二次谐波生成成像技术揭示了大鼠急性神经拉伸损伤的损伤程度

《Journal of Surgical Research》：Second Harmonic Generation Imaging Reveals Extent of Damage in Acute Nerve Stretch Injuries in Rats

　　克里斯托夫·A·施罗恩 | 菲利普·纳赛尔 | 阿恩·H·博克尔 | 保罗·J·凯格尔 | 迈克尔·R·豪斯曼
海德堡大学医学院手外科、整形外科与重建外科系，路德维希港BG创伤中心，海德堡，德国

**摘要**
神经损伤常常导致长期预后不良，因为在急性期恢复情况难以预测。二次谐波生成（SHG）成像技术提供了一种无需标记的方法，可以在手术过程中可视化胶原纤维。我们研究了在鼠模型中，是否可以利用术中SHG成像来区分两种程度的急性拉伸损伤：外神经断裂（epineuroclasis）和内神经断裂（endoneuroclasis）。

**方法**
45只成年Sprague-Dawley大鼠被随机分为两组：外神经断裂组（n=22）和内神经断裂组（n=23）。左侧正中神经受到拉伸损伤，右侧神经作为假对照。在损伤前后，通过电刺激阈值评估神经功能。术中进行SHG成像以观察神经的胶原结构。

**结果**
SHG成像显示受损神经从近端到远端有三个不同的区域：一个暴露的内神经核心区域，一个显示外神经层破坏的过渡区域，以及一个尽管外神经层完整但胶原纤维紊乱、呈波浪状的区域。内神经断裂比外神经断裂表现出更严重的内神经损伤。外神经断裂后，刺激阈值从25纳库仑（nC）增加到100纳库仑（范围50-300 nC）；而内神经断裂后的刺激阈值从25 nC增加到300 nC（范围100-400 nC），表明导电性显著降低（差异200 nC，P<0.001）。

**结论**
术中SHG成像能够有效显示外神经层破裂和内神经胶原纤维的紊乱。它允许对结构损伤的程度进行视觉评估，从而判断损伤的严重性。这些发现突显了SHG成像作为术中诊断工具的潜力，有助于指导急性神经创伤的治疗决策。

**引言**
周围神经损伤（PNI）对外科医生及其患者来说是一个重大临床挑战，因为高比例的患者会出现长期残疾。大约5%的I级创伤中心收治的患者会发生PNI。及时评估神经损伤对于确保适当的治疗至关重要，因为手术干预在损伤后不久进行时效果最佳。然而，尽管进行了及时的显微神经修复，但很少能实现完全的功能恢复。需要一种可靠且精确的诊断工具来区分那些可能自然恢复的损伤和那些需要立即手术修复的损伤。

目前的诊断工具包括电生理方法（如肌电图和神经传导测试）、放射学评估（如磁共振成像（MRI）和超声检查，以及组织病理学评估（如神经活检）。然而，这些诊断方法存在显著局限性，无法在急性临床环境中预测自然恢复情况。传统的肌电图准确性中等且成本较高，限制了其在术中的应用。活检会损伤神经，而超声和MRI无法检测神经损伤的特定微观特征。

新型诊断工具的开发此前受到许多动物模型无法可靠且重复地诱导特定类型的结缔组织损伤的限制。最近对大鼠正中神经机械和结构损伤序列的研究揭示了从外向内的结缔组织损伤模式。具体来说，使用模拟前臂骨折的体内拉伸损伤模型，发现了两种程度的部分机械损伤：第一种损伤称为外神经断裂，其特征是外神经层（epineurium）的破坏，在后续研究中12周后表现出功能恢复；第二种损伤称为内神经断裂，与内神经管和神经内血管的严重紊乱相关，导致12周后无法恢复功能。该动物模型因此能够诱导两种特定类型的结缔组织损伤，这些损伤与拉伸损伤机制相关，并具有不同的预后和结果。这使研究人员能够研究新型诊断工具及其区分和诊断不同程度神经拉伸损伤的潜力。

**二次谐波生成（SHG）**
二次谐波生成（SHG）是一种二阶非线性光学现象，可以在不需要组织活检、组织处理或染色剂的情况下可视化许多生物组织。当两个能量相等的光子照射到非中心对称分子（如胶原）上时，会发射出一个频率加倍、波长减半的光子（可见光）。所有主要的周围神经解剖亚结构都含有大量胶原，使得SHG显微镜成为可视化神经胶原微结构的有希望的工具。先前的研究已经证明可以通过SHG显微镜观察大鼠的外神经胶原纤维。然而，没有体内研究探讨SHG成像评估外神经层以外损伤的能力，以及检测不同程度神经损伤及其引起的结构变化。以往的动物研究的局限性在于使用了任意选择的力或应变水平，这些水平仅导致外神经层损伤。由于不同样本在大小和强度上的自然差异，任意选择的力值可能会切断一根正中神经而几乎不损伤另一根神经，导致同一实验组内的结构损伤情况差异很大。相比之下，本研究中使用的模型基于大鼠正中神经的载荷-变形曲线上的两个特定点来诱导两种程度的神经拉伸损伤，从而在相同实验组的大鼠中更可控地诱导类似的损伤。因此，该动物模型有助于研究各种工具和技术的诊断和预后能力，包括最近使用该模型研究的手持式术中神经刺激器。

**材料与方法**
本研究采用了神经损伤动物模型的术语。经机构动物护理和使用委员会批准，共45只12个月大的雄性Sprague-Dawley大鼠被随机分为两组：外神经断裂组和内神经断裂组（n=22和n=23）。在神经被拉伸之前和之后，通过电刺激评估神经功能。左侧正中神经受到损伤，右侧神经作为假对照。神经损伤和功能测试后，使用SHG显微镜进行术中成像。

**研究目的**
本研究旨在展示SHG成像作为急性PNI新型评估方法的术中应用和解释。它是大型动物试验的一部分，该试验探讨了SHG成像在评估急性及慢性正中神经拉伸损伤方面的预后和诊断能力。研究结束后，大鼠被保留下来用于未来的研究。选择仅使用雄性大鼠是为了增大正中神经的尺寸，从而便于显微手术操作并降低手术过程中意外损伤的风险。虽然本研究未探讨性别对神经损伤成像的影响，但我们预计SHG神经成像的结果适用于两种性别。

**实验设计**
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。手术在经过伦理委员会批准的动物设施中进行。大鼠单独饲养在温度和光照可控的环境中，可自由获取食物和水。

**手术过程**
大鼠用2.0%异氟醚（Baxter Pharmaceutical Products，伊利诺伊州迪尔菲尔德）在1 L/min氧气条件下麻醉，并在无菌条件下准备手术。切开皮肤和皮下筋膜后，使用显微解剖工具分离指浅屈肌和桡侧腕屈肌。暴露两侧前肢的正中神经约2厘米的长度，并轻轻将其与周围组织分离。

**拉伸损伤程序**
本研究使用施罗恩等人开发的神经损伤动物模型来诱导两种机械和结构上不同的神经拉伸损伤程度。实验设置旨在将大鼠正中神经拉伸到不同的损伤程度，同时实时生成载荷-变形曲线。一个钝金属钩连接到负载传感器（Transducer Techniques，加利福尼亚州特梅库拉），该传感器固定在一个伺服液压材料测试系统（型号8872，Instron，马萨诸塞州诺伍德）上。负载传感器的数据传输到便携式负载传感器指示器，再进一步传输到数据记录软件，实时显示力值作为力-时间曲线。两个直径为1.6毫米的钝金属针固定在一个可手动移动的平台上，间距为8.4毫米。两个针位于大鼠前臂上方，向下压在正中神经上以暴露8.4毫米的神经长度，同时从近端和远端固定神经。钩子轻轻放置在暴露的神经下方，以每秒0.2毫米的速度提升，以拉伸神经并诱导两种不同的机械损伤程度。根据目标，当观察到外神经断裂或内神经断裂时立即停止拉伸。

**神经导电性评估**
在诱导拉伸损伤之前和之后，使用手持式电神经刺激器（Checkpoint Surgical，俄亥俄州独立市）评估神经功能，具体方法如Gluck等人所述。逐渐增加脉冲宽度，直到观察到大鼠手指的运动，该值被记录为手指运动所需的基线刺激。为了统一性，将刺激阈值从毫安和毫秒转换为纳库仑（nC）。使用Wilcoxon检验比较同一神经的损伤前后的刺激阈值，使用Mann-Whitney检验分析不同神经和组之间的显著差异。统计显著性水平设定为P<0.05。

**术中SHG成像**
神经损伤后，麻醉大鼠采取仰卧位，四肢伸展，进行两侧正中神经的术中SHG成像。放置一个薄玻璃盖片，露出约1.5厘米的皮下组织，并在其中加入去离子水以适应浸入式镜头。使用Olympus Fluoview (FV31S-SW)软件和Olympus FVMPE-RS多光子显微镜（Olympus，东京，日本）获取SHG图像。使用25x/1.05NA TruResolution XL Plan N物镜（XLPLN25XWMP2，Olympus，东京，日本）进行成像；帧大小设置为512×512像素（X/Y），横向像素大小为0.9040 μm。Insight X3 Dual线多光子激光的可调激光线设置为910 nm，以在410-460 nm带通滤光片中获得455 nm的SHG信号。Z堆栈（本文中称为SHG图像）的深度为57微米，z步长为3 μm/步，共19步。

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**图1.** 外神经断裂的特征是外神经层破坏和内神经纤维变直。内神经断裂导致内神经纤维变薄和紊乱，以及神经内血管和神经内出血。该图最初发表于Schroen CA, Duey AH, Nasser P, Laudier D, Cagle PJ, Hausman MR. What is the sequence of mechanical and structural failure during stretch injury in the rat median nerve? The neuroclasis classification. Clin Orthop Relat Res. 2025年在线发表。

**结论**
术中SHG成像能够有效显示外神经层破裂和内神经胶原纤维的紊乱，从而评估结构损伤的程度和损伤的严重性。这些发现突显了SHG成像作为术中诊断工具的潜力，有助于指导急性神经创伤的治疗决策。图像还评估了是否存在波浪状、卷曲的非线性内神经胶原纤维，这些纤维表明神经内结缔组织发生了塑性变形。19,34

结果

电神经刺激
未受伤的假对照组、预拉伸的神经外膜断裂（epineuroclasis）和预拉伸的内神经断裂（endoneuroclasis）在25纳库仑（nC）的中等刺激下都能引起手指运动（范围25-50 nC）。神经外膜断裂损伤后，需要100 nC（范围50-300 nC）的中等刺激才能引起手指运动，这表明与损伤前的电导率相比有显著下降（中位数差异75 nC，P<0.001）。内神经断裂后的中等刺激阈值为300 nC（范围100-400 nC），进一步表明内神经断裂神经的电导率比神经外膜断裂后的神经更低（差异200 nC，P<0.001）（图3）。二十三条内神经断裂神经中有五条在任何刺激阈值下都没有反应。

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图3. 数据以箱线图形式呈现，包含单个数据点。中心线表示中位数，箱子表示Q1-Q3范围，须状部分表示最小值和最大值。不同损伤程度下引起手指运动所需的刺激强度。神经外膜断裂和内神经断裂都严重损害了神经的电导率。内神经断裂神经需要显著更高的电刺激才能引起手指运动。

SHG成像
SHG显微镜可以实时生成正中神经的纵向切片图像，使外科医生能够在z方向上“滚动”观察神经。假对照组的SHG图像显示神经外膜完整，由有序的线性胶原纤维组成，几乎没有弯曲（图4A-C）。获得的z堆栈深度足以观察到的内神经管；然而，内神经胶原的信号比神经外膜胶原的信号弱得多，需要增加滤波电压才能有效显示。神经外膜断裂和内神经断裂都是神经外膜连续性中断的损伤，因此在术中SHG成像中从近端到远端都显示出三个不同的损伤区域（图5）：一个区域显示没有神经外膜包裹的暴露内神经（内神经区），一个区域显示神经外膜断裂的明显断裂边缘（过渡区），以及一个区域显示胶原纤维虽然无序但仍然连续（外神经区）（图4, 5）。每条受损神经的这三个区域都获得了SHG图像。

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图4. 刻度尺表示100 μm。图（A）、（B）和（C）显示神经外膜完整。图（D）和（G）显示内神经胶原纤维，（E）和（H）显示神经外膜的断裂边缘，（F）和（I）显示无序的内神经纤维。对照组、神经外膜断裂组和内神经断裂组的SHG成像显示从近端到远端有三个不同的损伤区域。未受伤的假对照组神经在整个成像范围内神经外膜完整（A, B, 和 C）。神经外膜断裂组和内神经断裂组的神经外膜都断裂（过渡区（E 和 F），暴露出有序的内神经（神经外膜断裂组）和无序的严重受损内神经纤维（内神经区（D 和 G）。在远端（外神经区（F 和 I）中，神经外膜保持连续，但胶原纤维严重无序。

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图5. 术中可视化（A）显示神经外膜断裂，而SHG成像（B）显示神经外膜断裂（过渡区）后的情况，暴露出近端的内神经纤维。堆叠的SHG图像提供了神经的俯视纵向视图。图5B的上半部分可以看到暴露的内神经，其信号强度低于神经外膜胶原，使内神经显得更暗。

神经外膜断裂组的神经在内神经区显示出暴露的内神经管，其中内神经胶原纤维排列有序，几乎没有内神经管中断。线性纤维排列表明由于生理轴突波动的丧失导致内神经发生了塑性变形。35,36 在每条神经外膜断裂神经中都观察到了神经外膜的中断。在过渡区，神经外膜的中断表现为神经外膜壳的明显断裂边缘，使该区域易于识别（图5）。神经外膜断裂附近的神经外膜胶原由短而严重无序的纤维片段组成，这些纤维片段与神经的纵向轴成斜角。在外神经区，内神经纤维在整个成像范围内的远端部分仍然呈波浪状且无序（图4F）。

内神经断裂组的内神经区较长，内神经胶原高度错位，显示出单个内神经管的中断，同时保持了神经的整体宏观连续性。与神经外膜断裂不同，内神经断裂组的内神经胶原纤维不是线性排列的，而是表现出纤维轨迹和方向的显著变化（图4G）。内神经断裂组的过渡区和外神经区显示出与神经外膜断裂组相似的发现，整个正中神经成像范围内的胶原纤维都呈波浪状且错位（图4H, I）。

讨论
连续性拉伸损伤是一种特别严重的神经损伤形式，因为在急性临床环境中很难评估损伤的程度。37 神经外膜断裂和内神经断裂这两种不同的拉伸损伤类型分别表现为神经外膜的机械失效和内神经管的无序。22,24,25 本研究旨在探讨这些损伤类型在术中SHG成像中的表现，特别是评估是否可以在术中观察到神经胶原框架的特征性结构损伤。使用活体SHG显微镜可以观察到神经外膜胶原纤维的弯曲和神经外膜的中断（图4E和H），以及内神经管的中断（图4G）。内神经断裂表现出更严重的内神经损伤，并且与神经外膜断裂相比功能损伤显著更大。内神经管为受损轴突的再生提供了框架，使用SHG成像可以可视化这种损伤，从而可能评估受损神经的再生潜力。最近使用相同动物模型的研究证实，神经外膜断裂损伤的大鼠在12周后可以完全恢复功能，而内神经断裂损伤则无法恢复。24,25 未来，SHG成像可以帮助外科医生区分那些可能自然恢复的神经损伤和需要立即手术干预的损伤，确保适当的治疗并提高完全恢复的机会。

本研究展示了SHG成像在急性PNI（周围神经损伤）术中评估中的应用和解释。它是大型动物试验的一部分，该试验正在研究术中SHG成像在评估急性及慢性正中神经拉伸损伤方面的预后和诊断能力。目前正在进行关于这两种损伤类型长期结果的研究。

关于SHG成像和神经损伤诊断的当前研究
活体SHG成像在许多医学领域具有巨大的诊断潜力。26,38,39 对活体人眼的SHG显微镜检查显示出区分健康组织和病理组织的方法。40 Sanchez等人开发了一种可穿戴的微型SHG显微镜，可以揭示活体单个运动单位的收缩动态，并成功检测到中风后痉挛患者的异常肌节动态。41 之前的研究表明，大鼠正中神经的应变增加与SHG成像中观察到的神经外膜胶原纤维弯曲之间存在相关性。19,21 然而，无论是SHG成像还是其他任何诊断工具，都尚未证明其对特定程度神经损伤的有效性，尽管它们可能有助于预测功能恢复与否。5,12,16,42,43 然而，由于缺乏有效的急性神经损伤诊断方法，加上活体SHG显微镜在早期临床中的积极结果，鼓励进一步研究其在周围神经创伤中的应用。

通过神经断裂动物模型，我们能够研究是否可以通过SHG成像在大鼠中识别特定程度的连续性拉伸损伤。未来的研究需要探讨这些特定的结缔组织损伤配置是否适用于人类周围神经。尽管如此，这项研究表明SHG成像可以在术中成功可视化特定的结构损伤配置，这可能有助于更明智地做出手术决策，以管理连续性神经损伤。

观察到的损伤及其相关功能损伤的影响
本研究证明，SHG显微镜能够以100%的准确率检测到神经外膜的断裂，这是神经拉伸过程中的一个关键事件，因为在每个样本中都观察到了这种情况。22 因此，神经外膜断裂后神经的电导率严重受损。SHG成像中神经外膜断裂的视觉检测表明神经电导率显著下降。此外，受损的神经外膜本质上经历了最大的胶原损伤，因此可能缺乏有效保护神经或再生的结构完整性，可能需要替代神经外膜修复手术的方法，如神经移植或神经转接。使用SHG显微镜可以评估神经外膜损伤的近端和远端范围，使外科医生能够在术中区分受损区域和健康组织。虽然神经外膜断裂与轴突和内神经管的塑性变形有关，但在显微镜下它们看起来是完整且线性排列的（图1, 5D）。22 相比之下，内神经断裂的特点是内神经严重无序和神经内血管的中断。这种内神经胶原的无序在SHG成像中可见（图4G），并且与神经外膜断裂后的神经电导率损伤更为严重。内神经胶原纤维为轴突再生提供了支架。无序的内神经管无法为再生的轴突提供指导，因此可能导致无法恢复和严重的长期功能障碍，正如最近使用该动物模型所证明的那样。24,25 特别是在神经外膜断裂和暴露的区域，SHG成像能够在术中可视化大鼠拉伸损伤后的内神经纤维排列和中断，有助于评估轴突再生的关键结构框架。因此，急性损伤的SHG图像中内神经无序的存在可能预示着神经瘤的形成和长期功能不佳，表明需要及时进行手术干预以改善患者预后。

术中SHG神经成像的潜在临床应用
虽然术中SHG成像的应用时间大约为每条神经10-15分钟，并在计算机屏幕上显示实时图像，但它提供了类似于计算机断层扫描或MRI的横截面视图和3D重建。SHG显微镜能够在微观尺度上可视化单个胶原纤维，提供类似于组织活检的细节。在低激光强度下进行SHG成像需要激光光直接接触神经以获得良好的组织可视化效果，因此这主要是一种术中使用的工具，而不是经皮应用。术中使用时，SHG成像可以帮助外科医生做出明智的治疗决策。然而，需要注意的是，这种工具尚未在临床实践中得到应用，其在无菌手术环境中的安全性和实用性尚未得到验证。

局限性
复杂的定量图像分析在技术上要求高、耗时且成本高昂，其结果对于外科医生来说不如直接观察急性神经损伤的结构损伤直观。因此，本研究旨在展示SHG成像作为神经损伤定性评估的实用性，允许外科医生在术中实时使用和解释它。定性评估足以识别神经外膜断裂，我们能够在每条神经的术中识别出特定的损伤区域。然而，尽管严重的神经外膜损伤可以清晰识别，但SHG图像上的神经外膜损伤程度并不总是能够明确诊断内神经断裂。只有对胶原纤维损伤进行定量分析才能确定内神经损伤的确切程度。尽管如此，本研究的目标是评估定性SHG成像的实用性和即时解释能力，类似于术中超声的应用，我们的结果表明定性评估可能有助于评估损伤的程度。未来的研究将探讨额外的定量图像分析的价值，以及第0天可检测到的结构损伤特征是否可以预测长期功能障碍（或再生）。

进行SHG成像的研究人员在本研究中没有采取盲法。SHG成像作为术中评估，每只大鼠的右臂作为假对照组。进行SHG成像可以明显区分哪些神经受损，哪些神经未受损，因此无法进行盲法操作。未来使用定量图像分析的研究可能会消除潜在的偏见，并可能需要确认本研究的结果，进一步识别组间更微妙的差异。本研究仅使用了雄性大鼠，以便于显微手术操作。虽然这种方法可能有助于避免手术过程中意外造成的神经损伤，但这一决定限制了我们的研究结果在两性中的适用性。雌性大鼠比雄性大鼠体型更小，因此在较低的力量或应变阈值下就可能出现外神经断裂（epineuroclasis）和内神经断裂（endoneuroclasis）损伤。此外，较小的正中神经在SHG成像中也可能显示得更小，这可能会影响外科医生对成像结果的解读能力。然而，我们认为雄性和雌性大鼠的整体解剖结构以及神经损伤在成像上的表现是相似的。尽管如此，对人类尸体的研究应包括并比较两性样本的SHG成像结果，以证明该方法对男性和女性的适用性。最重要的是，尽管啮齿动物模型与人类神经的相似性通常被认为是较高的，但神经断裂损伤模型在人类周围神经中的适用性尚未得到证实。同样，SHG成像在人类神经组织中的应用也尚未得到验证。因此，未来的尸体研究需要探讨SHG成像在诊断人类周围神经损伤方面的实用性。

结论：本研究利用术中SHG成像技术，展示了大鼠正中神经不同程度的结构损伤，从而对急性神经损伤进行了定性评估。SHG成像清晰地识别出了神经拉伸损伤的关键特征，如外神经鞘破裂和内神经鞘紊乱，这两种情况都伴随着神经传导功能的显著受损。内神经鞘为受损轴突的再生提供了支架，而SHG成像能够实时评估这一支架的结构完整性。本研究提供了有力证据，表明SHG成像对于评估急性神经损伤的程度和预后具有价值。未来的研究将重点验证这些发现是否适用于人类周围神经，并探索SHG成像在预测长期恢复情况（或无法恢复）方面的作用。