利用基于DFT设计的碳布负载ZrO2/分子印迹聚合物对氟西汀进行电化学检测

《Journal of Science: Advanced Materials and Devices》：Electrochemical Detection of Fluoxetine Using a Carbon Cloth–Supported ZrO2/Molecularly Imprinted Polymer Designed by DFT

　　Leila Asadi Kafshgari | Mohammad Soleimani Lashkenari | Mohsen Ghorbani
化学工程系，Babol Noshirvani 技术大学，Babol，伊朗

**摘要**
抑郁症的诊断不足和治疗不足问题已被认为是重大的公共卫生问题，这促使人们努力提高对抑郁症的认识，并使用抗抑郁药（如氟西汀（FLX）进行治疗。然而，抗抑郁药过度使用的潜在危害却未受到足够的关注。因此，提供用于监测抗抑郁药的实用设备可以提高生活质量。由于二氧化锆纳米颗粒（ZrO2 NPs）在改性聚合物基质（分子印迹聚合物/碳布，EMIP/CC）中的协同作用，开发出了一种可行的氟西汀（FLX）检测传感器。通过密度泛函理论（DFT）计算确定了最佳的FLX与甲基丙烯酸比例。前线分子轨道分析显示，HOMO和LUMO能量分别为-6.31 eV和-1.51 eV，对应的HOMO-LUMO间隙为4.79 eV。使用FTIR、XRD和FESEM-EDX分析验证了EMIP/ZrO2/CC的协同效应。与裸露的CC电极相比，该传感器在50 mV/s的扫描速率下阳极峰电流增加了127%，电活性表面积为0.61 cm2，这表明由于印迹聚合物和ZrO2纳米颗粒的协同作用，其电催化活性得到了增强。对FLX的定量研究表明，检测限和定量限分别为3.94 nM和11.90 nM。此外，灵敏度、重现性和选择性也得到了令人满意的评估。这些有利的结果，加上EMIP/ZrO2/CC在实际样品中的卓越效率，表明该设备在传感器应用中将是可靠的。

**1. 引言**
氟西汀（FLX）以Prozac和Sarafem等品牌名称销售，是全球最常用的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）抗抑郁药之一。它与蛋白质结合能力强，但能轻易穿过血脑屏障，从而对中枢神经系统（CNS）发挥作用。虽然氟西汀（FLX）被广泛用作抗抑郁药，但其中约11%在体内代谢后以原形通过尿液排出[1] [2]。这些未代谢的FLX及其代谢物可能通过废水系统进入水生生态系统，因为传统的处理方法往往无法完全去除这些物质。因此，FLX及其代谢物可能在淡水环境中积累，据报道浓度可高达596 ng/mL。这种水平已被证明会对水生生物和生态系统造成显著损害[3]。这强调了不仅出于治疗目的，也出于环境保护考虑，监测FLX的重要性。
氟西汀（FLX）已通过分光光度法、液相色谱法、毛细管电泳法、电位法和伏安法等技术在其药物制剂和血浆中被广泛检测到[4] [5]。然而，这些传统方法虽然具有分析价值，但通常需要昂贵的实验室设备，限制了其在受控环境中的使用。相比之下，电化学传感器在FLX检测方面具有显著优势，包括更低的操作成本、更快的响应时间、便携性、更高的灵敏度和简化的样品制备程序[6] [7]。
由于电化学传感器的成本效益、快速响应时间、高灵敏度和便携性，它们在制药和环境应用中越来越受欢迎[8] [9] [10] [11] [12]。这些传感器的性能很大程度上取决于电极表面的性质，因此表面修饰对于提高其分析能力至关重要[13] [14] [15]。常用的修饰剂包括导电聚合物、金属和金属氧化物纳米颗粒以及碳基纳米材料，以改善电子转移、增加表面积并促进分析物吸附[9] [13] [16] [17]。导电聚合物增强了电荷传输并提供了功能性结合位点，而纳米材料则贡献了催化活性和稳定性。此外，结合分子识别元素（如分子印迹聚合物）与纳米结构修饰剂可以显著提高对目标分子的选择性[16]。有效结合这些元素对于设计高性能电化学传感平台至关重要[18]。碳布（CC）是一种高度通用且成本效益高的电化学传感器基底，具有机械柔韧性、优异的导电性和可定制的尺寸。这些特性使其区别于玻璃碳、碳浆和丝网印刷电极等更刚性的电极材料。CC的柔韧性和层次结构允许创建各种几何形状和大小的传感平台，从而加快分析物吸附[7] [19]。电化学FLX检测的有效性在很大程度上取决于修饰剂的选择，这决定了传感器的性能。在这种情况下，基于分子印迹聚合物（MIPs）的传感器是选择性检测的突出选择。MIPs是具有特定结合腔的合成聚合物，其形状、大小和功能特性与目标分子相匹配，类似于钥匙-锁机制[16] [20] [21] [22]。这项技术整合了材料化学、生物化学和聚合物化学的原理，提供了高分子特异性、优异的结构稳定性和可预测性。与天然受体不同，MIPs被设计为在3D聚合物网络中形成稳定的识别位点，可以重新结合并识别目标分子。这些网络在广泛的pH和温度条件下保持稳定性[23] [24]。然而，MIP基传感器的广泛应用仍面临挑战，包括有限的重现性、相对较低的表面积和较差的固有导电性。整合纳米材料（如纳米氧化锆（ZrO2 NPs）提供了一个有前景的解决方案。ZrO2 NPs具有优异的生物相容性、高结构稳定性和大的表面积以及强的机械性能，使其成为改善MIP传感器结构和电化学性能的理想选择[19] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31]。最近的研究进一步证明了MIP-纳米材料复合材料在开发高性能电化学传感器以选择性检测分析物方面的显著贡献，增强了这些系统在实际应用中的潜力[32] [33]。

**2. 计算方法**
所有密度泛函理论（DFT）计算均使用Materials Studio软件套件中的DMol3模块进行。几何优化采用混合B3LYP交换-相关功能与双数值加极化（DNP）基组结合进行。使用Grimme的DFT-D校正（G06方案）考虑了色散相互作用，并自定义了缩放参数以正确描述预聚合复合物中的非共价相互作用。所有计算都在中性闭壳层系统的自旋限制形式下进行。采用精细的数值积分网格和十六极辅助密度以提高准确性。使用COSMO隐式溶剂模型包含溶剂效应，介电常数为36.7，代表DMF介质。应用了费米占据数，并在整个计算过程中使用了3.7 ?的全局轨道截止值。
这些组分之间的相互作用能量（ΔE）在决定其结合作用的强度和选择性方面起着决定性作用。模板-单体结合相关的相互作用能量（ΔE）使用公式（1）计算，提供了印迹过程热力学优势的定量描述[1]。

(公式1略)

**2.3. 聚合物基质的制备**
为了合成MIP，将0.5 mmol的FLX和3 mmol的MAA单体溶解在20 mL的DMF中，以形成预聚合单体-模板复合物。随后，在氮气氛围下（0-4 °C）将7.5 mmol的EGDMA和30 mg的AIBN加入混合物中以引发聚合。然后将反应混合物转移到维持在60 °C的石蜡油浴中并聚合24小时，得到FLX-MIP。相应的非印迹聚合物（NIP）在不含模板分子（FLX）的情况下使用相同程序制备[40]。

**2.4. ZrO2 NPs/EMIP的制备**
为了制备MIP/ZrO2，将100 mg的ZrO2粉末分散在25 mL的DMF中。随后，在分子印迹聚合过程中，向分散液中加入0.5 mmol的FLX、3 mmol的MAA、7.5 mmol的EGDMA和5 mmol的AIBN，并在冰浴中混合30分钟。在石蜡油浴中完成聚合过程后，用醋酸/甲醇（9:1摩尔比）和醋酸/乙醇（9:1摩尔比）溶液反复洗涤所得产物，直到UV-Vis光谱中检测不到与模板相关的吸收峰。FLX在UV-Vis光谱中的预期波长通常在230-235 nm左右。这一吸收范围是氟西汀芳香结构的特征，由于其共轭π电子系统而在紫外区域表现出吸光性。最后，将所得粉末在50 °C的烤箱中干燥24小时。

**2.5. 电化学技术**
为了评估和比较工作电极的电荷转移能力，首先对氟西汀（FLX）母液进行了电化学分析。这包括剂量测定、稳定性测试、干扰研究、扫描速率实验和计时库仑法。这些初步实验提供了关于传感器性能、灵敏度和重现性的关键见解，证明了传感器在受控实验室条件下产生一致结果并保持稳定性的能力。电荷转移特性以及传感器检测FLX的能力经过了仔细评估，以确保在各种分析条件下都能可靠地工作。在这些初步测试之后，采用了电化学阻抗谱（EIS，频率范围：10^-2 Hz至10^5 Hz）和计时库仑法（CC）来评估电极在含有0.1 M KCl的10 mM [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的电子转移效率和电荷转移电阻。此外，还使用了差分脉冲伏安法（DPV）来监测FLX的电化学氧化过程并确定检测限（LOD）。这些分析是在0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7）中进行的，这种缓冲液是用于药物化合物电化学分析的标准介质。DPV参数被优化以获得最佳的灵敏度和重复性，包括扫描速率为50 mV/s、阳极方向上的电位范围为0.5至1.5 V、步长为0.005 V、调制幅度为0.025 V、调制时间为0.05 s、间隔时间为0.5 s以及总采集时间约为28 s。选择这些条件是为了确保检测FLX时的最佳性能。最后，为了评估传感器在更复杂环境中的适用性，使用血浆和血清样本进行了回收测试。DPV技术被用来评估传感器在生物基质中准确检测FLX的能力，从而验证了传感器在实际应用中的有效性[41]。

3. 结果讨论
3.1. 特性分析
合成样品（FLX、NIP、MIP、EMIP、MIP/ZrO2和EMIP/ZrO2）的傅里叶变换红外（FTIR）光谱分别显示在图1a和1b中。如图1b中的FLX样品光谱所示，3151、3010、2888、1656、1323、1250和1217 cm^-1处的吸收带对应于几种特征振动。具体来说，3151 cm^-1处的峰对应于胺基（N–H伸缩）的振动，而3010和2888 cm^-1处的峰分别来源于C–H和CH3伸缩振动。1656 cm^-1处的带与C=C伸缩相关，1323和1217 cm^-1处的带则归属于芳香C–O（苯氧基）和C–N键的伸缩模式。此外，1250 cm^-1附近的吸收表明FLX结构中存在卤素官能团[42]。另外，750 cm^-1附近的吸收带归因于C6H6芳香环的特征伸缩振动。由于MIP和NIP样品具有相似的聚合物骨架，它们的FTIR图谱显示出几乎相同的特征，主要振动模式出现在3551、3538、2989、2888、1730、1458、1250和1157 cm^-1。1730 cm^-1处的显著峰与C=O伸缩相关，而大约1157和1250 cm^-1处的模式与芳香C–O伸缩有关。这些特征证实了单体和交联剂在聚合物基质中的掺入。此外，3437和1256 cm^-1处观察到的N–H和C–N带进一步验证了FLX在聚合物网络中的存在[2]、[5]。从图1b可以看出，大约519、523、754和755 cm^-1处的强吸收带对应于ZrO2金属–氧伸缩的特征振动。1550和1665 cm^-1处的带与羟基（–OH）的弯曲和伸缩模式相关。此外，3500 cm^-1附近的宽带代表O–H伸缩振动，表明表面存在羟基官能团。这些特征吸收带证实了ZrO2在合成复合材料中的有效掺入[43]、[44]。在MIP/ZrO2的FTIR光谱中，大约3408 cm^-1处的N–H伸缩振动、1327 cm^-1附近的C–F卤素伸缩带以及1157-1256 cm^-1区域内的苯氧基相关C–O伸缩特征共同证实了在药物存在下聚合物基质的成功形成。相反，模板提取后EMIP/ZrO2光谱中这些诊断峰的消失表明药物分子已从聚合物基质中有效去除。

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图1. (a, b) 样品的FTIR光谱，以及(c) XRD图谱。
X射线衍射分析仅用于验证聚合物链中是否存在ZrO2纳米颗粒，因为合成的聚合物呈现无定形结构。MIP、EMIP和EMIP/ZrO2样品的XRD图谱在2θ范围5-80°内记录，以检查和确认其结晶性。图1c显示了EMIP/ZrO2样品的衍射图谱，其中24.43°、28.17°、31.45°、34.12°、35.32°、40.71°和50.08°处的反射对应于ZrO2的单斜晶相（JCPDS 01-089-9066）[45]、[46]。相比之下，MIP和EMIP样品的XRD轮廓显示出无定形聚合物基质的宽而模糊的晕圈，证实了这些材料的非晶性质。

图2展示了制备材料的FE-SEM图像和EDX技术结果。如图2a–c所示，EMIP样品的表面形态较为粗糙，而NIP和MIP样品的表面相对光滑。EMIP样品表面的粗糙是由于从聚合物基质中去除模板所致，这使得EMIP样品的可用表面积比NIP和MIP更大[47]。从图2d可以看出，ZrO2纳米颗粒呈现出聚集且球形的形态，平均直径约为20-40 nm。根据MIP/ZrO2和EMIP/ZrO2的图像（图2e-f），球形ZrO2纳米颗粒分布在聚合物基质表面。

此外，根据分析结果，MIP样品含有碳、氧、氯、氮和氟，证实了药物存在于聚合物结构中。NIP和EMIP样品包含碳和氧。ZrO2样品含有锆和氧，而EMIP/ZrO2样品由碳、锆和氧组成。在MIP/ZrO2光谱中检测到的微量F、N和Cl可能归因于MIP组成中FLX与单体的比例较低。各元素的原子百分比见表1。

表1. eZAF Smart Quant分析结果
选定的区域
元素 MIPE EMIP MIP MIP/ZrO2 EMIP/ZrO2
C 76.4 71.4 -79.4 74.5 28.5 18.9 25.0 25.2 0.5 0.4
O 2.0 28.5 74.7 18.9 25.0 0.5 0.4 0.2 -0.3
F 1.3 -- -- 0.8 -- 0.0 -- -0.8

3.2. FLX-MAA预聚物复合物的DFT引导设计和相互作用分析
在包含分散和溶剂化效应的B3LYP/DNP理论水平上，获得了FLX、MAA和FLX–6MAA预聚物复合物的优化几何结构。优化的FLX结构保持了其灵活的分子框架，暴露出如仲胺和醚氧等化学相关的官能团，这些官能团可以进行非共价相互作用。优化的MAA分子保留了其特征性的羧酸功能，提供了氢键供体和受体位点。为了确保预聚物组成的可靠选择，通过评估不同化学计量比（从1:1到1:8）的FLX–MAA复合物进行了系统的DFT研究。计算了这些配置的相互作用能量，以比较它们的相对热力学稳定性。在所研究的系统中，FLX–6MAA复合物表现出最有利的相互作用能量，表明这种比例提供了模板和单体分子之间最稳定和最协调的相互作用网络。因此，选择1:6的比例作为后续实验合成的最佳组成。
在优化的FLX–6MAA复合物中，六个MAA分子以空间分布的方式排列在FLX模板周围。该几何结构反映了模板-单体相互作用和单体-单体稳定之间的平衡，从而形成了结构稳定的预聚物组装体。模板或单体单元中都没有出现过度的结构畸变，表明所应用的计算协议成功捕捉到了溶剂化条件下的现实且能量上有利的排列。
使用超分子方法计算了FLX–6MAA复合物的相互作用能量（ΔE），提供了模板-单体结合热力学有利性的定量度量。计算出的结合能（-8.3412 kJ/mol）表明FLX–6MAA预聚物复合物的形成在能量上是可行的，证实了多个MAA单元在溶剂环境中自发地围绕FLX分子聚集。重要的是，这一计算结果直接指导了分子印迹聚合物的实验设计。基于最稳定的预聚物复合物选择1:6的FLX:MAA比例，有助于在聚合后形成定义明确且高密度的识别位点。这种优化的印迹效应与观察到的EMIP/ZrO2/CC电极的增强电化学性能一致，包括更高的峰值电流、更低的电荷转移电阻以及对FLX检测的更高灵敏度。
尽管结合能反映了多种非共价相互作用的累积效应，但其大小表明FLX–6MAA组装在预聚物阶段足够稳定。这种稳定性对于分子印迹尤为重要，因为它表明多个单体分子可以共同贡献于在模板分子周围形成坚固且定义明确的复合物。

电静力势（ESP）图被用来可视化电荷分布并识别MAA、FLX和FLX–6MAA复合物中的优选相互作用区域（图3）。FLX的ESP图显示，在质子化的胺官能团周围有明显的正电静力势，而负电势区域与电负性原子如醚氧和芳香骨架相关。相比之下，MAA在羰基氧周围显示出强烈的负电静力势，在酸性羟基氢上有一个正电区域，这表明其适合进行电静力和氢键介导的相互作用。

在FLX–6MAA复合物中，ESP分布在整个组装体上更加均匀。多个MAA分子的存在在FLX模板周围形成了一个集体的电静力环境，而不是单一的局部相互作用位点。这种非局域化的电静力场表明模板和单体集合体之间的有效电荷互补性，支持了稳定预聚物复合物的形成。因此，ESP图证实了结合能的结果，表明电静力相互作用在溶剂化条件下对稳定FLX–6MAA系统起着重要作用。这种有利的电静力互补性有助于在预聚物阶段形成稳定的模板-单体组装体，这对于在最终印迹聚合物中生成选择性结合腔体至关重要。

前沿分子轨道（FMO）研究用于阐明甲基丙烯酸（MAA）、氟西汀（FLX）和FLX–6MAA预聚物复合物的电子特性和相互作用动态（图4a-c）。HOMO和LUMO能量是分子反应性和稳定性的关键描述符，而HOMO–LUMO能量差（ΔEgap）提供了关于电子柔软性和相互作用倾向的信息。

基于表2，对于孤立的MAA分子，HOMO和LUMO能量分别计算为-7.769 eV和-1.537 eV，导致较大的HOMO–LUMO间隙为6.232 eV。这一较大的间隙反映了MAA的固有电子稳定性及其有限的自发电荷转移倾向，与其作为主要参与预聚物期间非共价相互作用的功能性单体的角色一致。

在FLX–6MAA复合物中，ESP分布在整个组装体上更加均匀。多个MAA分子的存在在FLX模板周围形成了一个集体的电静力环境，而不是单一的局部相互作用位点。这种非局域化的电静力场表明模板和单体集合体之间的有效电荷互补性，支持了稳定预聚物复合物的形成。因此，ESP图证实了结合能的结果，表明电静力相互作用在溶剂化条件下对稳定FLX–6MAA系统起着重要作用。这种有利的电静力互补性有助于在预聚物阶段形成稳定的模板-单体组装体，这对于在最终印迹聚合物中生成选择性结合腔体和提高传感器选择性至关重要。

前沿分子轨道（FMO）研究用于阐明甲基丙烯酸（MAA）、氟西汀（FLX）和FLX–6MAA预聚物复合物的电子特性和相互作用动态（图4a-c）。HOMO和LUMO能量是分子反应性和稳定性的关键描述符，而HOMO–LUMO能量差（ΔEgap）提供了关于电子柔软性和相互作用倾向的信息。

根据表2，对于孤立的MAA分子，HOMO和LUMO能量分别计算为-7.769 eV和-1.537 eV，导致较大的HOMO–LUMO间隙为6.232 eV。这一较大的间隙反映了MAA的固有电子稳定性及其有限的自发电荷转移倾向，与其作为主要参与预聚物期间非共价相互作用的功能性单体的角色一致。

在氟西汀的情况下，HOMO和LUMO能量分别计算为-6.297 eV和-0.880 eV，导致HOMO–LUMO间隙为5.417 eV。与MAA相比，FLX的较小能量间隙表明其具有更高的电子极化率和更大的化学反应性，这有助于其与周围单体分子的相互作用。前沿轨道的空间分布进一步证实了FLX的电子密度集中在能够参与分子间相互作用的功能基团上。在FLX–6MAA预聚物复合物形成过程中，前沿轨道能量发生了显著变化。该复合物的HOMO（最高未占分子轨道）和LUMO（最低未占分子轨道）能量分别为-6.314 eV和-1.516 eV，导致HOMO-LUMO能隙减小至4.798 eV。孤立部分之间较小的能量差异表明电子离域性得到了改善，并且由于复合物的形成而发生了稳定化。HOMO-LUMO能隙的缩小表明，多个MAA分子的集体存在改变了FLX的电子环境，促进了复合物内部有利的非共价相互作用。此外，FLX-6MAA复合物的HOMO和LUMO等值面显示出在模板单元和单体单元之间的电子离域，表明FLX和MAA分子之间存在电子耦合。这种离域的轨道分布支持形成了一个协同作用的网络，而不是局部的、孤立的结合位点。这种行为对于分子印迹非常有利，因为它有助于形成一种稳定而灵活的预组织结构，该结构在聚合后能够生成明确的识别腔。总体而言，HOMO-LUMO分析证实，与孤立分子相比，FLX-6MAA预聚合复合物具有更好的电子稳定性。能隙的减小和轨道的离域进一步证明了FLX与多个MAA单元之间的相互作用在电子上是有益的，这补充了结合能和静电势的分析，并支持FLX-6MAA系统适用于分子印迹应用。尽管HOMO-LUMO能隙的减小不是确定最佳化学计量的主要标准，但它提供了电子稳定性增强和FLX-6MAA复合物内分子间相互作用的额外证据。因此，FMO（最低未占分子轨道）分析被认为是对结合能结果的支持，而不是一个独立的选择参数。总的来说，DFT（密度泛函理论）结果为实验观察到的EMIP/ZrO2/CC传感器的优异性能提供了理论基础，表明优化的预聚合结构在调控系统的识别行为和电子转移特性方面起着关键作用。

3.3 电化学研究
3.3.1 裸电极和改性电极的电化学评估
表面改性剂的性质及其相应的改性策略在决定电极的有效表面积、电导率、电子转移动力学以及最终的电化学性能方面起着至关重要的作用。为了阐明分子印迹和ZrO2纳米粒子对表面改性的单独和综合效应，使用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）系统地研究了制备电极的电化学行为。这两种技术都允许清晰地评估分子印迹（MIP）和ZrO2对整体电化学性能的各自贡献。
图5a显示了在含有0.1 M KCl的1 mM铁氰化物溶液中制备电极的循环伏安图。如图所示，裸露的CC电极表现出最低的阳极和阴极峰电流，这与其固有的较差电导率一致。然而，值得注意的是，表面改性步骤，如ZrO2纳米粒子的整合和分子印迹，显著改善了电化学响应。虽然ZrO2提高了导电性并降低了电荷转移电阻（Rct），但分子印迹过程增加了电活性表面积，促进了更有效的吸附和电子交换。因此，观察到的峰电流的改善是由于这两种表面改性的共同作用，而不仅仅是简单的叠加效应。逐步的表面改性导致峰电流显著增加，同时峰对峰值分离（ΔEp）减小，表明[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原对与电极界面之间的电荷转移效率得到了提高。峰电流的增加主要是由于ZrO2改善的导电性和分子印迹提供的增强电活性表面积的结合。这种协同作用突显了每种改性的互补贡献。ZrO2改性电极相对于NIP和MIP样品的优越电化学响应可以归因于其增大的电活性表面积和ZrO2纳米粒子提供的改进导电路径。值得注意的是，从MIP基质中去除FLX后得到的EMIP样品，其阳极和阴极峰电流都有显著上升。这种电流的增加与EMIP表面上形成的更高密度的明确印迹腔有关，这促进了氧化还原探针与电极之间更有效的电子交换。在所有研究的系统中，EMIP/ZrO2/CC电极表现出最高的峰电流和最小的ΔEp。这种性能源于印迹聚合物网络和分散的ZrO2纳米粒子之间的协同作用。虽然HOMO-LUMO能隙的减小不是确定最佳化学计量的主要标准，但它提供了电子稳定性增强和FLX-6MAA复合物内分子间相互作用的额外证据。因此，FMO分析被认为是对结合能结果的支持，而不是一个独立的选择参数。总的来说，DFT结果为实验观察到的EMIP/ZrO2/CC传感器的优异性能提供了理论基础，证明了优化的预聚合结构在调控系统的识别行为和电子转移特性方面起着关键作用。

3.3.2 电化学评估
3.3.1 裸电极和改性电极的电化学评估
表面改性剂的性质及其相应的改性策略在决定电极的有效表面积、电导率、电子转移动力学以及最终的电化学性能方面起着至关重要的作用。为了阐明分子印迹和ZrO2纳米粒子对表面改性的单独和综合效应，使用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）系统地研究了制备电极的电化学行为。这两种技术都允许清晰地评估分子印迹（MIP）和ZrO2对整体电化学性能的各自贡献。
图5a展示了在含有0.1 M KCl的1 mM铁氰化物溶液中制备电极的循环伏安图。如图所示，裸露的CC电极表现出最低的阳极和阴极峰电流，这与其固有的较差电导率一致。然而，重要的是要注意，表面改性步骤，如ZrO2纳米粒子的整合和分子印迹，显著改善了电化学响应。虽然ZrO2提高了导电性并降低了电荷转移电阻（Rct），但分子印迹过程增加了电活性表面积，促进了更有效的吸附和电子交换。因此，观察到的峰电流的改善是由于这两种表面改性的共同作用，而不仅仅是简单的叠加效应。逐步的表面改性导致峰电流显著增加，同时峰对峰值分离（ΔEp）减小，表明[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原对与电极界面之间的电荷转移效率得到了提高。峰电流的增加主要是由于ZrO2改善的导电性和分子印迹提供的增强电活性表面积的结合。这种协同作用突显了每种改性的互补贡献。ZrO2改性电极相对于NIP和MIP样品的优越电化学响应可以归因于其增大的电活性表面积和ZrO2纳米粒子提供的改进导电路径。值得注意的是，从MIP基质中去除FLX后得到的EMIP样品，其阳极和阴极峰电流都有显著上升。这种电流的增加与EMIP表面上形成的更高密度的明确印迹腔有关，这促进了氧化还原探针与电极之间更有效的电子交换。在所有研究的系统中，EMIP/ZrO2/CC电极表现出最高的峰电流和最小的ΔEp。这种性能源于印迹聚合物网络和分散的ZrO2纳米粒子之间的协同作用。虽然ZrO2通过提高导电性和降低电荷转移电阻（Rct）来增强电子转移，但分子印迹聚合物增加了电活性表面积，并为FLX吸附提供了特定的腔，促进了更有效的电子转移。

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图5. (a) 在含有0.1 M KCl的1 mM [Fe(CN)6]3-/4-氧化还原对溶液中制备电极的CV；(b) 在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中1×10-4 M FLX的CV，扫描速率为50 mV/s；(c) 在含有0.1 M KCl的1 mM [Fe(CN)6]3-/4-溶液中获得的Nyquist图。
图5b展示了在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中制备电极表面记录的1×10-4 M FLX的循环伏安图。如图所示，裸露的CC电极或NIP/CC表面没有观察到明显的氧化还原峰，表明在未改性的配置中FLX没有显著的电化学活性。经过表面改性后，出现了一个明确的氧化峰，表明引入的改性剂具有促进FLX电氧化的催化能力。与未改性的电极相比，在EMIP/ZrO2/CC结构中整合了分子印迹聚合物后，改善最为显著。在这种配置中，与FLX相关的两个氧化峰都变得清晰可见，强调了印迹聚合物基质和金属氧化物纳米结构同时存在所带来的协同增强效果。ZrO2纳米粒子的加入以及分子印迹腔的增加提高了电极的导电性和电活性表面积，从而丰富了活性位点的密度并促进了更有效的FLX吸附和电子转移。因此，EMIP/ZrO2/CC电极被认为是电化学测定FLX的最有效平台，相对于单独改性或未改性的系统提供了更高的灵敏度和催化性能。
电化学阻抗谱（EIS）是通过将裸露和改性的电极浸入含有0.1 M KCl的1 mM铁氰化物氧化还原探针溶液中，在102至105 Hz的频率范围内进行的。相应的Nyquist图显示在图5c中，展示了每种电极配置的阻抗响应。从Nyquist图中提取了电荷转移电阻（Rct）、电解质电阻（Rs）和双层电容（Cdl）值，并对所有电极改性进行了分析（总结在表3中）[48]，[49]。结果表明，碳布电极上的每个表面改性步骤都导致Rct逐渐减小，表明电子转移更加容易。具体来说，EMIP/ZrO2/CC电极表现出最低的Rct值（4.22 Ω），这反映了ZrO2和分子印迹共同作用带来的电子转移效率的提高。Rct的减小以及CV中峰电流的改善证实了这种电极的电化学性能得到了增强。此外，阻抗数据的误差条也展示了这些发现的重要性。阻抗结果与CV结果非常吻合，共同证明了EMIP/ZrO2/CC配置的优越电化学性能。
表3. 三电极设置中EIS测试获得的参数
样品 Rs (Ω) Cdl (Ω) Rct (Ω) W (Ω/s1/2)
裸露的CC 27.3 10.1 39e-3 118 75 36.20
NIP/CC 63.0 10.2 0e-3 97 919.45
MIP/CC 69.8 70.1 82e-3 57 123.50
EMIP/CC 55.1 30.2 06e-3 42 131.41
ZrO2/CC 38.3 40.2 10e-3 236 41.21
EMIP/ZrO2/CC 59.0 10.0 58 4.22 39.60

3.3.2 工作电极的电活性表面积的测定
进行了计时电流测量，以确定与工作电极上药物电氧化相关的电活性表面积。不同电极的绝对电荷（Q）随时间（t）和t1/2的变化显示在图6a和6b中。电活性表面积是根据Anson方程（方程2）[50]使用Q-t1/2图的线性部分计算得出的。(2)
其中n表示电子数（n=1），F（96485 C/mol）代表法拉第常数，A（cm2）是电极面积，D代表介质的扩散系数（7.4×10-6 cm2/s），C0指的是1 mM ([Fe(CN)6]3-/4-)的浓度。
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图6. (a) 在含有0.1 M KCl的1 mM [Fe(CN)6]3-/4-氧化还原对溶液中裸露和改性工作电极的Q与t的关系图；(b) Q与t1/2的关系图。
CC、NIP/CC、MIP/CC、EMIP/CC、ZrO2/CC和EMIP/ZrO2/CC的估计电活性表面积分别为0.12、0.21、0.30、0.45、0.59和0.61 cm2。这些结果清楚地表明，与裸露的碳布相比，表面改性增强了所有制备电极的电活性表面积。其中，EMIP/ZrO2/CC电极表现出最大的电活性表面积，证实了其在促进电氧化过程中的优越能力。

3.3.3 电位扫描速率和电解质pH对FLX药物电化学响应的影响
发现FLX的氧化行为受到磷酸盐缓冲液pH值的强烈调节。为了探索这种依赖性，在pH 2–10的范围内，固定FLX浓度为1×10-4 M的情况下记录了循环伏安图（图7a-c）。如图7b所示，阳极峰电流从酸性条件开始稳步上升，直到pH 7，然后在更碱性的pH值下逐渐下降。这种模式可以通过考虑FLX药物胺基的质子化状态来解释：在中性pH附近，这些位点保持足够的质子化状态，可以与传感器表面的氧化官能团（包括羰基和羧基）进行强氢键相互作用。这种相互作用促进了FLX在电极上的更有效吸附，从而放大了其氧化信号。因此，选择pH 7作为后续分析测量的最适工作介质[51]。
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图7. (a) 在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液中，pH范围为2-10时，EMIP/ZrO2/CC电极上记录的FLX（1×10-4 M）的CV曲线；(b) Ip与pH的关系图；(c) Ep与pH的关系图；(d) 在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7）中，不同扫描速率（5-100 mV/s）下获得的FLX（1×10-4 M）的CV曲线，以及(e) Ip与ν的关系图和(f) Ep与ln ν的关系图。
如图7c所示，随着pH值的增加，阳极峰电位（Ep）逐渐向较低值移动，显示出Ep与pH之间的良好线性依赖性（Ep = -0.0216 pH + 1.435，R2 = 0.9866）。这种负相关关系归因于FLX上胺基的质子化状态，在较低pH下与电极表面的相互作用更强，增强了吸附和电化学响应。随着pH的增加，质子化减少，导致吸附减少和阳极峰电位的移动。为了更深入地了解FLX的电化学行为，并阐明其在电极表面的氧化还原过程的动力学和机制特征，在不同的电位扫描速率下进行了循环伏安测量。测量是在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7）中进行的1×10-4 M FLX溶液上进行的，扫描速率范围为10–100 mV/s（图7d）。获得的伏安图显示，扫描速率的增加导致阳极峰电流（Ipa）成比例增加，同时阳极峰电位（Epa）略有正向移动。这些观察结果证实了FLX在EMIP/ZrO2/CC电极表面的氧化是通过不可逆的电化学途径进行的。如图7e所示，阳极峰电流与扫描速率（ν）的定量依赖性遵循线性关系Ip1 = 0.024ν + 0.278（R2 = 0.987）和Ip2 = 0.005ν + 0.147（R2 = 0.830）。这种线性关系强烈表明氧化主要受电极-电解质界面上的吸附控制机制的支配。此外，图7f中显示的阳极峰电位与扫描速率的自然对数（ln ν）之间的相关性遵循线性模型Ep1 = 0.012 ln ν + 0.876（R2 = 0.9799）和Ep2 = 0.034 ln ν + 1.124（R2 = 0.9365）。这些关系进一步证实了氧化步骤的不可逆性，并为电子转移过程提供了额外的机制洞察。参与电化学过程的电子数量可以使用Laviron关系式（方程3）[52]来确定。(3)在该方程中，K° (1/s)表示电子转移反应的非均相速率常数，而α表示电子转移系数，对于不可逆系统，其值取为0.5。符号ν对应于电位扫描速率，R是通用气体常数（8.314 J/mol K）。此外，E°、F (C/mol)、n和T (K)分别表示形式上的氧化还原电位、法拉第常数、过程中转移的电子数和绝对温度。使用Laviron关系式估计氟西汀（FLX）的电化学氧化过程中涉及的电子数为1.51个。这个非整数值表明氧化过程可能不是纯粹的两电子途径；相反，它可能涉及部分电子转移步骤，这在不可逆的电化学反应中很常见。偏离理想整数的情况可以归因于反应的复杂性，包括耦合的电子和质子转移步骤。值得注意的是，对于此类系统，转移系数（α）小于1是预期的。假设胺氧化的典型α值约为0.75，计算出的αn为1.51，对应的n值约为2，从而支持了两电子转移机制。因此，提出了氟西汀的电氧化途径（图1）。与先前的报告一致，FLX在中性和碱性介质中发生不可逆氧化，通过两电子、两质子转移机制生成去甲氟西汀[3]，[54]。下载：下载高分辨率图像（128KB）下载：下载全尺寸图像图1. 氟西汀在EMIP/ZrO2/CC电极上的电氧化机制。3.3.4. 复合材料负载和纳米粒子比例的优化图8a和8b分别展示了改变EMIP/ZrO2负载和ZrO2纳米粒子含量如何影响在50 mV/s扫描速率下磷酸盐缓冲液中FLX的电化学氧化。沉积在碳布活性表面的EMIP/ZrO2量在0.0015-0.0076 mg/cm2范围内调整，对应的滴铸体积分别为5、10、15、20和25 μL。结果表明，随着EMIP/ZrO2沉积量的增加，阳极氧化峰电流也一致增加，直到25 μL（图8a）。这种增强归因于较厚的改性层带来的更大有效表面积和改善的导电性，这些共同促进了更快的电子转移。因此，选择25 μL的负载量作为改性CC电极的最佳量。通过循环伏安法进一步评估了复合基质中的最佳纳米粒子与聚合物比例，如图8b所示。在测试的配方中，含有100 mg纳米粒子的复合材料显示出最明显的阳极峰电流，约为1.1 V，表明其具有优异的催化和传感性能。因此，选择了含有100 mg纳米粒子的EMIP/ZrO2/CC电极进行后续与FLX相关的实验。下载：下载高分辨率图像（913KB）下载：下载全尺寸图像图8. (a) EMIP/ZrO2纳米复合材料负载对FLX电氧化的影响，以及(b) 不同ZrO2量对FLX（1×10-4 M）在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7）中氧化的影响，扫描速率为50 mV/s。(c) 在优化条件下的FLX DPV响应（电位窗口0.5-1.5 V；步长0.005 V；调制幅度0.025 V；调制时间0.05 s；间隔时间0.28 s），以及(d) 得到的校准曲线。(e) 重复性评估，(f) EMIP/ZrO2/CC传感器的重复性评估，以及(g) 基于FLX（1×10-4 M）在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7）中的氧化响应的干扰物种影响，通过DPV在50 mV/s扫描速率下记录。3.3.5. 氟西汀的定量分析及检测限的确定峰氧化-还原电流随分析物浓度的变化是定量确定和估计电活性物种检测限的常用方法。在优化条件下，使用差分脉冲伏安法（DPV）在一系列分析物浓度范围内评估了制备的复合电极对FLX的定量性能（图8c）。如图所示，在0.01-1 μM范围内，阳极峰电流（Ipa）与FLX浓度显示出满意的线性关系，得到两个线性校准段：Ipa1 = 0.3051C + 0.2734（R2 = 0.9548）和Ipa2 = 0.6046C + 0.3878（R2 = 0.9726），其中C表示药物浓度（μM）（图8d）。结果清楚地表明，药物浓度的增加导致阳极峰电流成比例增强。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别使用标准方程3s/m和10s/m计算得出（其中m是校准曲线的斜率，s是空白值的标准偏差）[22]。根据这些计算，LOD和LOQ分别为3.94 nM和11.90 nM。EMIP/ZrO2/CC传感器的灵敏度为991 μA/μMcm2。此外，将改进方法和扩展方法与文献中的报道进行了比较，见表4，可以推断出EMIP/ZrO2/CC电化学传感器在FLX检测方面的能力是令人满意的，并且与以往的研究相当。表4. EMIP/ZrO2/CC与其他用于FLX检测的电化学传感器的比较。传感器技术线性范围（μM）LOD（μM）电解质参考文献COFTpTt@c-MWCNTs/SPCEDPV0.0625–2.0（ng/mL范围）0.0243 μMPBS（pH 7.0）[41]Nb2CTx/NRGO/GCEDPV1–1000.34 μMPBS（pH 7.0）[3]MIP/GCEDPV4.99×10-7–5.6×10-5 M1.11 μMPBS（pH 10.3）[2]GC/RC–CuNPsDPV0.1-100.05 μMPBS（pH 7.0）[51]EMIP/ZrO2/CCDPV0.01-13.94 nMPBS（pH 7.0）本研究3.3.6. 传感器重复性、重复性及干扰物种的影响使用DPV分析研究了开发传感器的重复性、重复性以及潜在干扰物种对EMIP/ZrO2/CC电极性能的影响，如图8e和8g所示。为了评估重复性，四个独立制造的改性电极依次在含有0.1 M NaCl的磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7）中进行了测试，扫描速率为50 mV/s，FLX浓度为1×10-4 M（图8e）。记录的峰电流的相对标准偏差分别为RSDIp1 = 0.91%和RSDIp2 = 2.2%，显示出出色的制造一致性。EMIP/ZrO2/CC电极对FLX检测表现出稳定可靠的电化学响应。为了确保最佳分析性能，在测量过程中通过冲洗去除了吸附在电极表面的氧化物种，从而恢复了新的识别位点。此外，干燥电极并重新加载EMIP/ZrO2复合层允许用新的活性位点替换部分失活的位点。这种再生策略提高了传感器的可靠性和灵敏度。通过对10次连续测试进行DPV测量来评估制造传感器的重复性，并记录了在EMIP/ZrO2/CC表面甲磺丁脲氧化产生的电催化电流。如图8f所示，在这10次测量中，峰电流（Ip）没有显著变化，传感器保留了大约6.54%的初始响应。统计分析显示RSD为3.4%。这个低RSD值表明制造传感器的重复性非常好，证明了其在重复测量中的高可靠性。进一步研究了常见共存离子和小生物分子对FLX电化学识别的影响。选择钾（K+）、钠（Na+）、尿素、尿酸和葡萄糖作为代表性干扰物，并在干扰物与分析物的比例为100:1的情况下进行了测试。混合溶液在含有0.1 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7）中制备，并在50 mV/s的扫描速率下进行分析。相应的响应显示在图8g中。结果表明，没有一种测试物种导致FLX信号出现显著偏差，电流变化保持在10%以下。这种可忽略的波动表明改进的EMIP/ZrO2/CC传感器在测试条件下表现出出色的抗干扰能力和对FLX的可靠选择性[41]。3.3.7. 实际样品中氟西汀的定量通过标准添加方法严格评估了所提出的传感平台的实际样品分析适用性。在每个添加水平下，从差分脉冲伏安法获得的阳极峰电流被引入图8d中预先建立的校准模型中，从而能够准确确定EMIP/ZrO2/CC基质中的未知FLX浓度。为了验证测量的分析有效性，使用t检验和F检验对伏安氧化信号进行了统计评估，从而评估了EMIP/ZrO2/CC传感器响应与校准曲线的一致性。如表5所示，该方法提供了低相对标准偏差以及根据方程4 [52]，[55] 计算的97-113.45%的回收率。这些结果确认基质效应不会显著影响传感器的分析性能，并且FLX可以在95%的置信水平下无统计学显著偏差地定量。总体而言，这些发现表明，工程化的复合电极在用于实际样品测量时提供了可靠的准确性、精确性和稳健性。因此，EMIP/ZrO2/CC传感器可以被认为是用于人血浆和尿液中FLX检测的可靠分析工具。(4)表5. EMIP/ZrO2/CC在实际样品介质中的FLX检测结果。样品添加（μM）发现（μM）（平均值±标准差）t值F值RSD（%，n=3）回收率（%）血浆0.10.1015±0.03653.182.734.91101.520.50.4832±0.04463.9497.84尿液0.10.1134±0.02423.182.733.21113.450.50.4953±0.01611.4299.064. 结论在这项研究中，通过将电聚合分子印迹聚合物（EMIP）与ZrO2纳米粒子集成在碳布基底上，成功设计了一种新型且易于使用的电化学传感平台。EMIP和ZrO2的协同组合显著增强了了对氟西汀（FLX）氧化的电催化活性和选择性。EMIP/ZrO2/CC传感器表现出明确且敏感的响应，能够在宽线性范围（0.01-1 μM）内定量FLX，检测限为3.94 nM。此外，传感器还表现出优异的重复性、稳定性和抗干扰能力。其适用性通过成功检测实际样品中的FLX得到了进一步验证，实现了令人满意的回收率（97.84-113.45%），RSD值低于5%。这些发现突显了EMIP/ZrO2/CC平台作为环境和生物基质中FLX及其他潜在药物污染物痕量监测的强大且可靠的工具的潜力。CRediT作者贡献声明Mohsen Ghorbani：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。Leila Asadi：撰写——原始草稿、验证、资源管理、项目管理、形式分析、概念化。Mohammad Soleimani Lashkenari：撰写——审阅与编辑、验证、监督、概念化。利益冲突没有需要声明的数据可用性在本研究期间使用和/或分析的数据集可根据合理请求从相应作者处获得。