综合转录组分析发现PLAUR是动脉粥样硬化过程中内皮细胞向间充质细胞转化的驱动因子

《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Integrated transcriptomic analysis identifies PLAUR as a driver of endothelial-to-mesenchymal transition in atherosclerosis

　　王胜杰|王彦伟|高大|林海燕|王志成
中国浙江省宁波市宁波医疗中心丽惠丽医院心血管内科，315041

**摘要**
背景
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征是内皮功能障碍和斑块不稳定。内皮-间充质转化（EndMT）已成为导致血管重塑和疾病进展的关键过程。可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（suPAR）是一种循环中的炎症标志物，然而其在动脉粥样硬化中的功能作用及其潜在机制尚未完全明了。

**方法**
使用差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、LASSO-逻辑回归和基因集富集分析（GSEA）对公共转录组数据集（GSE43292、GSE28829、GSE163154和GSE118446）进行了分析，以识别与动脉粥样硬化进展和EndMT相关的候选基因。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）被用于功能获得和丧失实验，以评估PLAUR的作用。通过qRT-PCR、免疫荧光和Western blotting检测EndMT标志物。使用管形成和EdU测定法评估功能变化。通过药物抑制和蛋白质磷酸化分析研究PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用。

**结果**
通过综合转录组分析，PLAUR被确定为与动脉粥样硬化病变相关的候选基因。其在晚期斑块和斑块内出血样本中的表达显著增加，并在独立数据集中表现出良好的区分性能。GSEA显示内皮连接相关通路受损，且在EndMT诱导条件下PLAUR表达升高。体外实验中，重组suPAR和PLAUR过表达导致内皮细胞出现类似EndMT的表型变化，表现为CD31和VE-钙粘蛋白表达降低，α-SMA和Vimentin表达增加。PLAUR过表达还损害了血管生成能力并降低了增殖活性。机制上，PLAUR以磷酸化依赖的方式激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制PI3K可部分逆转EndMT和内皮功能障碍。此外，Snail-1和Twist-1被确定为PLAUR诱导的EndMT的下游转录介质。

**结论**
本研究表明，PLAUR是通过生物信息学优先筛选并在功能上得到验证的动脉粥样硬化中EndMT的驱动因子。suPAR/PLAUR轴通过激活PI3K/AKT/mTOR–Snail/Twist信号级联促进内皮功能障碍。这些发现为PLAUR在动脉粥样硬化中的作用提供了机制上的见解，并提示其作为调节内皮适应不良的治疗靶点的潜力。

**1. 引言**
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征是动脉壁内脂质异常积聚。随着疾病的发展，持续的脂质沉积导致管腔狭窄，从而引发严重的心血管和脑血管事件，包括心肌梗死和中风，对人类健康构成重大威胁（Botts等人，2021；Kawai等人，2024）。随着全球老龄化和生活方式的变化，动脉粥样硬化相关疾病已成为全球主要的死亡原因，给医疗保健和社会经济带来巨大负担（Bordeianu等人，2022；Botts等人，2021；Brassington等人，2022；Candelino等人，2022）。传统的风险评估策略主要依赖于脂质水平和临床症状等替代指标；然而，越来越多的关注集中在理解斑块发展和不稳定性的分子机制上，以改进风险分层和治疗靶向（Dai等人，2025）。此外，越来越多的证据表明动脉粥样硬化与其他慢性疾病（包括慢性阻塞性肺病、骨质疏松症和神经退行性疾病）之间存在复杂的相互作用（Eyre等人，2025）。
可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（suPAR）是一种主要从免疫细胞释放的循环糖蛋白，被广泛认为是反映全身炎症和免疫激活的生物标志物。在多种病理条件下，包括感染、心血管疾病、肾功能障碍和自身免疫性疾病中，已报告suPAR水平升高（Abdellatif等人，2023；Belvederi等人，2025；Gonzalez等人，2023；Hindy等人，2022）。重要的是，最近的研究表明，suPAR不仅仅是疾病严重程度的被动指标，还可能通过调节炎症反应、细胞外基质重塑和细胞迁移积极参与疾病进展（Goodchild等人，2022；Nusshag等人，2023）。然而，suPAR在动脉粥样硬化中的具体作用，特别是与内皮功能障碍的关系，仍不明确。
内皮-间充质转化（EndMT）已成为动脉粥样硬化中血管重塑和斑块进展的关键过程。在EndMT过程中，内皮细胞失去CD31和VE-钙粘蛋白等特征性标志物，并获得间充质特征，包括α-SMA和Vimentin表达增加（Qian等人，2025；Singh等人，2024）。这种表型转变促进炎症、纤维化和斑块不稳定（Zhang等人，2024）。多种信号通路，包括TGF-β/Smad、NF-κB和PI3K/AKT级联，已被证明可以调节EndMT（Dong等人，2024）。尽管取得了这些进展，但像suPAR这样的循环因子是否可以直接诱导EndMT从而促进动脉粥样硬化进展仍不清楚。
PLAUR是uPAR的膜结合形式，在细胞表面广泛表达，在多种细胞过程中起重要作用。除了其在纤溶中的经典功能外，PLAUR还参与细胞粘附、迁移、炎症和纤维化反应，并与多种病理状况相关，包括遗传性血管性水肿、代谢性疾病、毒素诱导的损伤和神经退行性疾病（Awad等人，2024；Beydoun等人，2024；Fernández-álvarez等人，2024；Miao等人，2022；Singh等人，2022）。新兴证据表明，PLAUR可能调节PI3K/AKT/mTOR等细胞内信号通路，从而影响内皮细胞行为。然而，其在内皮表型转化中的具体作用及其对动脉粥样硬化相关EndMT的贡献仍有待阐明。
Snail-1和Twist-1是调节内皮表型转化的关键转录因子。它们的上调与内皮标志物表达降低和间充质标志物表达增加密切相关，从而促进EndMT进展（Ba等人，2024；Dai等人，2023；Olejarz等人，2020）。这些转录因子作为将细胞外信号与转录重编程联系起来的中心下游效应器。尽管已经研究了这一调控网络的各个组成部分，但将细胞外suPAR/PLAUR信号与动脉粥样硬化中的内皮表型转化联系起来的系统框架仍然缺乏。在本研究中，我们结合了综合生物信息学分析和实验验证来研究PLAUR在内皮功能障碍中的作用。尽管本研究中没有直接分析循环中的suPAR，但其功能效应是通过重组蛋白处理来模拟的，其受体PLAUR是通过转录组分析优先筛选的。通过分析多个公共转录组数据集，我们确定PLAUR是与动脉粥样硬化进展、斑块不稳定性和EndMT相关转录重塑相关的候选基因。我们进一步证明，suPAR/PLAUR轴通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路和下游转录因子Snail-1和Twist-1来促进EndMT，为其在动脉粥样硬化中的作用提供了机制上的见解。

**2. 材料与方法**
2.1. 公共数据集和数据预处理
从基因表达组学数据库（GEO）中检索了与动脉粥样硬化相关的基因表达数据集。GSE43292被用作差异表达和加权基因共表达网络分析的发现队列，而GSE28829和GSE163154被用作独立验证队列，以评估PLAUR在疾病进展相关表型中的表达模式和区分性能。GSE118446是一个与内皮表型转化相关的数据集，用于进一步评估PLAUR与内皮-间充质转化（EndMT）相关转录变化之间的关联。从GEO下载表达矩阵和相应的样本注释文件，并在R中处理。当多个探针映射到同一基因符号时，根据注释文件将探针信号合并为一个表达值，并排除没有有效符号的基因。对于下游分析，根据平台特性对表达数据进行log2转换和标准化。进行主成分分析（PCA）以评估样本分布和整体数据质量。
2.2. 差异表达分析
使用R包limma识别GSE43292中动脉粥样硬化样本和对照样本之间的差异表达基因（DEGs）。使用lmFit函数拟合线性模型，然后使用eBayes函数进行经验贝叶斯调节。绝对log2倍数变化（|log2FC|）> 1且调整后的P值< 0.05的基因被认为是显著差异表达的。使用火山图和热图可视化DEGs。对于后续的综合分析，根据log2FC和调整后的P值对动脉粥样硬化组中的上调基因进行排序。
2.3. 功能富集分析
使用R包clusterProfiler和来自org.Hs.eg.db的基因注释以及KEGG REST API进行基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析，以表征与DEGs或候选基因集相关的生物功能。根据预设阈值保留显著富集的术语。最小和最大基因集大小分别设置为5和5000。富集结果用于识别与动脉粥样硬化相关的生物主题，并在重叠分析后进一步缩小候选基因范围。
2.4. 基因集富集分析
使用来自差异表达分析的排名基因列表进行基因集富集分析（GSEA）。使用分子签名数据库中的KEGG基因集作为参考。最小和最大基因集大小分别设置为5和5000，并进行了1000次排列。名义P值< 0.05的通路被认为是显著富集的。
2.5. 加权基因共表达网络分析
使用R包WGCNA进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。根据中位数绝对偏差（MAD）对基因进行排序，并保留变化最大的前50%的基因用于网络构建。使用16的软阈值构建无尺度网络。将邻接矩阵转换为拓扑重叠矩阵（TOM），并进行层次聚类，以识别模块大小至少为30且深度分割参数为3的模块。合并相似性阈值为0.75（切割高度=0.25）的模块。
2.6. 候选基因优先排序和重叠分析
从关键模块中识别出的枢纽基因与GSE43292中按log2FC和调整后的P值排序的顶级上调DEGs进行交集。重叠基因被认为是同时具有差异表达和网络连接性的高置信度候选基因。随后对重叠基因进行KEGG富集分析，以识别生物学相关的通路。
2.7. 独立队列中PLAUR表达的验证
随后在独立验证数据集GSE28829和GSE163154中检查PLAUR的表达模式。根据原始数据集注释进行组间比较，以确定PLAUR表达是否与晚期斑块表型和斑块不稳定相关特征相关。此外，使用EndMT相关数据集GSE118446来评估在EndMT诱导条件下PLAUR表达是否增加，从而将生物信息学优先筛选的候选基因与内皮表型转换联系起来。
2.8. LASSO惩罚逻辑回归和ROC分析
使用glmnet R包进行LASSO惩罚逻辑回归分析，以评估PLAUR在独立数据集中的区分能力。由于分析的是单个基因（PLAUR），因此该模型用于评估分类性能而不是特征选择。生成接收者操作特征（ROC）曲线，并计算曲线下面积（AUC）以量化预测性能。
2.9. 主成分分析
在表达数据进行z-score转换后，使用R包stats中的prcomp函数进行PCA。PCA用于降维和样本聚类模式的可视化，以便进行下游分析。
2.10. 细胞培养和处理
从美国类型培养收集中心（ATCC，美国）购买人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并在添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的内皮生长培养基（EGM-2，Lonza，瑞士）中培养细胞。细胞在含有5% CO2的湿润气氛中保持在37°C。为了诱导细胞反应，用重组人suPAR（R&D Systems，美国）刺激HUVECs。使用浓度范围从10到100 ng/mL的剂量进行初步剂量-反应实验，除非另有说明，否则选择50 ng/mL进行后续的机制和功能测定。处理后12-48小时收集细胞进行下游分析。
2.11. 质粒转染和siRNA沉默
对于PLAUR过表达，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国）根据制造商的说明将pcDNA3.1-PLAUR质粒（GenePharma，上海，中国）转染到HUVECs中。对于基因沉默，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen，美国）转染针对PLAUR、Snail-1或Twist-1（GenePharma，上海，中国）的siRNA。使用随机siRNA序列作为阴性对照。转染后24-48小时收集细胞进行后续分析。通过qRT-PCR和Western blotting验证转染效率。
2.12. 定量实时PCR
使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA，并使用商业逆转录试剂盒（Takara，日本）进行逆转录。定量实时PCR实验使用SYBR Green Master Mix在QuantStudio 6 Flex系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行。GAPDH被用作内参，相对基因表达通过2^?ΔΔCt方法计算。引物序列列在表1中。

表1. 动脉粥样硬化患者和健康对照组的基线特征。

变量 动脉粥样硬化（n = 50） 对照组（n = 30） P值
年龄（岁） 65.3 ± 8.4 63.1 ± 7.9 0.28
男性比例（%） 32（64%） 18（60%） 0.72
BMI（kg/m2） 26.4 ± 3.1 24.8 ± 2.7 0.04
高血压比例（%） 35（70%） 5（17%） <0.001
糖尿病比例（%） 18（36%） 3（10%） 0.01
LDL-C（mmol/L） 3.5 ± 0.9 2.4 ± 0.7 <0.001
他汀类药物使用比例（%） 28（56%） 0— 2.1 3.0 <0.001

2. 西部印迹（Western blotting）
总蛋白使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取。等量的蛋白通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，并用5% BSA封闭1小时。膜在4°C下过夜孵育，加入针对CD31、VE-cadherin、α-SMA、Vimentin、Snail-1、Twist-1、PI3K、phospho-PI3K、AKT、phospho-AKT、mTOR、phospho-mTOR和GAPDH的一抗。孵育后加入适当的二抗，观察并定量蛋白条带。详细的抗体信息见补充表S1.2。

3. 免疫荧光染色（Immunofluorescence staining）
HUVECs接种在玻璃盖片上，并在指定时间点用4%甲醛固定。用0.1% Triton X-100渗透后，用5% BSA封闭，然后加入针对CD31和VE-cadherin的一抗，接着加入荧光标记的二抗。F-actin用phalloidin染色，细胞核用DAPI复染。图像使用共聚焦激光扫描显微镜获取。

4. 细胞增殖实验（Cell proliferation assays）
细胞活力使用Cell Counting Kit-8（CCK-8；Dojindo，日本）根据制造商的说明进行评估。增殖活性进一步使用EdU掺入实验（RiboBio，中国）进行评估。荧光图像使用Olympus显微镜捕获，每个条件随机选择五个视野中的EdU阳性细胞进行定量。

5. 管状结构形成实验（Tube formation assay）
对于体外血管生成实验，96孔板预先涂覆Matrigel（BD Biosciences，美国）。HUVECs以每孔2 × 10^4个细胞的密度接种并孵育6-8小时。在相位对比显微镜下观察管状结构。使用ImageJ中的Angiogenesis Analyzer插件进行节点数量和总管长度的定量分析，所有组的阈值设置相同。

6. 统计分析（Statistical analysis）
所有基于细胞的实验至少进行三次独立生物学重复。数据以平均值±标准误（SEM）表示。数据正态性使用Shapiro–Wilk检验评估，方差同质性使用Levene检验评估。对于正态分布且方差相等的数据，两组之间的比较使用非配对Student's t检验进行，而多组比较使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验。双侧P < 0.05被认为具有统计学意义。

3.1. 综合转录组分析确定PLAUR为与动脉粥样硬化相关的上调基因
为了表征与动脉粥样硬化相关的转录组变化，我们分析了GSE43292数据集。主成分分析（PCA）显示对照组和动脉粥样硬化（AS）样本之间有明显的分离趋势，表明存在不同的全局表达谱（图1A）。

图1. 综合转录组分析确定PLAUR为与动脉粥样硬化相关的候选基因。
(A) GSE43292数据集的主成分分析（PCA），显示基于全局转录组谱的对照组和动脉粥样硬化（AS）样本之间的总体分离。每个点代表一个样本。
(B) GSE43292中差异表达基因的火山图。上调基因用红色表示，下调基因用绿色表示，非显著基因用黑色表示。PLAUR作为AS样本中的代表性上调基因突出显示。差异表达基因的识别标准为|log2FC| > 1且调整后的P < 0.05。
(C) GSE43292中差异表达基因的热图。行代表基因，列代表样本。红色表示相对较高的表达，蓝色表示相对较低的表达。层次聚类将AS样本与对照组区分开。
(D) 差异表达基因的功能富集分析。上面板显示KEGG通路富集，以弦图形式呈现；下面板显示基因本体（GO）分子功能富集，以气泡图形式呈现。气泡大小表示基因数量，颜色表示富集显著性。

使用|log2FC| > 1和调整后的P < 0.05的阈值，识别出一组显著失调的基因。火山图显示AS样本中广泛的转录变化，其中PLAUR显著上调（图1B）。一致地，差异表达基因的层次聚类清楚地将AS样本与对照组区分开（图1C）。

为了进一步探索这些基因的功能意义，进行了GO和KEGG富集分析。GO分析显示与转录调控和核酸结合相关的分子功能富集，而KEGG通路反映了显著的信号传导和疾病相关变化（图1D）。这些结果共同表明动脉粥样硬化中存在广泛的转录组重塑，并确定PLAUR为可能参与疾病进展的候选基因。

3.2. 基于WGCNA的网络分析精炼与动脉粥样硬化相关的候选基因
为了进一步优先考虑与动脉粥样硬化相关的基因，在GSE43292中进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）。选择16的软阈值构建无尺度网络（图2A）。

图2. 基于WGCNA的网络分析精炼与动脉粥样硬化相关的候选基因。
(A) 分析GSE43292中不同软阈值下的无尺度拓扑拟合指数。选择16的软阈值进行网络构建。
(B) 识别的共表达模块的聚类树状图和基于特征基因的相似性热图。每种颜色代表一个单独的模块。
(C) 模块-特征关系分析显示模块特征基因与动脉粥样硬化表型之间的相关性。每个单元格中的数字表示相关系数及其对应的P值。深青色模块与AS的正相关性最强。
(D) KEGG通路富集分析显示从WGCNA枢纽基因和高表达差异基因的交集中获得的重叠候选基因。气泡大小表示基因数量，颜色表示富集显著性。
(E) 文氏图显示AS相关WGCNA模块的枢纽基因与GSE43292中上调的前50个基因之间的重叠，得到29个重叠的候选基因。

识别出多个共表达模块（图2B），模块-特征关系分析显示深青色模块与动脉粥样硬化的正相关性最强（图2C）。

使用|MM| > 0.8和|GS| > 0.1的标准从该关键模块中提取枢纽基因。这些基因与上调的前50个DEGs相交，得到29个重叠的候选基因（图2E）。

KEGG富集分析显示这些基因在与NOD样受体信号传导、坏死性凋亡、NF-κB信号传导和p53信号传导相关的通路中显著富集（图2D），表明炎症激活和细胞死亡过程是动脉粥样硬化相关基因网络的核心。

这些发现进一步缩小了候选基因的范围，并加强了PLAUR的相关性。

3.3. PLAUR与斑块进展、斑块不稳定性和EndMT相关的转录重塑相关
为了验证PLAUR的相关性，我们在独立数据集中检查了其表达。在GSE28829中，PLAUR在晚期斑块中的表达显著高于早期病变（图3A）。同样，在GSE163154中，PLAUR在斑块内出血（IPH）样本中的表达明显高于非IPH样本（图3D）。

图3. PLAUR与斑块进展、斑块不稳定性和EndMT相关的转录重塑相关。
(A) 维恩图显示GSE28829中晚期和早期动脉粥样硬化斑块中的PLAUR表达。
(B) 使用LASSO惩罚逻辑回归评估PLAUR在GSE28829中的判别性能的接收者操作特征（ROC）曲线。曲线下面积（AUC）在图中标出。
(C) GSE43292的基因集富集分析（GSEA）显示与内皮连接重塑和脂质相关信号传导相关的代表性富集通路。显示了GAP_JUNCTION、ARACHIDONIC_ACID_METABOLISM和ETHER_LIPID_METABOLISM的富集分数曲线。
(D) 维恩图显示GSE163154中非斑块内出血（non-IPH）和斑块内出血（IPH）样本中的PLAUR表达。
(E) 使用LASSO惩罚逻辑回归评估PLAUR在GSE163154中的判别性能的ROC曲线。AUC在图中标出。
(F) 维恩图显示GSE118446中EndMT相关数据集中的PLAUR表达。诱导组的PLAUR表达高于未处理组。

为了评估其判别性能，进行了LASSO逻辑回归和ROC分析。PLAUR在两个数据集中的分类性能均良好，GSE28829的AUC为0.885，GSE163154的AUC为0.882（图3B-E）。

基因集富集分析（GSEA）显示与连接相关的通路（包括GAP_JUNCTION）在对照组样本中相对富集，表明疾病状态下内皮细胞间通信受到破坏（图3C）。

此外，在EndMT相关数据集GSE118446中，PLAUR在诱导组的表达显著高于未处理组（图3F），将PLAUR与内皮表型转变联系起来。总体而言，这些结果表明PLAUR与动脉粥样硬化进展、斑块不稳定性和EndMT相关的转录变化相关。

3.4. suPAR诱导内皮细胞发生EndMT样表型变化
为了研究suPAR对内皮细胞可塑性的影响，用重组suPAR（50 ng/mL）处理HUVECs。观察到从鹅卵石样表型到纺锤形形态的明显形态转变（图4A）。

图4. suPAR诱导内皮细胞向间充质细胞转变。
(A) 用重组suPAR（50 ng/mL）处理48小时后HUVECs的形态变化。显示代表性的相位对比图像。
(B) 用50 ng/mL suPAR处理24小时后，通过CCK-8测定细胞活力。y轴表示相对于未处理对照组的相对细胞活力。
(C) 用50 ng/mL suPAR处理48小时后HUVECs中CD31（红色）、VE-cadherin（绿色）和α-SMA（红色）的免疫荧光染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。显示代表性图像。
(D) 相对于对照细胞，免疫荧光强度的量化。y轴表示标准化荧光强度。
(E) 用50 ng/mL suPAR处理48小时后，CD31、VE-cadherin、α-SMA和Vimentin表达的Western blot分析。GAPDH用作加载对照。密度计量化相对于对照显示。所有数据以三个独立实验的平均值±标准误（n = 3）表示。根据需要使用非配对Student's t检验或单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验。?P < 0.05；??P < 0.01与对照组相比。

CCK-8测定显示处理后24小时和48小时细胞代谢活性略有增加（图4B）。qRT-PCR分析显示内皮标记物（CD31和VE-cadherin）随时间减少，而间充质标记物（α-SMA和Vimentin）增加（图4C）。这些变化通过免疫荧光（图4D）和Western blotting（图4E）进一步确认。这些发现表明外源性suPAR诱导内皮细胞发生EndMT样表型变化。

3.5. PLAUR过表达诱导EndMT样表型变化
为了确定PLAUR是否介导suPAR的效果，我们在HUVECs中过表达PLAUR。qRT-PCR分析显示CD31和VE-cadherin的表达减少，而α-SMA和Vimentin的表达增加（图5A）。这些变化通过Western blotting在蛋白质水平得到确认（图5B）。

图5. PLAUR的基因上调再现了suPAR诱导的EndMT表型，并抑制了血管生成。
(A-B) 转录和蛋白质分析显示内皮标记物（CD31、VE-cadherin）减少，间充质标记物（α-SMA、Vimentin）增加。
(C) 代表性图像显示用PLAUR过表达构建（PLAUR-OE）转染后HUVECs的形态变化。定量数据以平均值±标准误（SEM）表示；?p < 0.05。

形态分析显示PLAUR过表达的细胞表现出向延长、纺锤形表型的转变（图5C）。这些结果表明PLAUR过表达再现了EndMT的分子和形态特征。

3.6. PLAUR过表达损害血管生成能力和增殖能力
为了评估功能变化，进行了管状结构形成和EdU测定。PLAUR过表达显著损害了血管生成能力，表现为节点数量和总管长度减少（图6A）。

图6. PLAUR过表达抑制血管生成能力。
(A) 管状结构形成测定显示PLAUR过表达细胞中的节点点和总管长度显著减少。
(B) EdU掺入测定显示PLAUR过表达的HUVECs的增殖活性降低。定量数据以平均值±标准误（SEM）表示；?p < 0.05。

此外，EdU掺入测定显示PLAUR过表达细胞的增殖活性显著降低（图6B）。这些发现表明PLAUR诱导的EndMT伴随着内皮功能障碍。

3.7. PLAUR调节PI3K/AKT/mTOR信号传导，其抑制可恢复内皮功能障碍
为了研究下游信号传导，我们检查了PI3K/AKT/mTOR通路。qRT-PCR分析显示PLAUR敲低并未显著改变PI3K、AKT或mTOR的mRNA水平（图7A）。PLAUR通过PI3K/AKT/mTOR信号轴促进内皮-间充质转化。（A）qRT-PCR检测显示，在PLAUR敲低后，PI3K、AKT或mTOR的mRNA表达没有显著变化。（B）Western blot分析表明，沉默PLAUR导致PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平降低。（C）在管形成实验中，给予PI3K抑制剂LY294002部分逆转了PLAUR过表达引起的血管生成障碍。（D–E）qRT-PCR和Western blot分析均显示，LY294002处理减少了PLAUR诱导的内皮-间充质转化（EndMT）标志物的表达。结果以平均值±标准误差（SEM）表示；?p < 0.05。然而，Western blot分析显示，PLAUR敲低显著降低了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，而总蛋白水平保持不变（图7B）。用PI3K抑制剂LY294002处理显著改善了血管生成功能（图7C），并部分逆转了与EndMT相关的分子变化（图7D和E）。这些发现表明，PLAUR主要通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路来促进内皮功能障碍。

3.8. Snail-1和Twist-1介导PLAUR诱导的内皮-间充质转化（EndMT）
为了确定下游的转录调节因子，我们检测了Snail-1和Twist-1。免疫荧光分析显示，在PLAUR过表达细胞中，这两种因子的核积累增加（图8A）。

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图8. PLAUR驱动的内皮-间充质转化由转录因子Snail-1和Twist-1介导。（A）免疫荧光染色显示，在PLAUR过表达的细胞中，Snail-1和Twist-1的核积累增强。（B）Western blot证实了Snail-1和Twist-1的蛋白质表达升高。（C）在PLAUR-OE细胞中通过siRNA介导的Snail-1或Twist-1敲低后，使用qRT-PCR和Western blot评估EndMT标志物的表达。结果以平均值±标准误差（SEM）表示；?p < 0.05。Western blot证实了它们在蛋白质水平上的上调（图8B）。敲低Snail-1或Twist-1显著减弱了与EndMT相关的变化（图8C），表明这两种转录因子都是PLAUR介导的内皮-间充质转化所必需的。这些结果确定Snail-1和Twist-1是将PLAUR信号与内皮表型转化联系起来的关键下游介质。

4. 讨论
本研究结合了生物信息学筛选和基于细胞的机制验证，以研究suPAR/PLAUR轴在内皮-间充质转化（EndMT）中的作用，这与动脉粥样硬化相关。通过对公共转录组数据的综合分析，我们确定了PLAUR是一个与动脉粥样硬化病变、斑块进展和斑块不稳定性相关的候选基因。随后的体外实验表明，外源性suPAR刺激和强制PLAUR过表达都促进了内皮细胞的EndMT样表型变化，伴随着血管生成能力的受损和PI3K/AKT/mTOR–Snail/Twist信号通路的激活。这些发现共同支持了一个模型，即PLAUR作为一个生物信息学上优先考虑并在实验上得到验证的介质，将动脉粥样硬化的转录重编程与内皮表型转化联系起来。
本研究的一个重要优势在于，PLAUR的选择并非仅基于先前的知识或孤立的实验观察。相反，它是通过逐步的生物信息学工作流程确定的。在发现数据集中，动脉粥样硬化组织表现出广泛的转录重编程，PLAUR是显著上调的基因之一。WGCNA进一步通过识别与动脉粥样硬化最相关的模块来精炼候选基因范围，枢纽基因与高度上调的DEGs之间的重叠分析产生了一组高置信度的候选基因。在独立数据集中的验证表明，PLAUR的表达不仅在晚期病变中增加，而且在有斑块内出血的斑块中也增加，这表明PLAUR与疾病进展和斑块脆弱性有关。此外，PLAUR在这些验证队列中的区分性能支持了其作为动脉粥样硬化相关进展特征基因的相关性。
与现有文献一致，EndMT已被确定为促进血管重塑、炎症激活和斑块不稳定的关键机制（Cho等人，2025年；Olejarz等人，2020年）。包括TGF-β/Smad和NF-κB介导的典型通路已被广泛证明可以调控这一转化过程（Lee等人，2018年）。我们的生物信息学结果扩展了这一框架，表明连接组织连接的转录程序在对照组织中相对富集，表明动脉粥样硬化病变中内皮连接稳态受到破坏。这一观察在生物学上是有意义的，因为内皮细胞间相互作用的破坏是内皮表型转化之前的一个重要早期事件。与此解释一致，对一个独立的EndMT相关数据集的分析进一步显示，在EndMT诱导条件下PLAUR的表达增加，从而将这个候选基因不仅与动脉粥样硬化病变联系起来，还与内皮表型转换联系起来。这些发现为后续在HUVECs中的机制实验提供了强有力的依据。
基于细胞的验证实验支持suPAR/PLAUR轴在促进EndMT中的直接作用。外源性suPAR处理诱导了从鹅卵石状内皮表型到纺锤形间充质样状态的典型形态转变，伴随着内皮标志物的下调和间充质标志物的上调。PLAUR过表达在很大程度上再现了这些效应，表明PLAUR不仅与这一过程相关，而且在功能上也对其有贡献。此外，PLAUR过表达损害了管形成并减少了EdU的掺入，表明PLAUR驱动的表型转化伴随着内皮功能障碍。这些发现与EndMT不仅促进标志物转换，还促进动脉粥样硬化期间内皮细胞功能恶化的概念一致。
从机制上讲，我们的结果表明PLAUR主要通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路来促进EndMT。值得注意的是，PLAUR敲低并没有显著改变PI3K、AKT或mTOR的mRNA表达水平，而这些蛋白质的磷酸化明显降低。这一发现表明PLAUR主要在翻译后水平上调节这一通路，而不是通过转录控制。用LY294002药理学抑制PI3K部分恢复了PLAUR过表达引起的EndMT表型和血管生成缺陷，支持了这一信号通路的功能重要性。因此，尽管最初的生物信息学分析在转录组水平上确定了PLAUR，但下游机制似乎主要依赖于磷酸化介导的信号激活。
有趣的是，在suPAR刺激后观察到CCK-8活性略有增加。由于CCK-8主要反映细胞代谢活性而不是绝对细胞数量，这一发现可能表明在EndMT早期阶段与PI3K/AKT/mTOR信号相关的短暂代谢激活。据报道，这种代谢重编程伴随着表型转换过程之前的增殖下降。需要注意的是，CCK-8检测测量的是细胞代谢活性而不是直接增殖率。相比之下，EdU检测专门评估DNA合成和细胞周期进展。PLAUR过表达观察到的EdU掺入减少表明尽管代谢活性增加，但增殖能力受损。这些发现表明suPAR/PLAUR信号可能促进代谢激活和表型转换，同时限制DNA复制，突出了这两种检测捕获的不同生物学指标。
在转录调控水平上，PLAUR促进了Snail-1和Twist-1的表达和核积累，敲低任一因子都显著减弱了PLAUR诱导的EndMT。这一结果与Snail和Twist家族蛋白作为EMT和EndMT的核心驱动因素的已知作用一致（Yang等人，2009年）。重要的是，我们的发现将这些转录因子定位在PLAUR–PI3K/AKT/mTOR轴的下游，并支持一个机制级联，其中细胞外suPAR/PLAUR信号被转化为破坏内皮身份并促进间充质转化的转录程序。
从机制上讲，PI3K/AKT/mTOR激活如何导致Snail-1和Twist-1水平升高可能涉及多层面的调控。首先，PI3K/AKT信号可以通过下游效应器促进与EndMT/EMT相关的转录程序，增强EMT转录因子的表达。其次，mTOR轴——特别是mTORC1——直接调节依赖帽的翻译，可能提高Snail-1/Twist-1 mRNA的翻译效率，从而在不一定需要mRNA水平大幅变化的情况下增加蛋白质丰度。第三，AKT驱动的信号也可能通过调节泛素-蛋白酶体依赖的降解途径来影响蛋白质稳定性，从而延长Snail-1和Twist-1蛋白的半衰期。尽管确定主导机制超出了本研究的范围，但这些可能性提供了一个合理的框架，将PLAUR诱导的PI3K/AKT/mTOR激活与Snail-1/Twist-1上调联系起来。
本研究有几个显著的进展。首先，它通过综合生物信息学工作流程而不是单一数据集观察来识别PLAUR，从而加强了机制研究的合理性。其次，它不仅将PLAUR与动脉粥样硬化病变联系起来，还将其与进展相关表型和EndMT相关的转录程序联系起来。第三，它通过PI3K/AKT/mTOR–Snail/Twist信号级联实验性地证明了PLAUR驱动内皮表型转化和功能障碍。总体而言，这些发现支持PLAUR不仅仅是动脉粥样硬化中的被动标志物，而且可能直接参与内皮适应不良。
然而，也应承认几个局限性。首先，尽管整合了多个公共数据集来优先考虑PLAUR，但生物信息学发现仅在内皮细胞模型中得到了实验验证，其在体内的相关性仍有待确定。其次，由于当前研究主要关注从分析工作流程中出现的PLAUR，因此在生物信息学筛选期间识别的其他重叠基因没有同时进行调查，它们也可能参与动脉粥样硬化重塑。第三，虽然确定了PI3K/AKT/mTOR–Snail/Twist轴是关键的下游机制，但未探讨其他可能参与suPAR/PLAUR介导的内皮功能障碍的信号通路。最后，当前工作集中在HUVECs上，尚不清楚同样的机制是否在其他内皮亚型或更复杂的血管微环境中起作用，这需要进一步研究。
总之，本研究证明了PLAUR是一个生物信息学上优先考虑并在实验上得到验证的动脉粥样硬化中内皮-间充质转化的介质。通过整合转录组筛选、独立数据集验证和机制实验，我们展示了suPAR/PLAUR轴通过PI3K/AKT依赖的Snail-1和Twist-1激活来促进内皮功能障碍。这些发现提供了PLAUR如何促进动脉粥样硬化中内皮适应不良的机制见解，并为进一步的转化研究提供了基础。

5. 结论
总之，本研究结合了生物信息学筛选和基于细胞的功能验证，阐明了suPAR/PLAUR轴在动脉粥样硬化相关的内皮功能障碍中的作用。通过逐步的转录组分析，PLAUR被确定为与动脉粥样硬化病变、疾病进展和斑块不稳定性相关的候选基因。独立数据集验证进一步支持了它与晚期和高风险斑块表型的强相关性，以及其与EndMT相关转录程序的联系。
机制实验表明，suPAR/PLAUR轴的激活促进了内皮-间充质转化，其特征是内皮标志物的丢失、间充质特征的获得和血管生成能力的受损。在信号水平上，PLAUR主要通过磷酸化依赖的机制调节PI3K/AKT/mTOR活性，导致转录因子Snail-1和Twist-1的激活。这些发现建立了一个功能性的PLAUR–PI3K/AKT/mTOR–Snail/Twist信号级联，将细胞外刺激与内皮表型转化联系起来。
总体而言，这些研究提供了趋同的证据，表明PLAUR不仅是与动脉粥样硬化相关的生物信息学优先基因，而且是EndMT和内皮功能障碍的机制驱动因素。这些结果扩展了目前对suPAR/PLAUR信号在血管病理学中的理解，并表明针对这一轴可能是调节动脉粥样硬化中内皮适应不良的潜在策略。