微冷成型：一种简单、快速且成本低廉的制造3D细胞培养用微腔体的方法

《RSC Advances》：Micro-cold-forming: a simple, rapid, and inexpensive method for the fabrication of microcavities for 3D cell culture

　　最近，微腔阵列被越来越多地用于控制性培养3D细胞聚集体，如球体、类器官和原肠胚样结构。然而，目前的制造技术仍然技术要求高且大部分研究者难以获得。虽然已经使用微尺度的热成形技术在热塑性聚合物薄膜中制造出薄壁微腔，但该过程需要专门的设备来精确控制成形温度和压力。在这里，我们描述了一种新的微制造方法，称为“微冷成形”。这种方法能够简单、快速且低成本地制造出直径为2毫米、深度在530至690微米之间的微腔，这些微腔位于25-30微米厚的热塑性聚合物薄膜中。整个制造过程在常温或室温下进行，并且只使用市面上容易获得的、价格合理的组件。我们证明了这些微腔可以用于3D细胞培养，比如在微腔中培养成人肾脏类器官——即所谓的“管状体”。为了展示微腔在毒性研究中的应用潜力，我们将管状体暴露在高浓度的抗坏血酸环境中。这种新的成形技术可以为生物学实验室和低收入国家的研究人员提供广泛且低成本的自主制造微腔的途径。

## 引言
过去几年中，微腔被越来越多地应用于肠道类器官、支气管类器官和原肠胚样结构的培养。微腔以规则阵列的形式排列，使得可以在定义的x、y、z坐标位置上进行培养。这有助于实现对类器官的高通量操作和成像，并且可以无障碍地接触每个单独的类器官——这是传统使用的基底膜提取物（BME）方法所无法实现的优点，在BME方法中，类器官在大小、形状和间距上的一致性较差。使用微热成形技术，已经在薄热塑性聚合物薄膜中制造出了用于3D细胞培养的薄壁微腔。聚碳酸酯（PC）和聚苯乙烯（PS）这两种聚合物都可以通过微热成形技术进行处理；它们具有生物惰性，不会像聚二甲基硅氧烷（PDMS）那样吸收小分子，因此非常适合用于毒性和药物效力的测试。然而，微热成形过程并不简单，因为需要精确控制温度和压力，而这需要专门的设备。大多数聚合物的成形温度需要超过100°C，这会导致热成形模具及其制成的薄膜冷却时间延长。如果使用水作为冷却剂，产生的蒸汽通常需要额外的排气步骤。此外，对于微压力（热）成形来说，高气压可能带来安全风险，并且需要能够安全处理这些气压的专用设备。这些挑战使得许多研究者无法使用这项技术，尤其是那些没有相应设备的生物实验室和低收入国家的研究人员。在这里，我们描述了一种称为“微冷成形”的新型微制造技术，可以简单、快速且低成本地在热塑性聚合物薄膜中制造微腔。该制造过程可以在常温或室温下进行，无需加热和冷却设备以及相关的时间周期。此外，使用容易获得的、价格合理的夹具和PDMS板对薄膜施加压力，这比使用气压要安全得多，也无需特殊设备。该工艺旨在可靠地在已建立的培养基底聚合物PC和PS制成的薄膜中制造出微腔。为了展示这些微腔在3D培养中的适用性，我们在悬浮培养条件下将这些微腔用于培养成人肾脏类器官（即“管状体”）。由于肾脏是药物诱导肾毒性的主要靶标之一，因此开发用于毒性筛选的体外细胞培养平台对于临床前安全性评估至关重要。为此，我们通过将管状体暴露在高浓度的抗坏血酸（维生素C）环境中，证明了这些微腔在毒性研究中的适用性。结果发现，在微腔中培养的管状体成功保持了较高的存活率、顶端-基底极性以及与传统BME培养相当的肾脏特异性标记物表达。为了使用更高倍数的物镜进行成像，将这些管状结构放置在一个底部带有玻璃盖片的35毫米培养皿中（ibidi公司，产品编号81218-200），然后加入Dako荧光固定媒介（Agilent公司生产）。图像处理和分析使用NIS-Elements（尼康公司）或FIJI软件（https://fiji.sc/）完成，随后使用FIJI.21的QuickFigures插件将处理后的图像组合成图表。

2.10 定量聚合酶链反应分析

首先使用Cold Gentle Cell Dissociation Reagent（GCDR；STEMCELL Technologies公司生产）将来自冷成型聚碳酸酯（PC）微腔或BME圆顶的管状结构解离，然后在4°C下以300×g的离心力离心5分钟。按照制造商的说明使用RNeasy Micro Kit（Qiagen公司生产）提取总RNA，接着使用iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad公司生产）进行cDNA合成。基因表达的定量分析采用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad公司生产）进行实时定量聚合酶链反应（qPCR），具体操作步骤为：在94°C下变性5分钟，随后进行60个循环，每个循环包括94°C 15秒、60°C 20秒和72°C 40秒，最后在55–90°C的温度范围内进行熔解曲线分析，每3秒温度上升0.5°C。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因对基因表达进行归一化。用于基因表达分析的引物列表包含在本手稿的补充信息（SI）中（表S1）。

2.11 抗坏血酸处理

在管状结构在冷成型PC微腔中培养3天后，向培养基中加入30 mM的抗坏血酸。将这些管状结构在37°C和5% CO2的条件下在该培养基中孵育24小时。通过活/死细胞染色法评估管状结构的存活情况。作为对照，使用相同培养时间和不含抗坏血酸的培养基培养管状结构。

2.12 统计分析

在条形图中，条形代表平均值，误差条代表标准差（SD）。根据数据集的不同，使用GraphPad Prism软件（GraphPad公司生产）通过非配对t检验（Welch校正）或双因素方差分析（ANOVA）随后进行Bonferroni事后多重比较检验来确定两组之间的统计显著性。所有样本至少考虑了三次测量结果（N ≥ 3）。所有检验中，P < 0.05被认为具有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 冷成型微腔阵列的特性与表征

所测量的PC和PS薄膜的厚度分别为25.8 ± 1.2 μm和32.3 ± 0.27 μm（图S2A和B）。无论是PC还是PS材质制成的微腔，其表面都十分光滑，扫描电子显微镜（SEM）观察不到任何不规则形貌或偏离球形的情况（图2A和B）。与未经处理的平面对照膜相比，微成型薄膜的表面粗糙度没有显著增加（图2C和D）。这一点很重要，因为微观地形或粗糙度会显著影响细胞粘附动力学，并降低成像过程中的光学透明度。使用光学轮廓仪测量PC和PS微腔的深度，分别为694.1 ± 13.5 μm和534.4 ± 84.5 μm（图2E和F）。即使使用C型夹具手动加压，PC微腔的成型深度也具有很高的重复性。相比之下，PS微腔的深度较低，且该参数的变异性较大。这可能是由于两种聚合物的机械性能存在差异。在室温下，PC显示出的粘塑性变形和蠕变行为比PS更为明显。此外，PS薄膜是双轴取向的，其厚度也比PC薄膜大约25%更大。对于取向和/或更厚的薄膜，PDMS压板变形时施加的力与薄膜拉伸力之间的平衡在较浅的成型深度下就能达到，而相同材料的非取向和/或较薄的薄膜则需要更大的成型深度。基于上述结果，第3.2节及后续章节中的所有实验均使用PC薄膜进行。

3.2 微腔的形成与表征

利用扫描电子显微镜（SEM）观察了（A）PC微腔和（B）PS微腔的背面视图，以及（C）未经处理的平面PC薄膜和（D）PS薄膜的表面粗糙度（所有数据均相对于相应的平面对照薄膜进行了归一化处理）。数据分析采用了带Welch校正的非配对t检验。N = 3。使用光学轮廓仪测量了（E）PC微腔和（F）PS微腔的深度，条形和误差条代表平均值±标准差。还对手动冷成型后的（G）PC薄膜和（H）PS薄膜进行了自发荧光测量（条形和误差条代表平均值±标准差），数据分析采用了双因素方差分析（ANOVA）随后进行Bonferroni事后多重比较检验。N = 3。a.u.表示任意单位，ns表示无显著性。除了薄膜材料（PC与PS）外，我们还研究了PDMS压板的厚度以及（PC）薄膜本身的厚度对成型过程和最终成型深度的影响。PDMS压板的厚度超过之前提到的约2.8毫米时，微腔的深度并未显著增加。对于较薄的PC薄膜（10 μm），虽然可以成功成型，但缺乏足够的刚性，容易在冷成型后塌陷或起皱；而较厚的50 μm薄膜则导致PC和PS微腔的深度显著减小。此外，尝试将冷成型工艺应用于离子刻蚀的多孔PC薄膜时，会导致广泛的裂纹形成。这些孔隙可能成为裂纹的起始点。一个潜在的解决方案是先冷成型经过重离子辐照但尚未刻蚀的PC薄膜，然后在成型后单独刻蚀孔隙，正如我们之前与微热成型结合使用时所展示的那样。总之，聚合物类型和初始薄膜厚度会影响冷成型微腔的最终结构完整性和深度。根据选定的设计参数，中间厚度（25–30 μm）获得了最佳结果，因为较薄的薄膜在冷成型后缺乏机械稳定性，而较厚的薄膜在室温下的可成型性受到限制。由于荧光显微镜是广泛应用于细胞实验的技术，因此测量了PC和PS微腔在四种最常用波长（390、488、568和647 nm）下的自发荧光强度。在任何波长下，与相应对照薄膜相比，都没有观察到自发荧光的显著增加（图2G和H）。因此，冷成型工艺预计不会干扰成像实验。3D细胞培养的微腔可以通过多种工艺制备，例如直接微钻孔或激光微加工，或者通过聚合物微模塑。后者包括在光刻模板上复制PDMS或琼脂糖水凝胶等材料，以及热压成型和微热压成型。与最接近的微热压成型工艺相比，冷成型工艺既有优势也有劣势。冷成型是在室温下进行的，大大降低了设备成本；而微热压成型需要使用价值数千欧元的温控压力设备，而冷成型仅需要成本不到10欧元的简单手动夹具。由于消除了加热和冷却时间（至少10分钟），循环时间缩短至几秒。然而，目前描述的这种简单的冷成型工艺的限制在于，球形微腔的成型深度与特征宽度的比率约为0.3，而微热压成型的这一比率高于1。

3.2 冷成型微腔中管状结构的存活情况

为了验证所制备微腔适用于3D细胞培养，我们在含有10% BME的培养基中悬浮培养管状结构。使用calcein AM/EthD-1对培养4天后的微腔和BME圆顶中的管状结构进行活/死细胞染色（图3A）。统计结果显示，圆顶中培养的管状结构的死亡面积百分比高于微腔中的管状结构（图3B）。圆顶中细胞死亡率增加可能是由于氧气、营养物质和代谢废物的扩散受到限制所致。在传统的BME圆顶中，密集的水凝胶基质会成为一个限制质量传输的屏障；而在微腔中，管状结构处于悬浮状态，从而促进了与周围培养基的有效物质交换。

3.3 冷成型微腔中的管状结构极性与肾脏特异性标志物的表达

培养4天后，微腔中生长的管状结构与BME圆顶中生长的管状结构相似（图3A和C–L）。此时对管状结构进行染色，以评估其顶端-基底极性和肾脏特异性标志物的表达（图3C–L）。所有评估标志物的表达模式和定位在微腔和BME圆顶中培养的管状结构之间是相似的。这表明在微冷成型微腔中的悬浮培养能够维持管状结构的表型。通过检测乙酰化微管蛋白（纤毛，顶端表面）、ZO-1（紧密连接，顶端-外侧区域）和AQP3（基底-外侧膜）来评估顶端-基底极性。这两种条件下的顶端-基底极性建立是相当的。在肾脏中，这些蛋白质的正确极化对于肾功能至关重要，因为它能够实现水和溶质在管状上皮中的运输。在两种培养方式下都检测到了初级纤毛（乙酰化微管蛋白）以及ZO-1在顶端-外侧连接处的定位，表明形成了分隔管腔内腔和间质区域的功能性屏障。肾脏特异性标志物包括AQP3（集合管主细胞的基底-外侧膜；也存在于其他上皮组织中但在肾脏中含量较高）和整合素α3（管状上皮细胞的基底膜）。这些标志物的表达在微腔培养的管状结构中得以保持，并且与BME圆顶中的对照管状结构相当。AQP3和乙酰化微管蛋白的共同表达证实了存在具有纤毛的集合管细胞。为了评估不同肾脏区域标志物的表达，我们对培养4天后的微腔和BME圆顶中的管状结构进行了qPCR分析（图4）。分析的基因及其对应的腎单位段和功能列在本手稿的补充信息（SI）中（表S2）。对于特定的运输标志物，观察到显著的基因表达差异：SLC4A4（近端小管）、NR3C2（盐皮质激素受体）和AQP3（集合管）在微腔中的管状结构中显著上调，表明微腔环境中的功能成熟度更高。这可能是由于微腔悬浮培养中的质量传输更有效，从而减轻了代谢应力。这种代谢应力的缓解可能支持了能量密集型的转运蛋白合成过程，导致观察到的基因表达增加。此外，与BME圆顶中的管状结构相比，微腔中的管状结构中CLDN10基因的表达显著下调。先前的研究表明，紧密连接蛋白的表达受到周围环境机械力的影响。悬浮培养中对管状结构施加的机械力可能小于BME圆顶中的机械力，这可能是导致CLDN10下调的原因。未来需要进一步研究以阐明悬浮培养和BME圆顶培养的类器官之间基因表达差异的机械转导途径。

图4 显示了培养第4天时，圆顶和微腔中管状结构的基因表达情况。条形图和误差条表示平均值 ± 标准差。数据采用带有Welch校正的非配对t检验进行分析。*p < 0.05，***p < 0.001。N = 3。

3.4 抗坏血酸毒性研究

为了证明该平台在毒性研究中的适用性，将培养在冷成型微腔中的管状细胞暴露于30 mM的抗坏血酸中24小时，随后进行活/死细胞染色以评估其生存能力。虽然抗坏血酸在生理浓度下具有抗氧化作用，但较高浓度（毫摩尔范围内）可能会产生严重的细胞毒性作用。此外，过量摄入抗坏血酸与患者发生草酸肾病和急性肾损伤（AKI）有关。活/死细胞染色显示，与对照组相比，暴露于抗坏血酸中的管状细胞出现了明显的细胞死亡。通过量化管状细胞中死亡区域的百分比（图5），进一步证实了这一（显著）效应。这表明微冷成型腔体可以成为药物和毒性筛选的可行工具。图5

抗坏血酸毒性研究。(A) 暴露于30 mM抗坏血酸的管状细胞和对照管状细胞的活/死细胞染色。刻度条代表200 μm，适用于所有图像。(B) 与总管状细胞面积相比的死亡区域百分比的量化。条形图和误差条表示平均值 ± 标准差。数据采用带有Welch校正的非配对t检验进行分析。***p < 0.001。N = 3。

4 结论与展望

我们开发了一种简单、快速且低成本的微冷成型技术，可以在热塑性聚合物薄膜中制造微腔体，无需专门的设备甚至洁净室。然后，我们通过优化管状细胞的悬浮培养，证明了所制造微腔体在3D细胞培养中的适用性。我们将这些管状细胞的生存能力、极化特性和肾标志物表达与在BME圆顶中培养的管状细胞进行了比较。接下来，我们进行了抗坏血酸的毒性研究，以证明微腔体在毒性筛选中的适用性。由于其直接且成本效益高的特性，微冷成型技术既适用于生物实验室，也适用于低收入国家。由于本研究的主要目标是开发一个适用于3D细胞培养的、易于获取的低门槛平台，因此我们将系统研究集中在直接与该生物应用相关的工艺参数上，包括薄膜材料（PC和PS）的变化、薄膜厚度以及PDMS的性能。对于模具，我们特别使用了一种简单的毫米级圆形设计。选择这种几何形状是因为圆形特征可以容易地制造（例如，通过钻孔），这与我们希望开发适用于低收入环境的工艺相吻合。此外，由此形成的U形腔底非常适合细胞培养，因为它促进了细胞沿重力方向沉降到最深处，有助于3D聚集体的形成。毫米级的腔体也非常通用，能够容纳从小球形到毫米级类器官的各种尺寸的细胞。然而，对于需要其他基础几何形状（例如，细长结构）或比光滑圆形底部有更明确轮廓的应用，未来的研究将需要系统地定义微冷成型工艺的几何限制和复制精度。未来的研究应该探索适用于3D细胞培养的替代热塑性薄膜。候选材料应具备以下特性：能够进行冷成型、可作为薄膜使用（其中一些已经具有双轴取向）、生物相容性或细胞相容性、高透明度，并且能够抵抗细胞培养工作流程中常用的化学物质，包括聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚对苯二甲酸乙二醇酯甘醇（PETG）、环状烯烃聚合物（COP）和环状烯烃共聚物（COC）。

作者贡献

J. R. K. S.：概念构思、数据整理、形式化分析、研究方法、验证、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。P. S.：概念构思、形式化分析、研究方法、验证、可视化、撰写、审稿与编辑。C. P. C.：研究方法、撰写、审稿与编辑。M. B. R.：撰写、审稿与编辑。M. C. V.：资金筹措、研究方法、撰写、审稿与编辑。P. H.：资金筹措、撰写、审稿与编辑。S. G.：概念构思、资金筹措、研究方法、撰写、审稿与编辑。R. K. T.：概念构思、形式化分析、资金筹措、研究方法、监督、验证、撰写、审稿与编辑。利益冲突

作者声明以下利益冲突：S.G.和R.K.T.是300MICRONS GmbH公司的创始人、股东和总经理，该公司在3D细胞培养平台领域开展业务。数据可用性

本研究的数据可以在已发表的文章及其电子补充信息（SI）中找到。补充信息包括额外的图表（图S1、S2，表S1和S2），展示了模具的照片和高度图、薄膜厚度的测量结果，以及分析的基因列表及其相关的肾单位段和功能总结。详见DOI：https://doi.org/10.1039/d6ra02741e。致谢

本研究得到了荷兰科学研究委员会（Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek/NWO）的Gravitation项目（项目名称“材料驱动的再生：利用智能、类生物材料再生组织和器官功能”；编号024.003.013）的资助。J.R.K.S.、P.S.、P.H.和R.K.T.感谢林堡省（项目名称“Limburg Investeert in haar Kenniseconomie/LINK”；编号SAS-2014-00837和SAS-2018-02477）的财政支持。作者感谢MERLN研究所的Denis van Beurden在SEM成像方面的协助。图表使用BioRender软件（https://www.biorender.com）创建。参考文献