通过基于透明质酸的纳米平台将吉西他滨精准递送至肺癌细胞

《RSC Advances》：Targeted delivery of gemcitabine to lung cancer cells via a hyaluronic acid-based nanoplatform

为了减轻吉西他滨（GEM）在肺癌治疗中的剂量限制性毒性，我们开发了一种基于透明质酸（HA）的靶向纳米平台，该平台具有持续释放药物的能力——GEM@HA-(HAP/PSI)。该系统由羟基磷灰石/聚琥珀酰亚胺（HAP/PSI）复合核心组成，用于高效荷载药物，表面共轭的HA作为CD44靶向配体。通过使用响应面方法进行系统优化后，所得到的球形纳米颗粒（约100–200纳米）表现出pH响应性药物释放、良好的生物相容性和可忽略的溶血活性。使用CD44高表达的A549细胞和CD44低表达的H358细胞进行的体外研究证实，CD44介导的主动内吞作用是该纳米平台的主要摄取途径。与非靶向对照配方相比，用优化配方（GEM@HA-(HAP/PSI)10处理后，显示出显著更高的细胞毒性、细胞迁移和菌落形成的抑制以及凋亡诱导。重要的是，在A549异种移植小鼠模型中，GEM@HA-(HAP/PSI)10在抑制肿瘤生长方面优于游离的GEM，同时保持了良好的安全性。总体而言，这些发现表明，本研究开发的HA靶向纳米平台提高了GEM的递送精度和治疗效果，并有望降低其全身毒性。

1. 引言

肺癌仍然是全球重要的公共卫生挑战。根据国际癌症研究机构（IARC）发布的2022年全球癌症统计（GLOBOCAN），癌症导致全球约967万人死亡，约为2.5亿人的寿命损失。值得注意的是，中国承受着这种疾病最重的负担，肺癌在所有癌症类型中发病率（106万新病例）和死亡率（733,300例）最高。目前肺癌的临床管理策略包括手术切除、靶向治疗、免疫治疗、化疗和放疗。对于早期疾病患者，手术可以提供40–80%的5年生存率。然而，由于肺癌的隐匿性发作，大约70%的患者在局部晚期或转移阶段被诊断出来，此时治愈性手术通常不再可行。在晚期疾病的情况下，全身药物治疗仍然是主要的治疗策略。尽管靶向药物最初对符合条件的患者有效，但几乎不可避免地会出现治疗耐药性。因此，化疗仍然是大多数晚期肺癌患者的核心治疗手段，以控制肿瘤进展和延长生存期。传统化疗的一个主要限制是缺乏选择性，这往往会导致健康组织的严重损害、剂量限制性毒性以及药物耐药性的产生和治疗的频繁中断。因此，迫切需要开发高效、特异性强、安全且可临床转化的药物递送系统。这样的平台可以实现化疗药物的精确细胞内递送，从而最小化脱靶效应，降低所需剂量，提高治疗效果，并可能加速抗癌药物的开发。纳米技术为解决这些挑战提供了有希望的解决方案。基于纳米载体的药物递送系统（NDDSs）在生物医学领域受到了广泛关注，因为它们能够促进靶向递送和可控的药物释放。纳米材料的高表面积与体积比使其能够与靶向配体功能化，从而提高肿瘤选择性。通过封装、吸附和结合治疗剂，NDDSs可以提高难溶药物的生物利用度，并通过增强通透性和保留效应（EPR）促进其在肿瘤组织中的优先积累，最终改善治疗效果同时减少全身毒性。此外，NDDSs可以通过绕过外排泵、靶向癌干细胞（CSCs）和调节肿瘤微环境来帮助克服多重耐药性（MDR）——这是化疗失败的主要因素之一。由于这些进展，NDDSs正成为临床肿瘤学的变革性工具，推动靶向治疗、联合治疗策略和早期癌症诊断的进步。

NDDSs的靶向策略大致可以分为被动式、主动式或刺激响应式。被动靶向利用EPR效应，即纳米载体优先通过肿瘤组织的渗漏血管流出，并因淋巴引流不足而滞留。然而，EPR效应存在显著的肿瘤内和肿瘤间异质性，且肿瘤内的高压间质液会阻碍纳米载体的深入渗透。为了克服这些限制，开发了主动靶向策略。这些策略涉及将纳米载体与靶向配体（例如抗体、肽或多糖）功能化，这些配体选择性地结合到癌细胞上过度表达的受体上。随后，配体-受体相互作用促进受体介导的内吞作用和细胞内药物释放，从而提高肿瘤特异性和细胞内积累，同时最小化健康组织的摄取。在潜在目标中，CD44受体是一种跨膜糖蛋白，已成为主动递送的有希望的目标。CD44在多种癌症中过度表达，包括大多数肺癌，并在肿瘤发生、进展、转移和治疗耐药性中起关键作用。相比之下，在正常组织中，CD44的表达水平较低或功能不活跃。透明质酸（HA）是细胞外基质的主要成分，是CD44的天然配体，CD44–HA相互作用在肿瘤进展和转移中起着至关重要的作用。因此，HA修饰的纳米载体可以选择性结合到过度表达CD44的癌细胞上，促进肿瘤特异性药物递送，增强细胞内摄取，并减少脱靶毒性。此外，HA具有生物相容性、可生物降解性和非免疫原性，已在临床和实验应用中得到广泛应用，包括药物递送和生物医学成像。因此，通过HA靶向CD44不仅在药物递送方面具有很大的潜力，也在肿瘤成像和治疗诊断方面具有潜力。在本研究中，我们使用羟基磷灰石（HAP）和聚琥珀酰亚胺（PSI）作为核心材料，开发了一种基于HA的靶向NDDS。HAP是骨骼的主要无机成分，具有优异的生物相容性、生物活性和高药物载量能力。同时，PSI是一种无定形的、可生物降解的、无毒的聚合物，通过无溶剂聚缩合天冬氨酸合成，符合绿色化学原则。重要的是，PSI可以通过胺诱导的环开裂反应轻松功能化，从而引入靶向基团，同时保持可生物降解性。与传统的纳米载体（例如脂质体或聚合物胶束）相比，后者通常表现出低药物载量能力、复杂的合成过程、较差的胶体稳定性和放大瓶颈，HAP/PSI混合系统独特地结合了高药物载量、良好的生物相容性和简便的表面功能化。然而，现有的基于HAP/PSI的系统缺乏主动肿瘤靶向性，目前还没有研究利用透明质酸（HA）功能化在这种混合纳米颗粒上进行肺癌治疗。为了解决这一空白，我们的团队之前已经证明PSI及其衍生物（X-PSI）可以与HAP共组装形成具有高效药物载量的均匀纳米颗粒（HAP/PSI或X-(HAP/PSI)。在此基础上，本工作的核心思想是将HA——一种在肺癌细胞上过度表达的天然配体——与PSI结合，生成一种靶向聚合物（HA–PSI），然后与HAP共组装生成称为HA-(HAP/PSI)的核心-壳纳米颗粒。这种纳米平台装载了吉西他滨（GEM），这是一种一线肺癌化疗药物。GEM是一种核苷类似物，细胞内激活后抑制DNA合成并诱导凋亡。然而，其临床应用受到剂量限制性不良反应的限制，包括骨髓抑制和胃肠道毒性。我们假设GEM@HA-(HAP/PSI)系统将通过CD44介导的内吞作用增强GEM的肿瘤特异性递送，实现可控的细胞内药物释放，减少在健康组织中的非特异性分布，最终提高GEM在肺癌治疗中的治疗指数。

2. 材料与方法

2.1. 材料

所有化学品和试剂均为分析级或更高级别，按收到时的状态使用。Tween-80购自BioFroxx有限公司。丁酸乙酯、氯化钙、磷酸、碳酸钠、磷酸二氢钠、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二氯甲烷和乙腈分别从天津恒星化学试剂制造有限公司、哈尔滨试剂化学厂、天津天利化学试剂有限公司、天津博迪化学有限公司、天津富余精细化学有限公司和天津永达化学试剂有限公司获得。L-天冬氨酸由Aladdin有限公司提供。盐酸吉西他滨、溴化钾、1,6-己二胺和香豆素6从上海Macklin生化技术有限公司购买。透明质酸（HA，分子量约为3000 Da）从上海Eon化学技术有限公司购买。MES缓冲液、EDCI和NHS从上海 Yuanye 生物技术有限公司采购。用于细胞培养和体外研究，胎牛血清（FBS）从Sino Biological Inc.获得；胰蛋白酶、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、青霉素-链霉素（100×）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）、DAPI染色溶液、4%福尔马林固定剂和抗褪色 mounting 介质从Seven Innovation（北京）生物技术有限公司获得；RPMI 1640培养基来自Thermo Fisher Scientific Inc.；结晶紫染色剂、Hoechst 33342和DAPI来自Beyotime生物技术有限公司；Calcein-AM/PI双染色试剂盒来自Solarbio科学技术有限公司。内吞抑制剂氯丙嗪、吲哚美辛和秋水仙素从MedChemExpress购买。用于体内和组织学研究，2%的红细胞悬浮液由广州红泉生物技术有限公司提供；临床级别的盐酸吉西他滨注射液（批号：246962DP）来自Eli Lilly and Company；苏木精和伊红（H&E）染色试剂来自上海Titan Technology Co., Ltd.；无水乙醇、二甲苯、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和氯化钾由赛诺菲化学试剂有限公司提供；TUNEL凋亡检测试剂盒从Vazyme生物技术有限公司购买。

2.2. 动物和伦理声明

雄性BALB/c裸鼠（8周龄，20–25克）由Sibeifu（北京）生物技术有限公司提供，并在无特定病原体（SPF）条件下饲养。动物室维持在23 ± 3 °C的温度和30–70%的相对湿度下，12小时光照/黑暗周期，可自由获取标准啮齿动物饲料和水。所有动物程序均符合牡丹江医科大学的实验动物护理和使用指南，并得到牡丹江医科大学动物伦理委员会批准（批准编号IACUC-20251015-303）。

2.3. 方法

2.3.1. 辅料的合成

2.3.1.1. HAP和PSI的制备

HAP和PSI的合成方法根据我们之前的研究进行。

2.3.1.2. HA–PSI-conjugates的制备

2.3.1.2.1 HA–NH2的合成

将HA粉末（0.5克，约0.17毫摩尔，分子量约为3000 Da）溶解在20毫升MES缓冲液中，室温（约25 °C）下搅拌。然后依次加入EDCI（0.095克，0.495毫摩尔）和NHS（0.057克，0.495毫摩尔）。活化2小时后，加入1,6-己二胺（0.038克，0.33毫摩尔）。反应混合物在室温下连续搅拌24小时。然后将产物转移到透析袋（分子量：1000 Da）中，并用去离子水透析24小时以去除多余的试剂和缓冲盐。纯化后的溶液通过冻干（FDS-1000，Tokyo Rikakikai Co., Ltd）获得胺功能化的HA（HA–NH2）。

2.3.1.2.2 HA–NH2与PSI的结合

将PSI（基于重复单元–C4H3NO2?计算的分子量= 97.07）溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，浓度为6毫克/毫升。为了获得不同的HA与PSI的摩尔比，使用了不同量的PSI：0.03克（0.31毫摩尔）用于1:10的比例（称为HA–PSI10），0.06克（0.62毫摩尔）用于1:20的比例（HA–PSI20），以及0.12克（1.24毫摩尔）用于1:40的比例（HA–PSI40）。将HA–NH2（0.10克，约0.03毫摩尔）分别溶解在相应的PSI/DMF溶液中。混合物在65 °C下搅拌18小时。随后，每个反应混合物用去离子水透析（分子量：1000 Da）48小时以去除DMF。最终的水溶液通过冻干获得HA–PSI结合物，形成固体产物。其中，HA–PSI10显示出每条PSI链最多的HA整合量，而HA–PSI40显示出最低的整合量。

2.3.1.3. 特性分析

合成材料的化学结构通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱法使用Nicolet iS5光谱仪（Thermo Fisher, USA）进行表征。光谱记录在400–4000厘米^-1的范围内，分辨率为1厘米^-1。质子核磁共振（1H NMR）光谱在Avance NEO 400 MHz光谱仪（Bruker）上进行，使用二甲基亚砜-d6（DMSO-d6）作为溶剂。形态学检查使用扫描电子显微镜（SEM, S-4800，Hitachi High-Technologies Corporation）进行。同时，热稳定性通过热重分析（TGA）和衍生热重分析（DTG）在STA 449 F5 Jupiter仪器（NETZSCH）上进行，氮气氛围下（流速为10毫升/分钟），温度从30 °C以10 °C/分钟的速率升高到800 °C。晶体结构是通过X射线衍射（XRD）分析在XRD-7000衍射仪（岛津，日本）上评估的，使用Cu Kα辐射（λ = 1.5418 ?），并在2θ范围内从10°扫描到70°，扫描速率为5°·min?1。

2.3.2 GEM载药纳米递送系统的制备与优化

2.3.2.1 HA-(HAP/PSI)纳米球自组装的最佳比例确定

基于初步数据，使用不同的涂层材料（HA–PSI40、HA–PSI20或HA–PSI10）与核心材料（HAP）的质量比（6:1、8:1和10:1）制备了HA-(HAP/PSI)纳米制剂，以确定纳米球制备的最佳比例。首先将壳层形成材料（HA–PSI）溶解在DMF中，浓度为25 mg/mL，并在40 kHz的超声条件下获得透明溶液。另外，将HAP悬浮液制备在蒸馏水中。在室温下，将HA–PSI/DMF溶液逐滴滴加到HAP悬浮液中，并持续进行1000 rpm的磁力搅拌。加完后，将混合物以12,000 rpm的速度离心。收集到的颗粒用蒸馏水反复洗涤，然后进行8小时的冻干处理。通过SEM表征所得纳米颗粒的形态，以确定每种HA–PSI类型的适当质量比。

2.3.2.2 单因素实验

2.3.2.2.1 药物浓度对封装效率（EE）和药物装载容量（DLC）的影响

将HAP的浓度固定为5 mg/mL。同时，将GEM溶解在蒸馏水中，制备出5、10、20、30、40和50 mg/mL浓度的溶液。然后向每种药物溶液加入25 mg的HAP，通过超声处理（40 kHz，2分钟）使其混合均匀，然后静置10分钟。将混合物进行高速离心（12,000 rpm）。收集上清液，并用少量蒸馏水多次洗涤沉淀物。将洗涤液与上清液合并并稀释至固定体积。通过使用UV-2700i分光光度计（岛津）在350 nm处测量吸光度，并根据标准校准曲线（图S1）来确定溶液中未封装的GEM的浓度。每种条件重复测试三次。EE和DLC的计算公式如下：

EE (%) = (M1/M0) × 100

DLC (%) = M1/(M1 + M2) × 100

其中，M1是装载在载体中的GEM的质量，M0是添加的GEM的总质量，M2是空白载体的质量。

2.3.2.2.2 HAP浓度对EE和DLC的影响

将GEM的浓度固定为40 mg/mL。然后改变HAP的浓度，分别为1、2、3、5、8、10和15 mg/mL。按照上述方法处理混合物，并测定EE和DLC，以优化HAP的浓度范围。

2.3.2.3 吸附时间对EE和DLC的影响

在容量瓶中制备GEM溶液（40 mg/mL），然后加入HAP使其浓度达到5 mg/mL，随后通过超声处理（40 kHz，2分钟）使其混合均匀。进行10、20、40和60分钟的吸附。在每个时间点，对混合物进行离心，并按照上述方法对上清液中的GEM进行定量。计算EE和DLC，并对每个时间点的样本进行三次重复测试。

2.3.2.3 GEM@(HAP/PSI)和GEM@HA-(HAP/PSI)的制备与工艺优化

基于单因素实验的结果，采用了Box–Behnken设计（BBD）响应表面方法来优化GEM@(HAP/PSI)制剂。关键因素如下：药物浓度（30–50 mg/mL）、HAP浓度（3–8 mg/mL）以及PSI与HAP的质量比（3:1至8:1）。根据实验数据生成响应表面图，以指导最终制剂的选定。对于目标制剂GEM@HA-(HAP/PSI)10、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)40，使用Design Expert软件（版本10.0.1）实施了中心复合设计（CCD）。影响因素是GEM浓度（30–50 mg/mL）和HAP浓度（3–8 mg/mL），而固体涂层材料HA–PSI的量（如2.2.2.1节所述）保持不变。最终优化的制剂通过SEM、粒径分布分析和使用Malvern Nano ZS仪器（Spectris China Ltd，上海）进行的zeta电位测量进行了表征。

2.3.3 纳米颗粒性质的评估

2.3.3.1 体外药物释放研究

在模拟生理条件下研究了制剂的体外药物释放特性。简要来说，将10 mg的GEM载药纳米制剂放入含有不同pH值（5.0、6.8和7.4；10 mL）缓冲液的离心管中。管子在恒温震荡器中以37 ± 0.5 °C和100 rpm的搅拌速度下孵育。在预定的时间间隔（1、2、4、6、12、24和72小时）取样三次并离心。收集上清液，并洗涤沉淀物。将洗涤液与上清液合并，并在350 nm处测量所得溶液的吸光度。根据标准校准曲线确定释放的GEM浓度，并确定药物释放曲线。

2.3.3.2 溶血试验

制备了2%的红细胞悬浮液。随后设置了22个离心管（每个管5 mL），每个管中加入2 mL的红细胞悬浮液。阳性对照组管中含有2 mL的蒸馏水，阴性对照组管中含有2 mL的生理盐水（0.9% NaCl）。其余的管子分为四个实验组（每组五个管，对应不同的纳米制剂）。然后向每个实验管中加入0.1、0.2、0.3、0.4或0.5 mL的5% GEM纳米制剂悬浮液。轻轻混合后，在37 °C的恒温水浴中孵育3小时。孵育后，离心管子。使用SpectraMax M3微孔板读数器在545 nm处测量所得上清液的吸光度。溶血率计算如下：

溶血率 (%) = (A ? A0)/(A1 ? A0) × 100%

其中，A、A0和A1分别代表测试样本、阴性对照样本和阳性对照样本的吸光度水平。

2.3.3.3 体外细胞相容性和靶向性

2.3.3.3.1 细胞培养

选择了A549细胞（高CD44表达）和NCI-H358细胞（低CD44表达）进行实验。通过混合RPMI-1640培养基、热灭活的胎儿牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液（100:10:1比例）来准备两种细胞系的完整生长培养基。细胞在37 °C和5% CO2的加湿培养箱中培养。

2.3.3.3.2 空白载体细胞毒性试验

将对数生长阶段的细胞以每孔1 × 10^4个细胞的密度接种到96孔板中。孵育24小时后，用含有空白载体（(HAP/PSI)、HA-(HAP/PSI)40、HA-(HAP/PSI)20或HA-(HAP/PSI)10的新鲜培养基（浓度从2.5到25 μg/mL）替换培养基。孵育24小时后，根据制造商的说明使用CCK-8试剂检测细胞活力。在450 nm处测量吸光度（OD450）。

2.3.3.3.3 使用CCK-8试剂评估细胞增殖

细胞用游离的GEM或GEM载药制剂（GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40/20/10）以等效药物浓度（2.5–25 μg/mL）处理24小时。随后，使用上述方法检测细胞活力。

2.3.3.3.4 细胞摄取研究

使用香豆素6（C6）作为荧光探针。在组装过程中将C6掺入PSI或HA–PSI溶液中制备C6标记的纳米颗粒。同时，将A549和H358细胞接种到24孔板的玻璃盖玻片上。附着后，细胞用荧光标记的制剂处理0.5、2和4小时。然后用4%的戊二醛固定细胞，用DAPI染色，并使用荧光显微镜成像。

2.3.3.3.5 细胞摄取机制研究

将A549细胞接种到24孔板的盖玻片上（每孔1 × 10^5个细胞），培养24小时。细胞粘附后，用含有不同内吞抑制剂（氯丙嗪（CPZ，10 μg/mL）、秋水仙碱（8 μg/mL）或吲哚美辛（100 μM）的培养基替换原始培养基。细胞与前抑制剂培养基一起预孵育1小时。然后丢弃含抑制剂的培养基，并向 plate 中加入C6标记的纳米颗粒。孵育后，移除含药物的培养基，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞三次。细胞用4%的戊二醛固定15分钟，再用PBS洗涤三次，然后用DAPI染色细胞核5分钟。使用ImageJ软件分析荧光强度，观察细胞内的荧光分布。最后，比较不同抑制剂处理组之间的内吞效率，以确定细胞摄取的主要机制。

2.3.4 体外药代动力学研究

2.3.4.1 细胞形态分析

将在对数生长阶段的细胞接种到6孔板中，并培养至达到适当的细胞密度。向板中加入含有等效药物浓度的GEM、GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20或GEM@HA-(HAP/PSI)10的培养基，以及空白对照（仅含培养基）。在37 °C和5% CO2下孵育24小时后，移除培养基，用PBS小心冲洗细胞，并使用倒置显微镜检查细胞形态变化。

2.3.4.2 芽团形成试验

将细胞以低密度（每孔1000个细胞）接种到6孔板中。过夜培养后，用含有不同测试制剂（GEM、GEM@(HAP/PSI）、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20、GEM@HA-(HAP/PSI)10的无血清培养基替换培养基。每天监测细胞状态。连续孵育15天后，当形成可见的芽团（含有≥50个细胞）时，终止实验。移除培养基，用4%的戊二醛固定细胞20分钟，然后用PBS洗涤两次。接着在室温下用0.1%的结晶紫溶液染色细胞10分钟，然后在空气中干燥。随后评估芽团形成情况。

2.3.4.3 伤口愈合试验

将在对数生长阶段的细胞接种到6孔板中（每孔6 × 10^5个细胞）。使用无菌10 μL移液器尖端在每个孔的细胞单层上制造一个均匀的划痕。记录初始划痕宽度（0小时）。实验组用含有不同药物制剂的无血清培养基处理，而对照组仅用无血清培养基处理。细胞进一步孵育12和24小时。使用倒置显微镜在0、12和24小时捕获划痕区域的图像。使用ImageJ软件测量划痕区域，并计算迁移率：

迁移率 = [(A0 ? At)/A0] × 100%，

其中A0代表划痕时的面积（划痕后立即），At代表特定时间点（例如，划痕后的12或24小时）的面积。

2.3.4.4 Hoechst染色试验

将在对数生长阶段的A549细胞接种到24孔板的盖玻片上（每孔5 × 10^4个细胞）。附着后，用含有各种制剂等效药物浓度的无血清培养基处理细胞4小时。对照组用不含药物的無血清培养基处理。随后，移除培养基，用PBS洗涤细胞三次。然后用4%的戊二醛固定细胞15分钟，再用PBS洗涤细胞。接着用Hoechst 33342荧光染料染色细胞核5分钟，使用荧光显微镜观察荧光分布。

2.3.5 体内药代动力学研究

2.3.5.1 细胞形态分析动物模型建立

A549细胞在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养。当细胞处于对数生长期时，将其收集并通过皮下注射到Balb/c-NU裸鼠的右腋下，以建立异位异种移植肿瘤模型。

2.3.5.2. 肿瘤抑制实验

当肿瘤体积达到大约100 mm3时，携带肿瘤的小鼠被随机分为三组（每组n = 6只）：盐水对照组、游离GEM组和GEM@HA-(HAP/PSI)10组。通过尾部静脉注射进行治疗，共持续14天。定期测量肿瘤大小和体重。最后一次注射后，所有小鼠都被安乐死。切除它们的肿瘤和主要器官，称重，并拍照以分析肿瘤重量。同时，将组织固定在4%甲醛中，以备后续实验使用。

2.3.5.3. 苏木精和伊红（H&E）染色

固定的肿瘤和器官组织经过脱水、石蜡包埋和切片处理。切片依次在二甲苯（I、II，各20分钟）中脱蜡，通过分级乙醇系列（100% I & II，10分钟；90%，5分钟；80%，5分钟；70%，5分钟）再水化，然后用蒸馏水冲洗。切片用苏木精染色5分钟，用水冲洗，再用伊红复染1-2分钟，再次冲洗。最后，使用升序乙醇系列脱水，用二甲苯清洗，并在中性树脂中封片。在光学显微镜下观察染色的切片。

2.3.5.4. TUNEL染色

按照上述方法对制备好的组织切片进行脱蜡和再水化处理。然后使用蛋白酶K处理进行抗原 Retrieval（抗原释放），接着用PBS冲洗（2-3次）。将TUNEL反应混合物施加到切片上，然后在37°C下避光孵育60分钟。用PBS冲洗（每次5分钟，共三次）后，将切片封入含有DAPI的抗褪色封片剂中。利用荧光显微镜检测并成像凋亡细胞。

3. 结果与讨论

3.1. HA–PSI的结构

图1A–E展示了不同配方的1H核磁共振（1H NMR）谱图，其特征质子信号已明确标注。峰a（δ = 1.48 ppm，图1C–E）归属于HA–PSI结合物中六亚甲基二胺间隔体的亚甲基质子（–CH2–）。同时，峰b（δ = 1.7 ppm，图1A，C–E）来源于HA骨架中N-乙酰基的甲基质子（–NHCOCH3）。分裂信号表示为峰c（δ = 2.69 ppm和2.85 ppm，图1B–E），它们归属于PSI重复单元的亚甲基质子（–CH2–），分裂模式是由相邻的手性中心引起的。此外，峰d（δ = 3.3 ppm，图1A，C–E）对应于HA上的葡糖醛酸残基上的质子。值得注意的是，观察到了一个新的峰e（δ = 4.5 ppm，图1C–E），其化学位移与HA–PSI结合物中新形成的酰胺键（–N–CH–CO）相邻的亚甲基质子一致。这些发现为HA和PSI的成功结合提供了直接证据。

HA、PSI以及HA–PSI结合物的合成与表征。(A–E) HA（A）、PSI（B）、HA–PSI40（C）、HA–PSI20（D）和HA–PSI10（E）的质子核磁共振（1H NMR）谱图（在DMSO-d6中）。(F) HA、PSI以及HA–PSI结合物（HA–PSI40、HA–PSI20和HA–PSI10）的傅里叶变换红外（FT-IR）谱图。(G–K) PSI（G）、HA（H）以及HA–PSI结合物（HA–PSI40 [I]、HA–PSI20 [J]和HA–PSI10 [K]）的热重分析（TGA）和导数热重分析（DTG）曲线。(L) HA、PSI以及HA–PSI40结合物的X射线衍射（XRD）图谱。HA的FT-IR谱图在3421 cm?1处有一个宽广而强烈的吸收带，对应于分子间氢键形成的O–H伸缩振动。1617 cm?1和1408 cm?1处的明显峰分别归属于羧酸（CO）基团的不对称和对称伸缩振动。同时，1045 cm?1处的吸收峰归属于伯醇的C–O伸缩振动。在PSI中，2955 cm?1处的吸收峰主要是由亚甲基基团（–CH2–）的C–H伸缩振动引起的。此外，1792 cm?1处的峰是由相邻羰基的耦合产生的，而1717 cm?1处的强峰对应于琥珀酰亚胺环的CO伸缩振动。另外，1392 cm?1处的吸收峰与酰亚胺环内的C–N伸缩振动相关。重要的是，合成的HA–PSI结合物的FT-IR谱图中出现了新的吸收峰，分别位于1638 cm?1和1542 cm?1，这些峰特征性地表明了酰胺I（主要是CO伸缩）和酰胺II（N–H弯曲和C–N伸缩的结合）。这些发现证实了HA和PSI的成功结合。

通过TGA/DTG（图1G–K）探讨了这些配方的热降解行为。PSI（图1G）表现出三阶段的分解行为：在190 °C以下初始重量损失8.81%（自由水的蒸发）；在255 °C到385 °C之间是一个主要的重量损失阶段（27%的重量损失，涉及末端–OH/–NH2基团的脱水），在334 °C达到峰值；最后从386 °C到610 °C是第三阶段（15.16%的重量损失，骨架断裂）。HA（图1H）在130 °C以下显示出4.94%的重量损失（水分损失），然后在150 °C到310 °C之间迅速分解（42.7%的重量损失），在211.7 °C达到峰值（表明多糖链的断裂）。这些结果证明了PSI比HA具有更优异的热稳定性，这归因于其刚性的环形酰亚胺结构。有趣的是，HA–PSI结合物的TGA曲线（图1I–K）显示，随着HA含量的增加，最大分解温度系统性地降低：HA–PSI40为303.5 °C，HA–PSI20为253.9 °C，HA–PSI10为210.9 °C。这种趋势接近纯HA的降解温度，不能通过简单的物理混合或稀释效应来解释，后者通常会导致峰宽化而不是方向性移动。相反，这是由于HA对PSI的环状酰亚胺环的亲核攻击，导致环的打开和刚性环状结构转变为更 flexible 的线性片段。这种化学转变降低了骨架分解所需的活化能，使得在较低温度下就发生了降解。与之一致的是，HA–PSI40、HA–PSI20和HA–PSI10在150–310 °C范围内的重量损失分别为33.11%、36.83%和38.55%，这与HA含量呈正相关。复合材料的双峰曲线进一步证明了化学相互作用而非物理混合。降低的热稳定性表明，HA–PSI结合物在生理条件下（37 °C）可能会更快降解，从而有利于药物释放动力学。此外，环的打开反应由于产生了酰胺键和羧酸基团，增强了系统的亲水性，可能改善了膨胀能力并影响了药物的装载和释放特性。从刚性环状结构转变为柔性线性配置也可能降低机械强度，但可能同时增加韧性。XRD图谱（图1L）显示，PSI和HA在2θ = 20.18°和19.47°处都显示出宽广的、弥散的光晕，这是非晶聚合物的特征。HA–PSI复合材料的XRD图谱在2θ = 17.05°和29.25°处有两个新的宽峰，这些峰的形状和位置与单个组分不同。这反映了HA和PSI之间的分子级相互作用，导致聚合物链的重排和形成了新的、均匀的相，而不仅仅是物理混合物。峰位的变化反映了层间距离（d）的变化。17.05°处的峰（较大的d间距）反映了某些区域链间距离的扩大，可能是由于HA（例如–COOH、–OH）的极性基团通过氢键插入到PSI或HA链之间。相反，29.25°处的峰（较小的d间距）表明在其他区域的链堆积更紧密，可能是由于链的重折叠或相互作用引起的局部有序。复合材料的平滑、均匀的非晶光晕表明了整个样品中广泛的、均匀的相互作用。具有减小d间距的区域可能增强了复合材料的结构紧凑性和稳定性，而d间距较大的区域可能为药物装载和扩散提供了更多的空间。复合材料的非晶性质对其作为药物载体的可控溶解/膨胀行为有利。XRD结果确认HA–PSI是一种通过分子间相互作用形成的非晶复合材料，具有明确的均匀结构。额外的表征：HA–PSI的反应时间测定显示在图S2中（补充信息）。HAP的结构表征显示在图S3中（补充信息）。

3.2. 纳米药物输送系统的优化

单因素实验的结果总结在表S1–S3中。每种纳米配方的优化结果及相应分析提供在表S4和S5中，响应面图显示在图2中。结果表明，HAP和药物（GEM）的浓度对纳米配方的DLC（药物载荷容量）和EE（封装效率）都有显著影响。每种配方的最佳组成列在表1中。值得注意的是，所有纳米配方的DLC都达到了大约30%或更高。这种高装载能力非常重要，因为它可以减少所需的辅料用量，降低生产成本，并改善配方的安全性。这一优势对于需要高剂量药物治疗的疾病（如癌症）尤为宝贵。

使用三维响应面方法进行配方优化。(A) GEM@(HAP/PSI)；(B) GEM@HA-(HAP/PSI)40；(C) GEM@HA-(HAP/PSI)20；(D) GEM@HA-(HAP/PSI)10。表1

配方优化结果以及最终配方的封装效率（EE）和药物装载量（DLC）的测量值（n = 3）

纳米制剂
CGEM (mg/mL)
CHAP (mg/mL)
mPSI : mHAP
预测EE (%)
预测DLC (%)
测量EE (%)
测量DLC (%)

GEM@(HAP/PSI)
39.55
5.87
5.58
56.26
36.98
56.68 ± 2.31
37.07 ± 0.60

GEM@HA-(HAP/PSI)40
38.60
5.57
6.00
56.02
35.11
56.63 ± 1.03
34.95 ± 1.19

GEM@HA-(HAP/PSI)20
39.39
5.67
8.00
70.55
33.26
71.93 ± 0.14
34.21 ± 0.24

GEM@HA-(HAP/PSI)10
40.45
5.99
10.00
68.31
29.07
72.73 ± 2.86
30.14 ± 0.74

a
缩写：C，浓度；GEM，吉西他滨；HA，透明质酸；PSI，聚琥珀酰亚胺；HAP，羟基磷灰石；EE，封装效率；DLC，药物装载容量。
b
EE = M1 × 100/M0 和 DLC = M1 × 100/(M1 + M2)。M1是载体中的药物质量，M0是添加药物的总质量，M2是空白载体的总质量，GEM的标准曲线显示在图S1中。

3.3. 纳米药物输送系统的表征

如图3A-D所示，最终的纳米制剂都展示了相对均匀且接近球形的形态。GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的粒径分别为133.6 nm、159.4 nm、170.1 nm和184.6 nm。此外，所有制剂都显示出了低的多分散性指数。这些纳米颗粒的大小范围（大约100–200 nm）处于利用EPR效应在实体肿瘤中实现被动靶向的最佳范围内。因此，这些颗粒能够有效规避快速肾清除的挑战（通常影响小于10 nm的颗粒），同时保持小于肿瘤血管内皮间隙的大小（通常为200–2000 nm），从而促进它们在肿瘤部位的选择性积累。此外，它们的大小范围可以最小化单核巨噬细胞在肝脏和脾脏中的过度摄取（它们优先清除大于200 nm的颗粒），延长系统循环时间，并增加药物向目标组织的输送机会。同时，低的多分散性指数表明颗粒的大小分布狭窄。这反映了制备过程的稳定性和可重复性，这对于批次间的一致性和未来的临床转化至关重要。纳米颗粒的zeta电位大约为-18 mV，这是一个中等负值，与人生物膜的负电荷一致。图3

各种纳米制剂的物理化学特性和体外药物释放曲线。(A–D) 不同制剂的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像、粒径分布（PSD）和ζ电位：(A) GEM@(HAP/PSI)；(B) GEM@HA-(HAP/PSI)40；(C) GEM@HA-(HAP/PSI)20；(D) GEM@HA-(HAP/PSI)10。(E) 不同pH条件下制剂的体外药物释放曲线。不同pH条件（5.0、6.8和7.4）下的体外药物释放曲线显示在图3E中。24小时后，GEM@(HAP/PSI)在pH 5.0、6.8和7.4下的累积药物释放量分别达到约41%、58%和60%。经过HA修饰后，GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的释放率增加，在pH 7.4下24小时的释放量分别为64%、69%和79%；在pH 6.8下分别为62%、66%和75%；在pH 5.0下分别为43%、47%和49%。所有制剂都表现出明显的pH依赖性释放特性，在pH 5.0时释放速度明显减慢且不完全。有趣的是，GEM@HA-(HAP/PSI)10在最初的12小时内释放速率比GEM@HA-(HAP/PSI)20慢，但此后其释放速率超过了所有其他制剂。这种双相模式可以归因于GEM@HA-(HAP/PSI)10表面的致密HA刷层。最初，水合的HA层阻碍了水的渗透，从而阻止了药物的释放。然而，当水穿透屏障后，较高的HA含量促进了PSI基质的快速降解，加速了后续阶段的药物释放。在pH 7.4下观察到的加速和更完全的药物释放是由于PSI主链中存在大量的琥珀酰亚胺环（五元环状酸酐），这些在碱性条件下极易水解。在这些pH条件下，高浓度的强亲核性氢氧根离子（OH?）促进了这些环的有效攻击和断裂，导致聚合物主链的快速水解，随后纳米颗粒解体，药物释放加快。相比之下，在酸性条件下，高浓度的H+和有限的OH?限制了水解，水解主要通过水分子（H2O）进行。由于水的亲核性相对较弱，琥珀酰亚胺环的水解显著减慢，使纳米颗粒保持了更大的结构完整性。这导致药物释放更加持久且缓慢。尽管大多数实体瘤的细胞外微环境呈弱酸性（pH ～6.5–7.0），但肿瘤细胞的细胞内pH接近中性或略偏碱性（大约7.2–7.4），与正常细胞相当或略高。因此，对于在细胞质或细胞核内起作用的治疗剂（例如，如GEM这样的DNA损伤剂），能够在pH 7.4下快速释放药物的递送系统是有优势的。这样的系统在细胞摄取后促进药物的有效释放，从而增强细胞毒性效果。这种提出的释放机制与典型的细胞内运输途径一致。内吞作用后，纳米颗粒被包裹在内体中。随着这些囊泡成熟并与溶酶体融合，其内腔pH从大约6.5下降到5.0。PSI基载体的稳定性在这些酸性的内溶酶体条件下有助于保护封装的药物免受过早降解。随后，当纳米颗粒逃逸出内溶酶体区室或暴露在接近中性的细胞质pH（约7.4）时，它们会迅速分解，触发药物向细胞质的爆发式释放。这种pH触发的释放机制对于大分子治疗剂（例如核酸和蛋白质）的递送特别有益，因为这些物质容易被溶酶体降解，需要有效的细胞质释放来发挥其生物学作用。制剂的药物释放曲线被拟合到各种动力学模型中，包括零级、一级、Higuchi和Korsmeyer–Peppas模型。如表2所示，Korsmeyer–Peppas模型对大多数制剂组显示出最高的相关系数（R2）。一个例外是GEM@HA-(HAP/PSI)10在pH 6.8和7.4时，一级模型提供了略微更好的拟合。从Korsmeyer–Peppas模型获得的释放指数（n）对于所有制剂都一致低于0.4，明确表明药物释放机制主要由Fickian扩散控制。这种机制在测试的pH范围内的均匀性表明pH变化没有引起载体质地的根本变化，例如显著的聚合物侵蚀或基质解体。表2

不同制剂药物释放动力学的拟合参数

制备
介质
R2
n

零级
一级
Higuchi
Korsmeyer-Peppas

GEM@(HAP/PSI)
pH7.4
0.8455
0.9615
0.9676
0.9814
0.4037

pH6.8
0.8391
0.9712
0.9636
0.9766
0.4127

pH5.0
0.8630
0.9719
0.9737
0.9803
0.4423

GEM@HA-(HAP/PSI)40
pH7.4
0.8373
0.9444
0.9642
0.9834
0.3768

pH6.8
0.8381
0.9668
0.9643
0.9788
0.4060

pH5.0
0.8760
0.9507
0.9790
0.9865
0.4224

GEM@HA-(HAP/PSI)20
pH7.4
0.7727
0.9440
0.9280
0.9661
0.3364

pH6.8
0.8071
0.9555
0.9480
0.9726
0.3732

pH5.0
0.8318
0.9690
0.9607
0.9748
0.4112

GEM@HA-(HAP/PSI)10
pH7.4
0.7430
0.9793
0.9029
0.9294
0.3801

pH6.8
0.7556
0.9882
0.9117
0.9324
0.4014

pH5.0
0.8419
0.9551
0.9662
0.9818
0.3966

a
缩写：GEM，吉西他滨；HA，透明质酸；PSI，聚琥珀酰亚胺；HAP，羟基磷灰石。值得注意的是，Fickian扩散控制的过程（n < 0.45）表明制剂的释放速率主要由载体基质内的药物浓度梯度决定，分子通过孔隙或水通道向外扩散。低n值有效排除了由聚合物链松弛或膨胀（Case-II或异常运输）控制的机制的可能性。总体而言，以扩散为主的过程似乎是有利的，因为它通常提供更渐进和可预测的释放动力学，从而最小化了与快速载体降解相关的初始爆发性释放的风险。这种受控释放通常对于维持稳定的治疗药物水平和减轻毒性至关重要。在本研究中，纳米载体在生理pH范围（5.0–7.4）内表现出强大的物理和化学稳定性，作为稳定的储存库而不发生快速溶解。这一特性可以实现长期的持续药物释放，延长治疗效果，并可能通过减少给药频率来提高患者的依从性。对于需要通过磷酸化在细胞内活化的前药GEM而言，持续的释放曲线有助于维持相应活性代谢物的有效浓度，可能对抗某些与代谢相关的耐药机制。在不同制剂中一致观察到Fickian扩散作为主要释放机制，表明纳米载体的核心释放行为是稳健的，并且基本上不受制备参数（如HA含量）的影响。这些特征可能有利于未来的规模扩大和质量控制。总之，本研究中制备的纳米平台表现出理想的、受扩散控制的释放曲线。其稳定的结构可以通过调节扩散速率来促进持续释放，同时防止结构崩溃。值得注意的是，释放指数（n）随着HA修饰的增加而减小。更密集的HA水合层最初可能作为扩散屏障，调节初始释放阶段。随后水的渗透可能改变了聚合物基质的膨胀和渗透性，从而在后续阶段增强了以扩散为主的特性。特别是对于GEM@HA-(HAP/PSI)10制剂，在pH 7.4和6.8下的释放遵循一级动力学，这通常是扩散控制过程的特征，其中释放速率与剩余的药物负载成正比。这些发现反映了载体在このpH范围内的相对结构稳定性，聚合物膨胀或降解的影响很小。在pH 7.4和6.8时略微较高的n值可能表明存在轻微的基质侵蚀过程。尽管如此，中性pH下的一级动力学表明释放行为是可预测的，这对系统循环期间的稳定性是有益的。同时，在酸性pH条件下的Fickian行为（n < 0.45）证实了纳米载体的结构完整性以及没有过度膨胀，支持了它们适合细胞内递送。最后，一级和Higuchi模型在所有纳米制剂上的高相关系数（R2 > 0.94）也证实了以扩散控制的释放机制，因为这些模型广泛用于描述受扩散控制的系统。

3.4. 生物相容性和细胞毒性评估

体外溶血试验的结果显示在图4A–D中。共培养后，GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10组的上清液看起来清澈且几乎无色，试管底部有明显的红细胞（RBC）沉淀。这些样本的轮廓与阴性对照无异，与溶血的阳性对照明显不同。如图4E所示，所有制剂组的溶血率均低于2%，证实了这些制剂的出色生物相容性。这表明纳米颗粒在测试条件下没有破坏红细胞的膜完整性。通常，溶血是由纳米材料的表面活性、疏水性、尖锐边缘或强正电荷等因素引起的，这些因素可能导致膜破裂。纳米颗粒观察到的生物相容性与它们适度的负ζ电位（约?18 mV）一致，这可能减少了静电吸附到带负电的红细胞膜上，并防止了由于纳米颗粒聚集引起的任何物理应力或渗透压失衡。这些结果表明，在测试的浓度范围内，制剂对红细胞的影响最小，溶血风险低，为后续分析提供了可靠的安全基础。

纳米制剂的生物相容性和体外安全性。(A–D) 与(A) GEM@(HAP/PSI)、(B) GEM@HA-(HAP/PSI)40、(C) GEM@HA-(HAP/PSI)20和(D) GEM@HA-(HAP/PSI)10孵育的红细胞的代表性图像。(E) 溶血率的定量。使用细胞存活率测定法评估空载载体对(F) A549和(G) H358细胞的体外细胞毒性。如图4F和G所示，用梯度浓度的空载载体(HAP/PSI)、HA-(HAP/PSI)40、HA-(HAP/PSI)20和HA-(HAP/PSI)10处理的A549和H358细胞的存活率始终超过85%。这表明纳米载体具有良好的生物相容性，对这两种细胞系都没有表现出内在的细胞毒性，对细胞生长和代谢的影响可以忽略不计。空载载体的主要无毒性质确保了在后续实验中观察到的任何抗肿瘤效应都可以归因于释放的GEM，而不是载体材料的非特异性细胞毒性。此外，具有不同程度HA修饰的载体也表现出低毒性，证实了HA偶联过程是安全的，没有引入意外的细胞毒性。鉴于载体的固有安全性，载药制剂的抑制效应将更准确地反映GEM的递送效率和治疗效果，从而确保了后续基于细胞的实验的可靠性和可解释性。此外，出色的生物相容性和低细胞毒性共同表明这些纳米颗粒不太可能引起显著的急性炎症反应或在全身给药时对正常组织产生毒性。

3.5. 细胞内化机制的研究

首先使用CCK-8测定法评估了游离GEM和纳米制剂GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的体外抗增殖效应。如图5A和B所示，随着GEM浓度的增加，两种细胞系的细胞存活率呈剂量依赖性下降。此外，所有纳米制剂都比游离GEM提供了更强的生长抑制作用，其中HA修饰的变体(GEM@HA-(HAP/PSI)40/20/10的效力略高于非靶向变体GEM@(HAP/PSI)。

体外细胞毒性、细胞摄取和内化机制。(A和B) 用逐渐增加浓度的纳米制剂处理的(A) A549和(B) H358细胞的细胞存活率。(C和D) 对(C) A549和(D) H358细胞的半数抑制浓度(IC50)值。(E和F) 显示(A) A549和(F) H358细胞中细胞摄取的代表性荧光显微镜图像。(G和H) 基于平均荧光强度(MFI)检测的(C) A549和(H) H358细胞中的细胞摄取量。(I和J) A549细胞中摄取机制的探讨。(a) GEM@(HAP/PSI); (b) GEM@HA-(HAP/PSI)40; (c) GEM@HA-(HAP/PSI)20; (d) GEM@HA-(HAP/PSI)10。数据以平均值±标准差(n ≥ 3)呈现。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。半数抑制浓度(IC50)值总结在图5C和D中。治疗24小时后，A549细胞中GEM、GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10的IC50值分别为21.59、16.08、10.19、8.03和6.24 μg mL?1。同时，H358细胞中的相应值分别为22.01、17.19、12.62、11.21和9.63 μg mL?1。这些结果表明，所有载药纳米颗粒的IC50值都低于游离GEM，证实了纳米递送系统显著增强了GEM对肺癌细胞的细胞毒性效应。这种增效效果可以归因于纳米载体通过内吞作用更有效地被细胞内化、GEM免受细胞外降解的保护以及持续的细胞内释放，这些因素共同作用提高了并且维持了有效的药物浓度。对于A549细胞，随着HA浓度的增加，IC50值逐渐降低，表明药物效力与HA修饰的密度呈正相关。这表明较高的HA配体表面密度可以促进与CD44受体的更强、可能是多价的相互作用，从而实现更有效的受体介导的摄取。这些发现与TGA和XRD分析的结果一致，后者显示在高HA掺入量下化学修饰和交联增加，可能优化了细胞内药物释放的动力学。对于具有相同HA修饰水平的配方，A549细胞中的IC50值始终低于H358细胞。这不仅反映了A549细胞中较高的CD44表达水平，还直接证明了HA修饰纳米粒子的细胞毒性依赖于CD44受体介导的途径。然而，即使在CD44表达水平较低的H358细胞中，HA修饰的配方也显示出比非靶向配方更低的IC50值。这种残留的活性可能来自低水平的受体相互作用和被动靶向效应的结合，而HA修饰组之间的差异可能归因于药物释放特性的不同。为了可视化细胞对纳米药物的摄取，使用C6作为荧光探针并将其整合到纳米粒子中。如图5E和F所示，C6标记的纳米粒子发出绿色荧光，而细胞核由于DAPI染色呈现蓝色。在CD44高表达的A549细胞中（图5E和G），在0.5小时时所有组都能检测到微弱的绿色信号，表明纳米配方已经初步进入细胞。随后，在2小时时荧光强度显著增加，反映了内化的增强。此外，荧光强度在4小时达到峰值，并且在6小时时仍然很强，没有明显的衰减。这种随时间变化的荧光增强表明了纳米粒子在细胞内的持续积累，而不是简单的表面吸附。在6小时时持续的信号揭示了纳米粒子的有效细胞内保留，有利于药物的长时间释放。值得注意的是，HA修饰纳米粒子（HA-(HAP/PSI)40、HA-(HAP/PSI)20和HA-(HAP/PSI)10的荧光强度始终高于非靶向（HAP/PSI）配方。此外，荧光强度与HA修饰的密度呈正相关（图5G），意味着较高的HA配体表面密度导致更强的细胞内化。这一视觉证据直接支持了HA的主动靶向功能，并与CCK-8实验中观察到的增强的细胞毒性效应相符，表明HA-(HAP/PSI)10具有最有效的靶向和输送特性。相比之下，在CD44表达较低的H358细胞中（图5F和H），所有时间点的荧光信号都很弱。尽管HA修饰配方显示出略高的荧光强度，但差异很小，并且不同HA修饰组之间没有观察到显著差异。与A549细胞中的摄取模式形成鲜明对比，这表明HA修饰的有益效果高度依赖于CD44受体的表达。总之，研究结果表明HA修饰显著增强了目标细胞（A549）中对纳米粒子的摄取，这种增强是以时间和剂量（HA比例）依赖的方式进行的，主要通过CD44受体介导的途径。在CD44高表达的A549细胞中荧光的显著增强，以及在CD44低表达的H358细胞中的最小效应，证实了所设计的纳米载体系统的靶向特异性和受体驱动机制。基于对细胞摄取的观察，我们进一步探讨了主要配方GEM@HA-(HAP/PSI)10在A549细胞中的内吞机制。非病毒纳米载体通常通过内吞作用进入细胞，并在囊泡内被内化，随后这些囊泡成熟为内体。哺乳动物细胞具有几种不同的内吞途径，包括Clathrin介导的内吞（CME）、Caveolin介导的内吞、巨噬细胞内吞以及与Clathrin/Caveolin无关的机制。纳米粒子的具体摄取途径和效率受多种因素影响，包括粒子大小、表面电荷、材料组成和表面配体。通常，内化是通过多种途径的组合而不是单一途径发生的。因此，为了明确主要摄取机制，在与C6标记的纳米粒子孵育之前，用特定的药物抑制剂预处理了A549细胞。如图5I和J所示，氯丙嗪（CME抑制剂）显著抑制了纳米粒子的细胞摄取，降至对照水平的62.06%。这种显著的减少（约38%的抑制）表明CME是这些细胞中GEM@HA-(HAP/PSI)10摄取的主要途径。在CME途径中，货物通常通过早期和晚期内体转运到溶酶体。在这种情况下，我们的纳米载体在酸性溶酶体pH下的缓慢释放特性可以保护负载物免受酶的降解，为如核酸这样的不稳定性治疗剂的输送提供了潜在的优势。值得注意的是，纳米配方的细胞摄取也受到吲哚美辛（Caveolin介导的内吞抑制剂）的部分抑制，降至对照水平的86.56%（约13%的抑制），表明这一途径也起到了作用。Caveolin介导的内吞常常绕过溶酶体降解，可能将货物导向其他细胞内区室，如高尔基体或内质网。最后，经过秋水仙碱（巨噬细胞内吞抑制剂）处理后，摄取量略微减少至对照水平的93.02%（约7%的抑制），表明这种非特异性液相摄取机制的作用有限。总之，我们的结果表明GEM@HA-(HAP/PSI)10纳米粒子主要通过CME进入A549细胞，Caveolin介导的内吞和巨噬细胞内吞作为次要途径。这种多种进入机制的参与可能是有利的，可能减少了由于规避任何单一摄取途径而产生的细胞耐药性的可能性。

3.6 体外抗肿瘤效果

如图6A所示，空白对照组的A549细胞显示出典型的多边形形态，并且保持良好的粘附性和活力。相比之下，用游离GEM处理的细胞仅表现出轻微的形态变化，大体上保持了结构的完整性。相比之下，用GEM@(HAP/PSI)、GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10处理的细胞显示出明显的改变。这些细胞表现出明显的收缩、原始多边形形状的丧失以及细胞密度的显著下降。图6…

A549细胞中的体外抗肿瘤效果。(A) 显示治疗后A549细胞形态变化的代表性明场图像。(B) 在0、12和24小时时的伤口愈合（划痕）测定。(C) 在12和24小时时的细胞迁移率定量分析。(D) 渗殖灶形成测定。(E) 渗殖灶数量定量分析.(F) 通过Hoechst 33342染色评估的细胞核形态.(G) 通过Calcein-AM/PI（活/死）染色评估的细胞活力. 数据以平均值±标准差呈现（n ≥ 3）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 使用划痕测定法评估A549细胞的迁移能力。在细胞单层中诱导伤口后，用不同的配方处理细胞，并在0、12和24小时监测伤口闭合（图6B）。在对照组中，24小时后观察到广泛的伤口闭合，愈合率为53.86%。相比之下，所有纳米配方处理的组的细胞迁移显著受到抑制。值得注意的是，与对照组相比，GEM@(HAP/PSI)组的迁移显著减少。然而，HA修饰的配方——GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10——显示出更强的细胞迁移抑制作用，24小时时的迁移率低于30%（图6C）。在12小时和24小时时，这些HA修饰组的迁移率都显著低于非靶向GEM@(HAP/PSI)组。这些结果表明所有纳米配方都能有效抑制细胞迁移，其抗迁移效应与HA修饰的程度呈正相关。这种增强可以归因于HA与细胞表面上过表达的CD44受体的特异性结合，促进了纳米粒子的更好细胞内化。更高的细胞内药物积累可能导致更有效地破坏与迁移相关的信号通路，从而更有效地抑制细胞迁移。

在用不同配方处理后，还评估了A549细胞的克隆形成能力。从形态学角度来看，对照组中检测到许多形状规则的克隆，表明其具有强大的增殖能力（图6D）。相比之下，游离GEM和GEM@(HAP/PSI)组显示出不规则的克隆形态、松散排列的细胞、异质的克隆大小以及克隆数量的显著减少。正如预期的那样，HA修饰的纳米配方诱导了更强的克隆形成抑制（图6E）。虽然游离GEM将克隆形成减少到对照水平的73.93%，但仅纳米包封（GEM@(HAP/PSI)进一步将其降低到64.02%，表明载体本身可以增强抗增殖效应。这种抑制在HA修饰后显著增强，克隆形成从GEM@HA-(HAP/PSI)40组的36.68%急剧下降到GEM@HA-(HAP/PSI)10组的17.16%。这种剂量依赖的增强表明较高的HA配体表面密度可以促进更有效的受体聚集和内化。这导致更多的细胞内药物积累，从而对肿瘤干性和增殖相关通路产生更强的抑制作用。使用Hoechst染色评估了药物处理后A549细胞的凋亡情况。如图6F所示，对照组的细胞核显示出完整的形态和结构，发出微弱的蓝色荧光。相比之下，GEM@(HAP/PSI)组显示出细胞核收缩、膜完整性的丧失以及明亮的蓝色荧光。与游离GEM组相比，GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10组显示出凋亡细胞计数的显著增加，其特征是核染色增强和更强烈的荧光——这些都是晚期凋亡的标志（染色质凝聚和核碎片化）。HA修饰组的凋亡细胞数量显著高于非HA修饰组，进一步表明通过靶向内化增加的细胞内药物浓度能够更有效地激活线粒体或死亡受体介导的凋亡通路。

随后，使用Calcein-AM和PI的双染色法评估了细胞活力。Calcein-AM是一种非荧光染料，在活细胞中被细胞内的酯酶水解产生绿色荧光的Calcein，后者保留在具有完整膜的细胞内。另一方面，PI是不透膜的，仅进入膜受损的细胞，嵌入DNA分子并发出红色荧光。因此，活细胞发出的荧光是绿色的，而死细胞发出红色荧光，从而可以评估纳米粒子引起的细胞毒性。如图6G所示，与对照组相比，游离GEM和GEM@(HAP/PSI)组显示出微弱的红色荧光。相比之下，GEM@HA-(HAP/PSI)40、GEM@HA-(HAP/PSI)20和GEM@HA-(HAP/PSI)10组显示出明显的红色荧光增加，同时绿色荧光减少。这些发现与克隆形成测定结果一致，表明HA修饰的纳米粒子不仅抑制增殖，还诱导了广泛的细胞死亡。增强的细胞毒性效果可能源于CD44介导的纳米粒子内吞作用，这可能绕过了某些外排泵，使药物达到触发凋亡或坏死所需的细胞内阈值浓度。

基于全面的实验证据，我们推断各种配方的效果顺序如下：GEM@HA-(HAP/PSI)10 > GEM@HA-(HAP/PSI)20 > GEM@HA-(HAP/PSI)40 > GEM@(HAP/PSI) > 游离GEM > 对照组。这种观察到的层次结构可以归因于每种配方的不同递送和作用机制。游离GEM的效果有限可能是由于其依赖被动扩散，这种方法效率低下且容易受到外排泵的影响。相比之下，GEM@(HAP/PSI)纳米载体可以通过改善细胞摄取来增强治疗效果——可能是通过体内的EPR效应或在体外的一般内吞作用——同时实现持续的药物释放和防止降解。在这种情况下，将HA作为靶向配体加入提供了显著的优势。HA与A549细胞上过表达的CD44受体的特异性结合引发了高效的、受体介导的主动内吞途径（主要通过Clathrin依赖的机制）。这促进了纳米粒子装载的GEM的靶向富集和细胞内递送，导致细胞内药物浓度显著增加。因此，在多种细胞过程中观察到了更治疗效果，包括抑制迁移和增殖，以及诱导凋亡。除了作为递送载体的作用外，纳米粒子还可能促进HA–CD44相互作用，这本身可能调节肿瘤细胞的恶性表型。由于CD44是与细胞迁移、增殖和存活调节相关的关键信号分子，因此HA结合的纳米粒子持续与其结合可能会竞争性地抑制内源性HA与CD44之间的相互作用，从而破坏下游的促癌信号级联反应（例如PI3K/Akt、Ras/MAPK）。这种调节作用可能与GEM的直接细胞毒性作用协同作用。总之，我们的体外药效学分析表明，GEM@HA-(HAP/PSI)10表现出强烈的多方面能力，能够抑制A549细胞的迁移和增殖，并诱导细胞死亡，其效果优于非靶向纳米载体和游离的GEM。

3.7 体内抗肿瘤活性和药效学评估

基于我们的体外药效学发现，我们进一步在异种移植小鼠模型中评估了GEM@HA-(HAP/PSI)10的体内抗肿瘤效果。使用市售的GEM制剂（Eli Lilly and Company生产）和生理盐水作为阳性对照和阴性对照。如图7A和B所示，治疗15天后，GEM和GEM@HA-(HAP/PSI)组的肿瘤体积均显著小于生理盐水对照组，表明肿瘤生长受到了有效抑制。值得注意的是，GEM@HA-(HAP/PSI)10表现出最强的抗肿瘤效果。定量分析（图7C）证实，HA修饰的纳米制剂比游离GEM更有效地抑制了肿瘤生长。此外，所有用药组与正常组之间的体重相当（图7D），表明在所给予的剂量下，该纳米制剂的生物相容性良好且急性系统毒性最小。

3.7 体内抗肿瘤疗效和药效学评估

基于我们的体外药效学结果，我们进一步在异种移植小鼠模型中评估了GEM@HA-(HAP/PSI)10的体内抗肿瘤效果。使用市售的GEM制剂（Eli Lilly and Company生产）和生理盐水分别作为阳性和阴性对照。如图7A和B所示，治疗15天后，GEM和GEM@HA-(HAP/PSI)组的肿瘤体积明显小于生理盐水对照组，表明肿瘤生长得到了有效抑制。特别是，GEM@HA-(HAP/PSI)10显示出最强的抗肿瘤效果。定量分析（图7C）证实，HA修饰的纳米制剂比游离GEM更有效地抑制了肿瘤生长。所有用药组与正常组的体重相当（图7D），表明在所给予的剂量下，该纳米制剂的生物相容性良好且急性系统毒性最小。

在异种移植小鼠模型中的体内抗肿瘤疗效。(A) 治疗期结束时的小鼠代表照片。(B) 来自每个治疗组的小鼠切除的肿瘤。(C) 肿瘤生长曲线。(D) 治疗过程中携带肿瘤的小鼠体重变化。(E) 通过苏木精和伊红（H&E）染色对肿瘤组织进行组织病理学评估。(F) 肿瘤组织的TUNEL染色（绿色：TUNEL阳性的凋亡细胞；蓝色：DAPI染色的细胞核）。(a) 生理盐水，(b) 游离GEM，(c) GEM@HA-(HAP/PSI)。数据以平均值±标准差表示（n ≥ 3）。***p < 0.001，****p < 0.0001。H&E染色（图7E）显示，与对照组相比，游离GEM和GEM@HA-(HAP/PSI)处理的肿瘤组织存在明显的组织病理学改变。在生理盐水组（图7E(a)）中，肿瘤细胞表现出高度密集、单态的增殖模式，其特征是核与细胞质比例高和核着色深。由于基质成分极少，细胞以固体、背靠背的片状形式生长。这种形态是未经处理的、高度增殖的肿瘤的典型特征，其中均匀的细胞性反映了强烈的克隆扩张，并且没有证据表明有治疗引起的分化或坏死。在游离GEM组（图7E(b)）中，观察到整体细胞密度有所降低。组织中散布着小的、无结构的嗜酸性区域，表明有早期或局部的肿瘤细胞坏死。虽然存活的细胞仍保留了一定程度的非典型性，但活跃的增殖迹象减少了。这些发现表明游离GEM的细胞毒性作用有限且不均匀，导致部分肿瘤细胞死亡。值得注意的是，在游离GEM组中没有检测到广泛的显著空泡化。相比之下，GEM@HA-(HAP/PSI)组（图7E(c)）呈现出明显不同的组织病理学特征，以大量的透明空泡为主，细胞分布整体稀疏。这些“幽灵”轮廓是凝固性坏死的特征，表明细胞发生了广泛的解体。残留的肿瘤细胞巢呈现碎片化和稀疏状态，表明肿瘤细胞死亡广泛且协调（包括坏死和凋亡），以及严重的结构破坏。值得注意的是，大面积的融合坏死区域是化疗效果有力的金标准。在纳米制剂组中检测到的广泛空泡化和坏死表明GEM@HA-(HAP/PSI)促进了GEM在肿瘤组织中的更深、更有效的积累，可能是通过EPR效应和/或主动靶向实现的。细胞密度的显著降低反映了整体肿瘤负担的显著减少和增殖活动的抑制。为了进一步评估体内的抗肿瘤机制，对肿瘤组织进行了TUNEL/DAPI染色以检测凋亡（图7F和G）。在生理盐水组（图7F(a)）中，TUNEL（红色）通道显示强烈的红色荧光信号，表明DNA普遍断裂，因此发生了活跃的凋亡。同时，DAPI（蓝色）通道显示出高密度的细胞核。红色信号与蓝色细胞核（呈现粉红色/紫色）在合并图像中的广泛共定位证实这些凋亡事件发生在肿瘤细胞内。根据文献，在快速增长、高度拥挤的未处理肿瘤中，严重的营养竞争和缺氧微环境可以触发一部分细胞的“自发凋亡”。然而，由于增殖速率远超过凋亡速率，整体肿瘤体积继续扩大。因此，这一组的强烈TUNEL信号反映了“高周转率”和内部紊乱（即由于未受干扰肿瘤的内部分应力导致的“背景凋亡”，而不是有效的治疗反应。在游离GEM组（图7F(b)）中，TUNEL红色信号的强度和密度较低，但仍可清晰辨认。合并图像也显示共定位信号减少。这表明游离GEM有效地干扰了DNA合成，诱导了一部分肿瘤细胞的凋亡，并可能清除了一些细胞，产生了明显的药理效果。然而，可能由于药物递送效率不佳和肿瘤异质性等因素，凋亡诱导是局部的和不完全的，未能摧毁大部分肿瘤组织。这与H&E染色切片中缺乏大面积坏死区域的结果一致。然而，GEM@HA-(HAP/PSI)组（图7F(c)）呈现出最独特的表型。TUNEL红色信号在这一组中变得极其微弱和稀少，几乎处于背景水平。这表明细胞可能正在经历其他形式的死亡，如坏死或焦亡，或者凋亡细胞在死亡程序完成后被迅速清除，阻止了TUNEL可检测信号的积累。这一观察结果与H&E染色（图7E(c)）中观察到的广泛坏死区域完全一致，共同证明了纳米制剂触发了更彻底和广泛的肿瘤组织解体。总之，GEM@HA-(HAP/PSI)纳米制剂的抗肿瘤效果显著优于本研究中测试的市售GEM制剂（游离GEM）。优越的结果可能源于纳米制剂的综合优势：HA介导的针对表达CD44的肿瘤细胞的主动靶向，由于适当的纳米尺寸（约185纳米），EPR效应促进的被动积累，以及在肿瘤微环境或细胞区室内的pH响应性药物释放。市售的GEM制剂作为游离药物，在体内非特异性分布，迅速被清除，并在肿瘤组织中仅实现有限的积累。因此，它只能引起局部的和不完全的肿瘤杀伤效果。相比之下，由于HA的CD44靶向能力和其最佳尺寸，GEM@HA-(HAP/PSI)纳米载体通过EPR效应和主动靶向，在肿瘤部位实现了高效的积累。这种积累可能源于以下因素的结合：(i) HA–CD44结合，有助于纳米粒子在全身循环期间锚定在表达CD44的肿瘤细胞上；(ii) EPR效应与受体介导的内吞作用之间的协同作用，使得在组织和细胞水平上实现更高程度的双重靶向。这导致肿瘤内的药物浓度显著升高，从而产生更强大和广泛的肿瘤杀伤作用。此外，纳米载体可能保护了GEM，减少了其在血液中的快速代谢脱氨和失活，并可以通过内吞途径绕过一些膜转运蛋白介导的抵抗机制。这种延长的药物作用可能有助于更深刻和连续的肿瘤细胞死亡，病理上表现为大面积的组织解体，而不是零星的局部坏死。尽管已经开发了大量纳米载体，但它们的临床转化仍然有限。自1995年首个PEG化多柔比星脂质体Doxil?获得批准以来，到2023年底仅有大约90种纳米药物上市，其中一些随后被撤出市场。目前，临床使用和正在临床研究的纳米载体仍主要是被动靶向的脂质基系统。虽然这些纳米药物与传统制剂相比提高了患者的依从性，但大多数在临床效果上没有显著提高。同时，更精确的靶向递送系统，如那些采用主动靶向策略的系统，在临床开发过程中经常遇到重大瓶颈，并面临转化挑战。在这种情况下，主要障碍包括纳米颗粒在长期稳定性、效果和安全性方面的固有限制；可药用载体的材料选择有限；以及与工业规模生产、包装和成本效益相关的挑战。先进递送系统（例如，主动、物理或化学靶向）的设计、合成和制备往往复杂，导致难以实现可重现的规模化生产、严格的杂质/质量控制以及适当的灭菌和物理化学稳定性。这些问题共同构成了从功能性纳米载体的开发到其成功工业化和临床转化的关键障碍。在这个背景下，本研究中开发的GEM@HA-(HAP/PSI)纳米靶向递送系统与传统的脂质体制剂相比具有几个潜在的优势。这些优势包括其相对较低的生产成本（由于使用了廉价的原材料）、简单的制备过程（不需要严格条件或特殊设备）、产生的杂质最少、在辅料生产过程中可以集成灭菌、终端灭菌容易、以及过程的鲁棒性（即在一定范围内的进料量变化不会影响产品质量）。此外，该系统目前的DLC至少为300 mg g?1。因此，从临床角度来看，这个平台非常有前景。通过调节壳材料、核心组成和颗粒大小，该系统可以适应不同的靶向模式（被动、主动、物理或化学），并适用于各种给药途径，包括口服给药、吸入、植入和注射。总体而言，这种递送系统似乎特别适合体内递送抗肿瘤剂和基于核酸的基因治疗剂。

4. 结论

在这项研究中，基于CD44受体介导的主动靶向策略，我们成功开发了一种HA修饰的纳米载体共递送系统，称为GEM@HA-(HAP/PSI)，用于封装GEM。所得纳米粒子显示出球形形态、均匀分布和适度的负表面电荷。体外细胞摄取研究表明，该系统可以通过HA–CD44受体相互作用有效增强在过表达CD44的肺癌细胞中的细胞内积累，这证实了其主动靶向能力。更重要的是，体内抗肿瘤疗效评估表明，GEM@HA-(HAP/PSI)提供的肿瘤生长抑制作用明显强于游离GEM或市售的GEM制剂。总体而言，这项研究为GEM在癌症治疗中的靶向递送提供了一种有前景的策略。

作者贡献

余丰波：研究、资金获取、撰写-审稿与编辑、概念化。曹静丹：研究、方法论、数据管理。范星俊：方法论、数据管理。高俊霞：方法论、数据管理。刘贵芳：研究、方法论、数据管理。朱英：研究、方法论。王强：资金获取、撰写-初稿、数据管理。

利益冲突

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

数据可用性

数据将根据请求提供。补充信息（SI）：(1) 吉西他滨（GEM）的UV-vis扫描光谱和标准曲线。(2) 不同反应时间点的HA-PSI HPLC色谱图。(3) HAP的FT-IR和SEM表征。(4) 自组装纳米粒子中HA-PSI/HAP比例的SEM分析。(5) 单因素优化实验的结果。(6) GEM@(HAP/PSI)和GEM@HA-(HAP/PSI)制剂的浓度优化。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra02076c。

致谢

本工作得到了中国黑龙江省自然科学基金[批准号SS2024H002]的支持。