体性质增强了AChE的抑制作用。在p-甲氧基衍生物2中观察到了最低的IC50 AChE和BChE值（分别为13.075 nM和17.325 nM）。相比之下，强吸电子的p-氯代类似物5在该系列中对AChE的抑制作用最弱（IC50 = 53.307 nM）。p-溴代化合物1和p-乙酰胺基化合物9的AChE抑制作用介于两者之间（IC50 = 43,312 nM和33,000 nM）。p-乙酰胺基（9）作为双氢键供体和受体，其AChE抑制作用为33 nM，虽然比卤代类似物强，但仍然比p-OMe弱2.5倍。与观察结果一致，当p-甲氧基（2）取代p-氯代时，AChE的抑制作用显著增强（从53.307 nM提高到13.075 nM），BChE的抑制作用也有所改善（从20.382 nM提高到17.325 nM）。相反，用p-氯代取代供体基团（5）后，其对AChE的抑制作用减弱。BChE活性的影响顺序与AChE不同，表明它们的结合要求相似但不完全相同。p-甲氧基化合物（2）对BChE的抑制作用仍然非常有效，IC50为17.325 nM，而p-氯代化合物5对BChE的抑制作用也接近（20.382 nM），尽管在AChE生物测定中表现最弱。化合物5对BChE的抑制作用是AChE的2.6倍，这是该系列中的独特选择性模式。p-溴代类似物1（BChE IC50 = 36.473 nM）对BChE的抑制作用比p-氯代类似物弱。化学三维结构（9）对BChE的活性略有降低（IC50 = 49.500 nM），表明通常用于描述化学结构的周围甲氧基官能团可能无法被BChE结合位点有效利用。总之，p-OMe和p-Cl取代基对BChE的抑制作用最有效，而p-Br和p-乙酰胺基的效果较差。

3.2.2 正位取代基的位置和立体效应

苯磺酸环的正位取代基对活性有显著影响，通常会增强对AChE的抑制作用，有时也会增强对BChE的抑制作用。在这个系列中，即使添加一个正位取代基也能改善AChE的抑制效果，相比类似的对位取代或未取代的系统。例如，7（2-氯苯磺酸）对AChE的抑制作用更强（IC50 = 31.500 nM），而5（4-氯苯磺酸）的抑制作用较弱（IC50 = 53.307 nM）。同样，6（2-甲基苯磺酸）对AChE的抑制作用明显更强（IC50 = 19.250 nM），优于对位取代的卤代类似物。通过比较二氯代类似物4（2,6-二氯苯）和单氯代类似物，可以清楚地看到正位取代的增强效果：4对AChE的抑制作用为IC50 = 28.875 nM，优于7（31.500 nM, 2-Cl）和5（53.307 nM, 4-Cl）。更显著的例子是3，它在2和6位置有两个正位甲基，并且在苯环上还有一个对位甲基（2,4,6-三甲基苯或间甲苯基取代基）。3是该系列中最有效的化合物，其AChE抑制作用IC50为6.476 nM，BChE抑制作用IC50为11.948 nM。与单个正位甲基化合物6（AChE IC50 = 19.250 nM）相比，3的抑制作用大约强3倍。化合物3的AChE IC50（6.476 nM）大约是塔克林的五分之一，表明其酶结合非常紧密，可能涉及催化位点和通过其扩展的芳香系统的周围位点。值得注意的是，正位取代基的性质（供电子 vs. 吸电子）决定了是优先抑制AChE还是BChE。p-甲氧基化合物（2）对BChE的抑制作用也非常有效，IC50为17.325 nM，而p-氯代化合物5对BChE的抑制作用也接近（20.382 nM），尽管在AChE生物测定中表现最弱。化合物5对BChE的抑制作用是AChE的2.6倍，这是该系列的独特选择性模式。p-溴代类似物1（BChE IC50 = 36.473 nM）对BChE的抑制作用比p-氯代类似物弱。化学三维结构（9）对BChE的活性略有降低（IC50 = 49.500 nM），表明通常用于描述化学结构的周围甲氧基官能团可能无法被BChE结合位点有效利用。总之，p-OMe和p-Cl取代基对BChE的抑制作用最有效，而p-Br和p-乙酰胺基的效果较差。

3.2.2 正位取代基的位置和立体效应

苯磺酸环正位上的取代基对活性有显著影响，通常会增强对AChE的抑制作用，有时也会增强对BChE的抑制作用。在这个系列中，即使只添加一个正位取代基，也能改善AChE的抑制效果，相比类似的对位取代或未取代的系统。例如，7（2-氯苯磺酸）对AChE的抑制作用（IC50 = 31.500 nM）比5（4-氯苯磺酸，IC50 = 53.307 nM）更强。同样，6（2-甲基苯磺酸）对AChE的抑制作用（IC50 = 19.250 nM）也明显强于对位取代的卤代类似物。通过比较二氯代类似物4（2,6-二氯苯）和单氯代类似物，可以清楚地看到正位取代的增强效果：4对AChE的抑制作用IC50 = 28.875 nM，优于7（31.500 nM, 2-Cl）和5（53.307 nM, 4-Cl）。更显著的例子是3，它在2和6位置有两个正位甲基，并且在苯环上还有一个对位甲基（2,4,6-三甲基苯或间甲苯基取代基）。3是该系列中最有效的化合物，其AChE抑制作用IC50 = 6.476 nM，BChE抑制作用IC50 = 11.948 nM。与单个正位甲基化合物6（AChE IC50 = 19.250 nM）相比，3的抑制作用强约3倍。化合物3的AChE IC50（6.476 nM）大约是塔克林的五分之一，表明其酶结合非常紧密，可能涉及催化位点和通过其扩展的芳香系统的周围位点。值得注意的是，正位取代基的性质（供电子 vs. 吸电子）决定了是优先抑制AChE还是BChE。例如，带有正位甲基的化合物6（供电子）对BChE的抑制作用（IC50 = 18.236 nM）与对AChE的抑制作用（IC50 = 19.250 nM）大致相等或略强。在我们的系列中，含有萘基的化合物8具有一个庞大的多环芳香环（萘-1-磺酸），而不是苯。化合物8是一个强效的AChE抑制剂（IC50 = 27.720 nM，与其他单取代苯类似物相当），但它是该系列中最弱的BChE抑制剂（IC50 = 53.307 nM）。

3.2.3 疏水性和体积

结构-活性关系（SAR）研究也强调了疏水性体积对AChE和BChE抑制的重要性。在大多数情况下，只有通过增加取代基的疏水性到一定程度，才能最大化抑制作用。最有效的类似物（3、2和6）含有大的、高度疏水的基团（分别是间甲苯基、茴香醚基和甲苯基）。化合物3（间甲苯基）在该系列中表现出最高的活性。相比之下，含有更极性取代基（乙酰胺基）的化合物9，其IC50值高于更疏水的类似物。

3.3 诱导契合对接研究

所有合成的香豆素衍生物都以低纳摩尔级的IC50值抑制了AChE和BChE，其中几种化合物在至少一项酶活性测定中的表现优于参考药物塔克林，表明这种化学类型具有很高的内在抑制潜力。其中最有效的双重抑制剂是化合物3（AChE IC50 = 6.476 nM；BChE IC50 = 11.948 nM），其次是化合物2和6，化合物5和8的抑制作用处于较低范围，尽管它们也在纳摩尔范围内。这一趋势主要用于解释计算机模拟结果，而不是用于定量关联。诱导契合对接（IFD）的计算显示所有衍生物在AChE和BChE活性位点的结合得分都相当有利，建立了强烈的抑制谱型。AChE的对接得分范围从-9.423到-14.310 kcal mol?1，其中9的得分最高，为-14.310 kcal mol?1，高于塔克林的-13.337 kcal mol?1，表明在催化沟槽内的结合非常优化。化合物8基于其占据BChE沟槽的能力表现出有希望的谱型，这是已知抗胆碱酯酶（如塔克林）的一个充分利用的特性（-7.370 kcal mol?1）。在BChE对接中，香豆素骨架能够合理地适应BChE较宽的沟槽（表2）。在这种情况下获得的对接得分范围从-8.076到-10.632 kcal mol?1，其中8的得分最高（-10.632 kcal mol?1）。

总结：诱导契合对接得分和Prime/MM-GBSA衍生的结合自由能对于高活性香豆素基酶抑制剂

化合物 AChE BChE
IFD对接得分（kcal mol?1） MM-GBSA ΔGbind（kcal mol?1）
IFD对接得分（kcal mol?1） MM-GBSA ΔGbind（kcal mol?1）

1 -9.423 -61.51 -8.076 -59.42
2 -10.287 -70.83 -9.212 -63.14
3 -9.874 -87.29 -8.832 -76.45
4 -9.843 -65.57 -8.959 -61.77
5 -9.642 -49.34 -8.380 -65.82
6 -9.458 -65.62 -8.926 -69.25
7 -9.937 -60.75 -9.445 -58.62
8 -11.024 -60.13 -10.632 -53.06
9 -14.310 -67.57 -10.137 -53.00

随后使用Prime MM-GBSA计算通过ΔGbind值提供了蛋白质-配体复合物热力学稳定性的能量评估，以进一步完善对接结果。分析显示化合物3与两种酶的结合稳定性最高，因为其产生的结合自由能分别为AChE的-87.29 kcal mol?1和BChE的-76.45 kcal mol?1。结果表明，类似物3产生了最佳的对接得分，因为其非键合相互作用优化和总焓效应比初始对接期间发生的小变化更为重要。系列中的所有衍生物，包括2、4、6和9，其ΔGbind值达到了危险的-70.83至-67.57 kcal mol?1水平，证明该系列中的多种化合物形成了稳定的热力学关联。低对接得分，特别是对于3，产生了非常有利的MM-GBSA能量，与实验确定的抑制潜力高度相关，证实了所提出的结合模型是准确的。图4A中的化合物3与AChE复合物的二维相互作用图显示了一个明确的结合模式，该模式同时涉及催化活性位点（CAS）和周围阴离子位点（PAS），这是有效双重位点AChE抑制剂的特点。芳香族香豆素核心与各种π–π堆叠相互作用，特别是与PHE330和TYR121的相互作用，同时TRP84与配体的芳香部分也发生了堆叠相互作用。3与酶活性位的相互作用，加上它们在酶沟槽中的深度结合，通过分散力创造了强大的结合稳定性。香豆素环的羰基氧与PHE288骨架形成了氢键，作为化合物的中心氢键。磺酰氧原子作为氢键受体，与GLY118相互作用以增强结合。极性接触与疏水相互作用的结合形成了一个紧凑的相互作用网络，防止配体移动，同时保持附着状态。极性基团在深疏水区域外的排列减少了脱溶成本，这解释了3在AChE中预测的非常正的ΔGbind结果。图4A中显示的结合模式解释了3的强预测亲和力及其高实验抑制结果。

化合物3在AChE（A）和BChE（B）中的三维对接构象（左侧面板）以及相应的二维配体-受体相互作用图（右侧面板）。BChE活性位点显示了一个二维相互作用模式，该模式识别了三个元素，这些元素符合AChE的关键特征，同时也展示了为了适应BChE沟槽所做的改变，BChE沟槽具有更大的尺寸和更高的灵活性。香豆素环系统再次与催化口袋的残基建立了氢键相互作用，特别是与THR122和TYR128的相互作用。磺酰氧原子作为氢键受体，与GLY116和GLH197相互作用，从而为中央骨架结构提供了额外的支持。活性位点腔包含氢键和疏水相互作用，这些相互作用在其空间中延伸，因为BChE具有更大的活性位点结构，这解释了-76.45 kcal mol?1的ΔGbind值的非负但仍然非常有利。活性位点残基HIS438和3保持了π–π堆叠相互作用，尽管与AChE复合物中的堆叠相互作用较少或更远。3与BChE的实验和计算亲和值显示，与AChE相比，其对BChE的结合减弱。BChE结合腔与香豆素骨架的有效互补性表明，两个组分保持了稳定的极性接触，同时创建了一个广泛的疏水封闭空间。配体的上部沟槽区域表明取代基指向这一区域，使3能够同时达到催化和周围的BChE位点，有助于调节神经退行性疾病中的胆碱酯酶活性。

3.4 分子动力学模拟

3-AChE和3-BChE复合物的250纳秒分子动力学（MD）轨迹证实，对接后的构象是由对接引起的，而不是由静态建模引起的。从二维（2D）配体-酶相互作用图（图5a和6a）生成的分子相互作用指纹显示，化合物3在AChE和BChE中的结合构象不同但互补，这是由于两种胆碱酯酶之间的结构和物理化学差异。在3-AChE复合物中，可以看到明显的氢键和芳香相互作用。磺酰基部分直接或通过水分子与ASP72、SER81和ASN85残基建立了持久的氢键，这些残基靠近催化阴离子位点（CAS），从而起到了中心锚定作用。已知与TYR334的π–π堆叠相互作用在配体稳定中起着重要作用，TYR334是AChE芳香沟槽的关键残基。与PHE331、PHE330和TRP84的更多疏水相互作用稳定了配体在酶活性沟槽中的位置，3与CAS和周围芳香位点的结合良好。高占据率的水桥的存在表明了一种溶剂辅助的稳定机制，通常适用于高亲和力的AChE抑制剂。相比之下，3-BChE复合物的结合谱型主要由氢键形成和疏水封闭决定，这与更宽和更灵活的BChE活性位点相符。配体与GLY116、THR122、TYR128和GLU197形成了高度持久的氢键，相互作用占据率超过85–90%。3的芳香中心还与TRP82发生了π–π相互作用，TRP82是BChE底物识别中的关键残基。与AChE复合物相比，由水介导的相互作用不太显著，表明3主要通过接触与酶稳定。

3-AChE和3-BChE复合物的250纳秒分子动力学（MD）轨迹证实，对接后的构象是由对接引起的，而不是由静态建模引起的。从二维（2D）配体-酶相互作用图（图5a和6a）生成的分子相互作用指纹显示，化合物3在AChE和BChE中的结合构象不同但互补，这是由于两种胆碱酯酶之间的结构和物理化学差异。在3-AChE复合物中，可以看到明显的氢键和芳香相互作用。磺酰基部分直接或通过水分子与ASP72、SER81和ASN85残基建立了持久的氢键，这些残基靠近催化阴离子位点（CAS），从而起到了中心锚定作用。已知与TYR334的π–π堆叠相互作用在配体稳定中起着重要作用，TYR334是AChE芳香沟槽的关键残基。与PHE331、PHE330和TRP84的更多疏水相互作用稳定了配体在酶活性沟槽中的位置，3与CAS和周围芳香位点的结合良好。高占据率的水桥表明了一种溶剂辅助的稳定机制，通常适用于高亲和力的AChE抑制剂。相比之下，3-BChE复合物的结合谱型主要由氢键形成和疏水封闭决定，这与更宽和更灵活的BChE活性位点相符。配体与GLY116、THR122、TYR128和GLU197形成了高度持久的氢键，相互作用占据率超过85–90%。3的芳香中心还与TRP82发生了π–π相互作用，TRP82是BChE底物识别中的关键残基。与AChE复合物相比，3与BChE的实验和计算亲和值显示，3与BChE的结合减弱。BChE结合腔与香豆素骨架的有效互补性表明，两个组分保持了稳定的极性接触，同时创建了一个广泛的疏水封闭空间。配体的上部沟槽区域表明取代基指向这一区域，使3能够同时达到催化和周围的BChE位点，有助于调节神经退行性疾病中的胆碱酯酶活性。

3.4 分子动力学模拟

3-AChE和3-BChE复合物的250纳秒分子动力学（MD）轨迹证实，对接后的构象是由对接引起的，而不是由静态建模引起的。从二维（2D）配体-酶相互作用图（图5a和6a）生成的分子相互作用指纹显示，化合物3在AChE和BChE中的结合构象不同但互补，这是由于两种胆碱酯酶之间的结构和物理化学差异。在3-AChE复合物中，可以看到明显的氢键和芳香相互作用。磺酰基部分直接或通过水分子与ASP72、SER81和ASN85残基建立了持久的氢键，这些残基靠近催化阴离子位点（CAS），从而起到了中心锚定作用。已知与TYR334的π–π堆叠相互作用在配体稳定中起着重要作用，TYR334是AChE芳香沟槽的关键残基。与PHE331、PHE330和TRP84的更多疏水相互作用稳定了配体在酶活性沟槽中的位置，3与CAS和周围芳香位点的结合良好。高占据率的水桥表明了一种溶剂辅助的稳定机制，通常适用于高亲和力的AChE抑制剂。相比之下，3-BChE复合物的结合谱型主要由氢键形成和疏水封闭决定，这与更宽和更灵活的BChE活性位点相符。配体与GLY116、THR122、TYR128和GLU197形成了高度持久的氢键，相互作用占据率超过85–90%。3的芳香中心还与TRP82发生了π–π相互作用，TRP82是BChE底物识别中的关键残基。与AChE复合物相比，3与酶的相互作用不那么显著，表明3主要通过接触与酶稳定。交互作用模式表明3与BChE结合口袋的适应性更加紧密和具体。均方根偏差（RMSD）曲线（图5b和6b）显示了在250纳秒分子动力学模拟期间酶-配体复合物的总体稳定性。在3-AChE系统中，蛋白质主链的RMSD在初始平衡后稳定在约1.2-1.5埃。这表明酶在整个模拟过程中保持结构稳定。配体（蛋白质拟合）的RMSD值在0.6到1.0埃之间，表明其具有适度的构象灵活性，但仍然牢固地结合在活性位点上。配体拟合系统的RMSD显示配体的内部重排最小，并且具有明确且稳定的结合模式。3-BChE复合物的蛋白质RMSD值略高于AChE，稳定在约1.4-1.6埃。这一观察结果是可以预期的，因为BChE比AChE更灵活。在大部分模拟过程中，配体的RMSD显著低于0.5埃，表明配体一旦结合就非常稳定。由于3很好地适应了活性位点，因此在BChE活性位点上的位置调整很少。Cα原子的均方根波动（RMSF）分析（见SI文件中的图1c和2c）显示了由于配体引起的局部灵活性变化。3-AChE复合物中的大多数残基的RMSF值小于1.0埃，表明整体上具有刚性。远离结合位点的环的波动略有增加，而直接参与配体结合的残基，例如RP84、ASP72、SER81和PHE330，则表现出显著的刚性。根据分析，关键催化和芳香族残基的稳定表明3似乎减少了局部灵活性和底物的进入及转化。3-BChE系统的整体RMSF模式与香豆素磺酸盐-AChE和-BChE系统相似，但在更外围区域的波动略高。这再次与BChE的固有灵活性一致。值得注意的是，与3形成强氢键的残基（GLY116、THR122、TYR128和GLU197）的移动性降低，表明配体结合稳定了活性位点的结构。配体的RMSF曲线（见SI文件中的图1d和2d）进一步描绘了化合物3在结合口袋中的动态。化合物3在末端芳香族和取代基原子上有较大的振动，特别是对于那些没有通过强相互作用连接的原子。另一方面，与磺酰基连接器和中央芳香族主链相关的原子的RMSF值非常低，约为0.6-0.8埃。因此，它们在AChE中起到结构锚的作用。化合物3的整体配体RMSF值较低，大多小于0.7埃，表明其具有更刚性的结合构象。外围取代基的灵活性较低，而芳香族核心和氢键功能的稳定性较高。BChE复合物的低配体RMSD可能由于其刚性所致。交互作用分数直方图（见SI文件中的图1e）定量总结了模拟过程中配体-残基接触的稳定性和频率。3-AChE复合物中的氨基酸，如ASP72、TRP84、PHE330和TYR334，显示出高交互作用分数，这些分数由氢键、疏水作用和水桥共同贡献。3通过多种模式结合，并由于其特性而在AChE活性位点中停留时间较长。3-BChE复合物中氨基酸TRP82、GLY116、THR122、TYR128和GLU197的交互作用分数较大。这些交互作用通过氢键对接、疏水作用和其他方式发生。这些交互作用在整个轨迹中都没有消失，表明结合模式强且稳定，同时配体的灵活性低。因此，总体而言，分子动力学结果表明3非常适合抑制AChE，而3复合物在狭窄的芳香族口袋中的稳定是由于芳香族堆叠和溶剂辅助的氢键作用。BChE活性位点对3显示出更好的稳定性和交互作用持续时间，因为其较大的活性位点腔体允许直接形成氢键和疏水保护。结果表明，即使配体和酶活性位点的结构发生微小变化，也会导致不同的动态行为，这解释了为什么AChE和BChE选择不同的底物。RMSD和RMSF以及交互作用分析的结合提供了强有力的证据，证明化合物3在抑制AChE和BChE的同时保持稳定性，并显示出作为胆碱酯酶靶向治疗候选物的潜力。图5

250纳秒分子动力学分析的3-AChE复合物。(a) 代表性的二维配体-蛋白质交互作用图和(b) 蛋白质Cα原子的RMSD曲线（浅蓝色）。图6

250纳秒分子动力学分析的3-BChE复合物。(a) 代表性的二维配体-蛋白质交互作用图和(b) 蛋白质Cα原子的RMSD曲线（浅蓝色）。

3.5. 药物代谢动力学（ADME）和药物相似性分析

计算机模拟的ADME预测表明，这些香豆素衍生物通常具有有利的药物特性，适用于中枢神经系统（CNS）应用。所有化合物都符合Lipinski的五规则和三规则，没有违反任何规则，表明分子量、亲脂性、氢键供体/受体和极性之间有适当的平衡。分子量大约在330到395道尔顿之间，没有氢键供体，但有7-9.5个受体，这些受体共同支持良好的膜通透性，同时保持足够的极性表面以实现溶解性和靶标识别。大多数衍生物的预测人体口服吸收值很高，通常超过83%，特别是3（90.187%）和8（89.571%），而只有9（72.158%）落在较低但仍然可接受的吸收范围内。QPPCaco和QPPMDCK值表明这些化合物具有良好的肠道通透性，表明它们具有良好的口服吸收潜力，同时保持整体上可接受的通透性。3和6的Caco-2通透性值异常高，分别为623.662和533.505，这证实了它们的优化logP值为2.257到1.681。预测的QPlogBB值通常在-1.0到0.3之间，对于具有穿越血脑屏障潜力的化合物而言，而低于-1.0的值通常与较差的脑部渗透性相关。在本研究中，所研究化合物的QPlogBB值（-0.68到-1.68）表明总体上的血脑屏障渗透性有限到中等。值得注意的是，化合物3（QPlogBB = -0.837）处于中间范围，表明其具有相对有利的血脑屏障穿透平衡，并有潜力到达中枢神经系统。QPlogHERG值保持在范围内，表明hERG通道阻断不会构成急性威胁，与传统的胆碱酯酶抑制剂相比，这降低了心脏毒性的风险。ADME描述符的结合以及与AChE和BChE的强而稳定的结合使得3及其香豆素衍生物成为有前途的先导化合物开发候选者，这些化合物将在阿尔茨海默病研究中进一步改进和测试（表3）。表3

预测的香豆素衍生物化合物的ADME（吸收、分布、代谢和排泄）特性

化合物
分子量
氢键供体
氢键受体
QP logPo/w
QP logS
QP logHERG
QPPCaco
QP logBB
QPPMDCK
人体口服吸收百分比
五规则
三规则

1
395.224
0.000
7.000
2.037
-3.577
-5.826
416.621
-0.867
509.059
85.760
0
0

2
346.354
0.000
7.750
1.466
-2.537
-5.526
499.609
-0.986
233.956
83.831
0
0

3
358.408
0.000
7.000
2.257
-3.620
-5.208
623.662
-0.837
296.971
90.187
0
0

4
385.218
0.000
7.000
2.261
-3.698
-5.369
438.959
-0.680
986.029
87.476
0
0

5
350.773
0.000
7.000
1.964
-3.256
-5.607
499.621
-0.756
576.628
86.744
0
0

6
330.355
0.000
7.000
1.681
-2.803
-5.492
533.505
-0.873
251.947
85.596
0
0

7
350.773
0.000
7.000
1.783
-2.912
-5.522
500.697
-0.790
416.500
85.704
0

8
366.388
0.000
7.000
2.446
-3.805
-6.363
499.894
-0.971
234.098
89.571
0

9
373.380
1.000
9.500
1.174
-3.545
-5.938
138.705
-1.677
58.486
72.158
0

4. 结论

在这项研究中，通过Pechmann缩合从4-甲基-7-羟基香豆素开始，随后与各种芳基磺酰氯进行磺酰化，成功合成了一系列新型的基于香豆素的磺酸酯（1-9）。合成的化合物通过红外光谱（IR）和核磁共振光谱（NMR）以及它们的物理性质进行了表征。生物学评估显示，所有化合物都对AChE和BChE表现出显著的抑制活性，IC50值在低纳摩尔范围内。其中，化合物3作为最有效的双重抑制剂脱颖而出（IC50 = 6.476 nM针对AChE和11.948 nM针对BChE）。结构-活性关系（SAR）分析表明，取代基在苯环上的电子性质、空间大小和位置取向影响抑制效力。计算研究为配体-酶相互作用提供了支持性见解。诱导契合对接表明在酶的活性口袋内有有利的结合取向，而分子力学-广义Bornstein-Sternberg分析（MM-GBSA）计算和分子动力学模拟表明配体-酶复合物随时间稳定。此外，计算机模拟的ADME分析预测了合成化合物的有利药代动力学特性，包括符合Lipinski的五规则和可接受的血脑屏障穿透性，且没有显著的预测心脏毒性风险。因此，综合合成、生物学和计算发现表明基于香豆素的芳基磺酸酯衍生物是胆碱酯酶抑制的有希望的骨架。特别是化合物3代表了进一步结构优化和未来研究的宝贵先导。

作者贡献

Ehsan Ullah Mughal：概念化、监督、验证、研究、资源获取、数据管理、初稿撰写、审阅与编辑、可视化、项目管理、资金获取。Nafeesa Naeem：数据收集、可视化、验证、正式分析、研究、初稿撰写、审阅与编辑。Aneela Shaheen Cheema：实验工作执行。Gehan Ahmed Othman：傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析、正式分析、研究。Amina Sadiq：正式分析、研究。Songül Bayrak：生物学和计算研究、初稿撰写。Nam?k K?l?n?：生物学和计算研究、初稿撰写。Mohammed B. Hawsawi：核磁共振（NMR）分析。SM Gomha：正式分析、研究。Züleyha Almaz：生物学和计算研究、初稿撰写。利益冲突

作者没有需要声明的利益冲突。数据可用性

所有数据都在手稿和补充信息（SI）中提供。补充信息可获取。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra02535h。致谢

作者感谢King Khalid大学的研究与研究生院通过大型研究项目（项目编号RGP2/370/46）资助这项工作。参考文献