牛的输卵管和子宫细胞外囊泡能够促进封闭式单个胚胎培养中囊胚的发育

《Journal of Assisted Reproduction and Genetics》：Bovine oviductal and uterine extracellular vesicles enhance blastocyst development in confined individual embryo culture

摘要
目的：与体内产生的胚胎相比，体外培养的胚胎由于无法准确复制母体生殖道的复杂环境，其发育能力较低。在体内环境中，胚胎被限制在少量的输卵管液和子宫液中，母体细胞外囊泡（EVs）将它们的物质传递给发育中的胚胎，从而影响胚胎的发育能力。本研究的主要目的是探讨连续暴露于输卵管液和子宫液中的EVs对体外培养的牛胚胎在不同胚胎密度下的发育能力的影响，这些胚胎可以以群体或单独的形式进行培养。

方法：在培养的第1-4天，将假定的合子以每25个一组的形式培养在25微升的油滴中（胚胎密度：1/1微升），或者在微孔室中以每个约70纳升的体积单独培养（胚胎密度：14.28/1微升），培养基中单独使用或添加输卵管液中的EVs；然后在第5-8天添加子宫液中的EVs。

结果：连续暴露于EVs可以提高囊胚的形成率、平均细胞数量，并且仅在不同单独培养的胚胎中减少大型有害脂滴的积累。无论是单独培养还是群体培养的胚胎，连续暴露于EVs都能减少囊胚中的凋亡细胞和脂质面积。

结论：我们认为，受限的条件可能增强胚胎产生的自分泌/旁分泌因子的积累，这些因子与母体EVs协同作用，或者只有在单独培养的情况下，这些由EVs诱导的胚胎分泌物才能达到生物学上的有效水平。高密度的胚胎可能在未来的培养策略中发挥关键作用，通过补充生物活性母体因子来改善胚胎的发育和能力。

引言：尽管辅助生殖技术（ART）取得了进展，但体外胚胎发育（IVD）与体内条件相比仍然不理想，导致囊胚质量降低和妊娠率下降[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。在体内，胚胎在少量的输卵管液（OF）和随后的子宫液（UF）中发育[10]。这些受限的微环境支持强烈的自分泌/旁分泌信号传导以及胚胎与母体之间的双向交流，这些交流通过含有蛋白质和生物活性分子的可溶性因子和细胞外囊泡（EVs）来实现[11,12,13,14]。EVs越来越被认为是早期生殖和妊娠期间细胞间交流的关键介质[15,16,17]；这些膜结合颗粒（40–1000纳米）通过携带蛋白质、DNA、mRNA、lncRNA和脂质来介导细胞间交流[18,19,20,21]，并且可以穿过透明带被胚胎内化[22,23]。越来越多的证据表明，EVs参与胚胎的自分泌信号传导和胚胎与母体之间的对话，支持着着床前的发育和发育能力[15,24]。相反，IVD过程中缺乏母体来源的信号被认为是导致胚胎质量下降的主要因素[15]。与此观点一致，最近的研究表明，来自输卵管和子宫道的EVs含有不同的miRNA载荷，而在群体培养牛胚胎的过程中，连续添加输卵管液和子宫液中的EVs可以提高囊胚的发育能力[22,25]。

在体外培养过程中，胚胎的受限条件和密度也是决定发育成功的关键因素。当多个胚胎一起培养时，IVD的效果会得到一致性的改善，这种现象被称为“群体效应”，在多排卵和单排卵物种中都有观察到（小鼠[24,26]；牛[27,28]；猪[29]；猫[30]；人类[31,32,33]），这可能是由于自分泌/旁分泌的胚胎趋化因子增强了胚胎的存活和生长[34,35,36]。最近的证据表明，通过在受限微环境中单独培养牛合子来达到高密度胚胎，可以提高囊胚的产量和能力[37]。在这项研究中，我们证明了母体EVs的生物活性受到胚胎密度的影响。具体来说，牛合子在连续暴露于输卵管液和子宫液中的EVs的情况下被培养到囊胚阶段。通过直接比较在极小体积（每个胚胎70纳升；每微升14.28个胚胎）中单独培养的胚胎与在较大体积（每个胚胎1微升）中群体培养的胚胎的囊胚产量、发育进展、DNA片段化、线粒体活性和脂质分布，我们发现微环境限制增强了胚胎对连续添加母体EVs的反应，从而提高了囊胚的形成和发育能力。

材料与方法：
EVs的分离和表征：EVs的分离和表征按照先前的描述进行[38]。简要来说，根据黄体形态选择五个输卵管和子宫，并在冰上运输到实验室。切除输卵管（黄体阶段1：发情周期的第1-4天）和子宫角（黄体阶段2：发情周期的第5-10天）周围的组织，用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS?）清洗，并分别用1毫升和2.2毫升的冷PBS?冲洗。在300克下离心7分钟后，再在4摄氏度下以10000克离心30分钟，通过0.22微米过滤器过滤，并在4摄氏度下储存。使用尺寸排阻色谱法（SEC）（Pure EVs?，HBM-PEV；Hansa-BioMed Life Sciences，塔林，爱沙尼亚）进行EVs的分离，然后进行超速离心。简要来说，SEC柱用30毫升PBS清洗，加载每个OF（约1毫升）或UF（约2毫升），加入11毫升PBS后，丢弃前3.0毫升的洗脱液，收集接下来的2.5毫升富含EV的洗脱液。将2.5毫升的洗脱液在4摄氏度下以100,000克离心1小时（Optima L-90 K超速离心机，带有摆动桶转子SW 41 Ti，Beckman Coulter，Fullerton，CA，美国）。沉淀物重新悬浮在100微升的冷PBS中，合并（最终体积500微升）并储存在-80摄氏度下。

纳米粒子追踪分析（NTA）：使用配备CCD摄像机和NTA 3.1 Build 3.145软件（NanoSight Ltd.，Minton Park，英国）的NanoSight LM-10系统分析EVs的浓度和大小。将5微升的EVs溶液稀释在95微升的过滤PBS?中。NTA测量条件为检测阈值2–3，相机级别13，22摄氏度，60秒。每个样本进行三次记录。确定每个样本的EVs浓度后，将储存的合并样本稀释到3×10^5个粒子/毫升的工作浓度，并用于胚胎培养实验。

透射电子显微镜（TEM）：将每个EVs悬浮液（5微升）稀释在45微升中，将两个25微升的EVs制备液滴吸附在涂有Formvar/碳的200目铜网格上（Agar Scientific，Essex，英国）1分钟，在室温下。网格用蒸馏水清洗两次，用50微升2%的醋酸铀染色20秒，然后吸干并风干。

流式细胞术：根据MISEV2018和MIFlowCyt-EV [20]指南，对每个OF-EVs和UF-EVs重复样本中的十微升进行基于流式细胞术的免疫检测，以检测EV表面标记物（CD9、CD63和CD81）。这种先前应用的方法[39]补充了结构和定量的TEM和NTA表征，确保分离出的颗粒在大小、形态和表面蛋白表达方面符合预期的EV特征，而不试图区分EV亚型。使用CytoFLEX S流式细胞仪（Beckman Coulter，Brea，CA，美国）进行检测，该仪器配备了紫色（405纳米）、蓝色（488纳米）、黄色（561纳米）和红色（638纳米）激光器。细胞仪以低流量模式运行（10微升/分钟），每个样本至少采集10,000个事件。为了最小化背景，培养基通过0.1微米过滤器过滤。为了保持最佳性能，按照Barranco等人的建议[40]，每2-3个EVs样本用0.1微米过滤的蒸馏水清洗流体系统。光学配置优化为检测来自紫色激光的侧散射（SSC），并将FSC和v-SSC设置为对数刻度。荧光通道也使用对数增益进行操作。在vSSC/FSC图中建立EV检测区域，使用表达重组绿色荧光蛋白（GFP）的外泌体（1×10^6 EVs/毫升；SAE0193，Merck，MA，美国）。GFP荧光用于定义检测阈值，并调整vSSC/FSC区域以包括超过90%的GFP阳性EV事件。这个门限始终应用于所有EV样本，不论荧光染色如何，确保只分析在EV大小范围内的颗粒。CFSE染色（0.1微米过滤器，CellTrace，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）用于验证门控准确性并评估样本完整性。EV样本在0.1微米过滤的PBS中稀释到最终浓度1–2×10^6 EVs/毫升，并在37摄氏度下与CFSE和四跨膜蛋白抗体（1:50）孵育30分钟：anti-CD63-FITC（130–118-076）、anti-CD81-PEVio770（130–107–922）和anti-CD9-PEVio615（130–118–811）（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）。

工作溶液：CFSE和抗体的工作溶液离心三次（17,000克，10分钟）以消除潜在的聚集体。染色后，加入200微升0.1微米过滤的PBS以停止反应。荧光检测配置如下：CD63-FITC在488纳米激发并在B1通道检测；CD9-PEVio615在561纳米激发并在R2通道检测（615/20纳米）；CD81-PEVio770在405纳米激发并在B3通道检测（450/50纳米）。仅缓冲液对照（0.1微米过滤的PBS）、仅二次抗体对照和未染色的EV样本对照用于验证染色的特异性并排除假阳性信号。所有对照在相同的条件下处理，并使用相同的CytoFLEX设置进行分析，确认了CFSE和四跨膜蛋白抗体的特异性，并允许准确区分真正的EV事件、背景噪声和潜在的碎片。对于每个标记物，我们报告了被分类为阳性的EV百分比，这些事件位于EV检测门限（vSSC/FSC）内，其荧光强度高于未染色和仅缓冲液对照所建立的阈值，并报告了该阳性群体内的相应平均荧光强度（MFI）。这种方法允许识别特异性表达目标标记物的EV，并提供了这些EV中相对标记物丰度的定量测量。阳性事件的百分比指的是位于EV检测门限（vSSC/FSC）内、荧光强度高于未染色和仅缓冲液对照所建立的阈值的颗粒比例。这允许识别特定表达目标标记物的EV，并提供了这些EV中相对标记物丰度的定量估计。MFI提供了每个阳性EV亚群体中相对标记物丰度的定量估计，较高的MFI值表示更高的表位密度或更强的抗体结合。最后，使用针对BSA和calnexin的抗体通过流式细胞术在样本渗透后评估残留的细胞污染情况，详细信息见补充方法（部分：流式细胞术评估污染物）。

卵母细胞收集、体外受精和胚胎培养：培养基从Stroebech media（哥本哈根，丹麦）购买。从当地屠宰场（San Marcellino-CE，CEE认证编号1403/M）来源的成熟母牛卵巢中提取的直径2-8毫米的卵泡-卵母细胞复合体（COCs），在Nunc孔（Nunc，Roskilde，丹麦）中的500微升IVM培养基中以45-50个一组培养24小时，温度38.5摄氏度，二氧化碳浓度6%，湿度95%。

来自Chiacchierini（佩鲁贾，意大利）的三头公牛的冷冻精液（每根吸管0.5毫升；每毫升20×10^6个精子；解冻后活力>70%）用于受精。吸管在37摄氏度的水浴中解冻1分钟，然后用10毫升Semen Wash培养基离心10分钟。沉淀物重新悬浮在500微升的IVF培养基中，并使用Bürker chamber测定精子浓度。通过Sperm Class Analyzer（SCA，Microptic S.L.，巴塞罗那，西班牙）在38°C的温度下，在配备有Basler A312 FC相机的Nikon TE 2000倒置显微镜（Nikon，东京，日本）和×10负相位对比物镜的Makler腔室中评估精子活力。精子浓度调整至1×10^6个活动精子/毫升。将卵母细胞（COCs）和精子以每组50个的密度共同培养在500微升的IVF培养基中，条件为38.5°C、6%二氧化碳和95%湿度，时间为19-22小时。在授精后18-22小时（p.i.），通过涡旋处理将假定的合子分离出来，并按照以下方法分别以组（GC）或单独（IC）的形式进行培养。在授精后第3天和第8天分别测定胚胎裂变率和囊胚率。第8天的囊胚被分为早期/扩展型和孵化/已孵化型，并按照以下方法进行进一步分析。

培养设备、假定合子的加载以及胚胎密度：
假定的合子要么单独培养在大约70纳升的培养基中（IC；胚胎密度为14.28个/微升），使用GERI?培养室（GENEA BIOMEDX，悉尼，澳大利亚），要么以每组25个的密度培养在含有矿物油的培养皿中（Heavy Oil，Stroebech培养基，哥本哈根，丹麦）。GERI?培养室包含四个孔，其中一个孔中有16个连续的微孔，可以空间限制单个胚胎。每个微孔呈倒置截锥形，底径为430微米，上径为500微米，高度为400微米（微孔体积=68纳升）。将16个假定的合子加载到60微升的培养基中，然后覆盖3毫升的矿物油。通过两次重复的60微升吸液操作将60微升的培养基移除，吸液器尖端垂直位于微孔阵列的中心，确保每个合子都在每个约70纳升的微孔中单独培养，这一点之前通过染料加载实验已经得到验证[37]。

在单独培养（IC）条件下，含有囊胚的孔的有效密度为14.28个囊胚/微升（每个70纳升中有1个囊胚）。在群体培养（GC）条件下，囊胚密度可以根据囊胚率来估算。例如，如果囊胚率为30%（25个合子中有7.5个囊胚），则相应的密度为每25微升中有7.5个囊胚，即0.3个囊胚/微升。因此，在群体培养条件下，囊胚密度（囊胚/微升）可以通过将观察到的囊胚率除以100来计算。

实验设计：
在授精后第1天（p.i.），有946个假定的合子（n=5个重复实验），在以下4种条件下在IVC培养基中培养至授精后第8天（图1）：(i) GC：25个胚胎/25微升；(ii) IC：1个胚胎/68纳升；(iii) GC-EVs：25个胚胎/25微升，同时添加3×10^5个外泌体（EVs）/毫升来自卵泡液（OF，第1-4天）和3×10^5个EVs/毫升来自尿囊液（UF，第5-8天）；(iv) IC-EVs：1个胚胎/68纳升，同时添加3×10^5个EVs/毫升来自OF（第1-4天）和3×10^5个EVs/毫升来自UF（第5-8天）。在第5天，胚胎在IVC培养基中清洗后，转移到新的培养滴中（GC）或微孔室中（IC），培养基中可以单独使用新鲜的IVC培养基或添加3×10^5个EVs/毫升来自UF。在第8天，使用立体显微镜评估囊胚的率和发育阶段，并按照以下方法处理囊胚。

图1：
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图形实验设计显示了胚胎培养条件以及单独培养和群体培养的胚胎依次暴露于输卵管和子宫EVs的时间安排。

囊胚发育能力的评估：
通过评估平均细胞数（MCN）、TUNEL阳性细胞、脂质含量和线粒体活性来确定发育能力。样品在FV3000 OLYMPUS激光扫描共聚焦显微镜（Olympus Italia，塞格拉特，意大利）下成像，囊胚的Z-stack使用×30硅浸没物镜和×2放大倍率获取。

囊胚MCN和TUNEL阳性细胞：
囊胚（GC：34个；GC-EVs：36个；IC：31个；IC-EVs：44个）在4%的甲醛（PFA，Sigma Aldrich，米兰，意大利）中固定过夜，温度为4°C，然后在含有0.1%聚乙烯吡咯烷酮（PBS-PVP）的磷酸盐缓冲盐水中清洗3×5分钟，在室温下用0.1%的皂苷在PBS-PVP中渗透30分钟，最后在37°C的黑暗环境中孵育1小时，使用TUNEL反应混合物（In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red，Merck，米兰，意大利）进行检测。在PBS-PVP中清洗3×5分钟后，用10微克/毫升的Hoechst 33,342（Sigma Aldrich，米兰，意大利）在PBS-PVP中染色10分钟，再次清洗后，固定在10微升的PBS-PVP中。为了保持囊胚的三维结构，在胚胎两侧各放置一个0.17毫米厚的盖玻片作为间隔物。TUNEL阳性细胞在561纳米（λem 570–590纳米）下观察，Hoechst染色的细胞核在405纳米（λem 420–480纳米）下观察。通过‘total cell counter’工具（ImageJ 1.54f软件，NIH，美国）在囊胚Z-stack的最大投影上确定TUNEL阳性细胞和MCN。

囊胚线粒体活性：
活囊胚（GC：15个；GC-EVs：15个；IC：17个；IC-EVs：22个）在IVC培养基中清洗两次，在38.5°C下用400纳摩尔的MitoTracker DeepRed（Molecular Probes，尤金，OR，美国）孵育30分钟，然后在PBS-PVP中清洗3×5分钟，最后在4%的PFA中固定30分钟。在PBS-PVP中清洗3×5分钟后，用10微克/毫升的Hoechst 33,342在PBS-PVP中染色10分钟，按照上述方法固定在显微镜载玻片上。MitoTracker DeepRed在640纳米（λem 650–750纳米）下观察，Hoechst染色的细胞核在405纳米（λem 420–480纳米）下观察。线粒体活性通过收集的Z-stack的最大投影的总荧光强度来量化，间隔为3微米。通过ImageJ软件确定囊胚面积和荧光积分密度（IntDen）。简要来说，减去囊胚外的背景荧光后，荧光强度按以下公式计算：相对荧光 = IntDen ? （选定囊胚的面积 × 平均背景荧光）。荧光强度以任意单位（a.u.）表示[41]。

囊胚脂质含量：
囊胚（GC：16个；GC-EVs：19个；IC：19个；IC-EVs：22个）按照上述方法固定、清洗和渗透后，在室温下用20微克/毫升的Bodipy（493/503，ThermoFisher Scientific，帕尔马，意大利）在PBS-PVP中染色1小时，然后用Hoechst 33,342复染，按照上述方法固定和安装。Bodipy染色的脂质滴（LDs）在488纳米（λem 500–540纳米）下观察，Hoechst染色的细胞核在405纳米（λem 420–480纳米）下观察。在三个1024×1024像素的图像上确定总脂质面积，其中一个图像是囊胚的赤道截面，另外两个图像是囊胚两半的中间部分。通过‘nucleus counter’工具（ImageJ 1.54f软件，NIH，美国）分析图像以量化脂质滴的面积，并将脂质滴的面积表示为囊胚总面积（μm^2）的百分比。通过面积校正脂质量，以考虑囊胚大小的不同[41]。对于每个囊胚，在验证三个截面的脂质量之间存在显著相关性（r^2 > 0.8且p < 0.0001，通过皮尔逊相关检验）后，选择每个胚胎中面积最大的截面进行分析。在囊胚Z-stack的最大投影上评估LDs的数量、直径和大小频率，间隔为3微米。使用Image J 1.54f软件（NIH，美国）测量LDs参数，具体步骤如下：背景减除（滚动球半径=10），阈值调整（55–255），二值图像转换，分水岭变换（去除潜在的LDs簇），以及‘analyzing particles’工具（排除平均面积< 0.07微米的颗粒以避免计数背景噪声）。此外，创建了一个Excel文件将LDs大小频率分为五个类别：0.07–0.3、0.3–5、5–15、15–30和>30微米^2。

统计分析：
每个实验至少包含五个独立的生物学重复实验。囊胚率、发育阶段、TUNEL阳性细胞和脂质滴（LDs）的大小频率以累积百分比报告，并使用Fisher精确检验进行成对比较，随后使用Bonferroni校正进行多重检验。平均细胞数（MCN）、线粒体活性、LDs的平均直径、总数和面积作为连续变量使用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，然后进行Tukey的事后分析，并以平均值±标准差（SD）报告。p值< 0.05被认为具有统计学意义。统计分析使用GraphPad Prism软件（版本8.02，适用于Windows，GraphPad Software，波士顿，MA，美国）进行。

EVs的特性分析：
通过纳米粒子跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和流式细胞术分析了从OF和UF中分离出的五个样本的EVs的性质、大小和浓度。

纳米粒子跟踪分析：
OF中含有3.32×10^10个粒子/毫升（平均大小237.8纳米；众数大小174.8纳米），UF中含有1.71×10^11个粒子/毫升（平均大小297.8纳米；众数大小202.2纳米）。

透射电子显微镜（TEM）（图2）确认了OF和UF中的EVs具有典型的杯状形态。

图2：
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代表性的TEM显微照片和流式细胞术图表显示了输卵管（A）和子宫（B）液体中的母体细胞外囊泡（EVs）的典型杯状形态。流式细胞术确认了EVs对CD63、CD9和CD81的免疫阳性反应，在输卵管（C–E）和子宫（F–H）样本中均如此。使用FITC、ECD和PC7通道分别显示了相同标记物的荧光强度的代表性直方图（I CD63；J CD9；K CD81）。荧光信号与相应的无EVs的阴性对照（Ctr–，黑色）、仅PBS（PBS，红色）和无抗体的EVs（EVs，绿色）进行了比较。条形图=200纳米。

流式细胞术分析：
确认了OF和UF中存在功能性和完整的膜EVs。具体来说，OF中的EVs中有71.23%和UF中的EVs中有74.90%为CFSE阳性。在OF-EVs中检测到了tetraspanins CD81、CD9和CD63，其EV群体百分比为CD63（34.00±3.0%）、CD9（19.39±1.3%）和CD81（31.30±2.3%），相应的信号强度（任意单位，AU）分别为CD63（2977.2±53.6）、CD9（1239.9±101.7）和CD81（1897.8±22.3）。UF-EVs对CD63（24.70±3.7%）、CD9（13.40±1.7%）和CD81（26.91±3.0%）显示出阳性免疫反应，相应的信号强度（AU）分别为CD63（2753.9±92.4）、CD9（1129.3±30.6）和CD81（1777.7±52.7）。这些发现验证了从两个来源成功分离和保持了EVs的完整性。图2C–H显示了来自输卵管和子宫制备的EVs的代表性流式细胞术谱型，I-K面板显示了相应的MFI值。使用针对BSA和calnexin的抗体通过流式细胞术确认了EV富集部分中不存在细胞污染物（见补充方法和结果的图1和2），这证实了我们之前的观察[22]。

胚胎发育和质量：
在授精后第3天的裂变率范围为80.4%至84.5%，各实验之间没有显著差异。在授精后第8天（图3A），IC-EVs的囊胚率（35.1%）显著高于IC（22.5%）、GC（18.9%）和GC-EVs（23.5%）（p < 0.001），表明连续EVs共培养对单独培养的胚胎的囊胚形成有积极影响。尽管EVs也提高了群体培养下的囊胚率（囊胚率：GC-EVs为23.5%，GC为18.9%），但差异不显著。连续EVs共培养显著增加了单独培养的囊胚的MCN（IC vs IC-EVs：111±31.7 vs 137.7±46；p < 0.01），而在群体培养条件下则没有这种效果（GC：144.3±42；GC-EVs：139.2±38.7）（图3B）。在我们的实验条件下，单独培养的囊胚的MCN显著低于群体培养的囊胚。

图3：
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在群体（GC）或单独（IC）培养后第8天的囊胚率（A）、MCN（B）和发育阶段（C），无论是在单独的培养基中（GC，IC）还是与母体EVs（GC-EVs，IC-EVs）一起培养。D–G显示了早期（D）、扩展型（E）、孵化（F）和已孵化囊胚（G）的代表性显微照片。不同的上标字母表示显著差异：A p < 0.05。B GC vs IC，p < 0.01；IC vs GC-EVs，IC-EVs，p < 0.05。C，无显著性。条形图=250毫米。

囊胚阶段的评估（图3C）是通过区分早期/扩展型（图3D和E）和孵化/已孵化囊胚（图3F和G）来进行的。尽管连续EVs暴露增加了孵化/已孵化囊胚的百分比，但差异不显著（图3C）。

TUNEL阳性细胞、脂质含量和线粒体活性作为囊胚发育能力的标志物进行评估。在IC-EVs（6.8%）和GC-EVs（5.8%）中培养的囊胚中的TUNEL阳性细胞显著低于IC（8.7%；p < 0.05）和GC（7.9%；p < 0.05），表明在单独和群体培养后产生的囊胚质量更高。尽管差异不显著，但GC-EVs中的凋亡细胞百分比低于IC-EVs（图4A）。在单独或在单独培养基中培养的囊胚中的TUNEL阳性细胞没有显著差异。图4B显示了在不同条件下培养的囊胚中TUNEL阳性细胞（红色）和总细胞（蓝色）的代表性图像。

图4：
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A 囊胚中的TUNEL阳性细胞。B 从左到右的每一列显示了在GC、IC、GC-EVs和IC-EVs中产生的囊胚的代表性图像。不同的上标字母表示显著差异：GC与GC-EVs，p < 0.05；IC与IC-EVs，p < 0.05；GC-EVs与IC-EVs，无显著差异。条形图宽度为50微米。在不同培养条件下，未检测到囊胚线粒体活性的显著差异（图5）。图5的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。线粒体活性以任意单位（a.u.）表示；数据以平均值±标准差（A）呈现，并展示了用MitoTracker染色的囊胚的代表性图像（B-E），分别是在单独培养（B, C）或与母体EVs共同培养（D, E）后的结果。无显著差异。条形图宽度为50微米。大小频率的评估（图6A）显示，在所有培养条件下，0.07–0.3和0.3–5μm2的LDs数量较多。与IC、GC和GC-EVs相比，单独用EVs培养的囊胚（IC-EVs）中5至>30μm2的LDs数量较少，这表明其发育能力较低[7]。与先前的研究结果一致（37），IC中的LDs数量显著低于GC囊胚。EVs暴露对LD的平均直径没有影响（图6B）。然而，单独培养的囊胚的LD平均直径显著低于群体培养的囊胚（IC，1.57±0.5；GC，2±0.3；p < 0.01）。每个囊胚中的LD总数（图6C）未受到培养条件的显著影响。相反，EVs暴露显著减少了囊胚中LDs所占的面积（图6），无论是在单独培养还是群体培养中。图6的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。脂质含量（A–D）以及在不同培养条件下产生的囊胚的代表性共聚焦图像（E–H）。A. LDs的大小频率，单位为μm2。B. LDs的平均直径（平均值±标准差）。C. 囊胚中LDs的总数（平均值±标准差）。D. 囊胚中LDs的面积（平均值±标准差）。E–H. 用BODIPY标记的囊胚，在单独培养（E, G）或与EVs共同培养（G, H）后的LDs可视化。不同的上标字母表示显著差异：A和B，p < 0.01。C，无显著差异。D，p < 0.05。条形图宽度为50微米。囊胚的发育率和发育能力总结在表1中。表1 囊胚的发育率和发育能力。全尺寸表格。在同一列中，具有不同上标字母的值具有显著差异（p < 0.01），除了囊胚率、IC和IC-EVs之间的MCN比较、TUNEL阳性细胞以及LDs面积（p < 0.05）。

讨论
在本研究中，我们探讨了连续补充EVs对囊胚产量和发育能力的影响。我们的主要发现是，EVs暴露仅在高密度下单独培养的胚胎中显著增加了囊胚率，有效地挽救了那些否则无法达到囊胚阶段的受精卵。这一观察引发了一个重要问题：为什么EVs仅在单独培养条件下发挥其有益作用，尽管在所有培养系统中EV的来源、剂量和暴露时间表都是相同的？区分单独培养和群体培养的主要因素是：（1）胚胎密度约为14倍高，囊胚密度约为62倍高（GC-EVs的囊胚密度为0.23/mL），这是由于单个胚胎被限制在约70纳升的培养基中；（2）没有延迟或停滞的伴生胚胎。有两种非互斥的假设可以解释在单独培养条件下观察到的囊胚挽救现象。首先，在受限的单独培养条件下，高浓度的胚胎来源的自分泌/旁分泌因子可能与母体EVs共同产生协同的胚胎营养效应，从而支持发育进程。已知胚胎通过分泌某些因子积极塑造其微环境，这些因子根据其内在质量可能有益或有害。例如，牛的囊胚会释放富含特定miRNAs的EVs，而补充选定的miRNA模拟物已被证明可以改善胚胎质量、孵化以及与发育和着床相关的基因表达[42, 43]。相反，来自延迟或停滞胚胎的miRNA模拟物会损害发育[44, 45]。因此，在群体培养条件下，来自受损胚胎的信号可能会稀释或抵消EVs介导的有益效应，阻止它们达到挽救低能力胚胎所需的生物学阈值。其次，母体EVs可能刺激胚胎来源的自分泌因子的重新分泌；在单独培养条件下，这些由EVs诱导的信号积累可能达到生物学上的有效浓度，从而挽救那些在群体培养中会表现出发育延迟或停滞的胚胎。目前，关于母体EVs对胚胎分泌组或EVs生物发生影响的直接证据尚缺乏，尽管越来越清楚母体EVs如何影响胚胎发育、母体生殖道功能和着床[14, 19, 46]。与Leal等人（2022年）的研究一致，母体EVs在群体培养中仅产生了轻微且不显著的囊胚产量增加。这一趋势可能与相同的机制一致，但显著较低的囊胚密度可能限制了胚胎来源的自分泌/旁分泌因子积累到有效浓度。在这里，我们评估了多个发育能力的指标，以探讨母体EVs是否在单独和群体培养条件下影响胚胎质量。连续暴露于EVs与来自单独培养胚胎的囊胚中平均细胞数量增加有关，而在群体培养条件下未观察到明显效果。这些发现似乎与Leal等人（2022年）的报告不同[22]，他们观察到在群体培养中连续补充EVs后平均细胞数量增加。尽管我们的实验方法在母体液体收集、EV制备和培养条件方面大致相似，但直接比较时应谨慎。目前，造成这种差异的原因尚不清楚。胚胎培养基等实验变量的差异可能导致了观察到的差异，尽管本研究中没有特别讨论这一点。EVs补充还产生了一致的抗凋亡效应。在单独和群体培养中，EVs暴露显著减少了TUNEL阳性细胞的数量，这是囊胚能力的一个公认指标，因为发育停滞与凋亡增加有关[47]。这一结果与先前的报告一致，表明母体EVs可以降低不同物种的囊胚凋亡并改善胚胎质量[48, 49, 50]。与脂质相关的参数也受到了显著影响。EVs暴露减少了单独培养胚胎中大脂滴的丰度，并降低了囊胚中脂质所占的面积，无论是在单独培养还是群体培养中。这一发现具有生物学意义，因为大脂滴（>2微米）与牛囊胚的低温耐受性和发育能力降低有关[44, 51]。更广泛地说，这些观察结果支持了先前的证据，即母体EVs调节胚胎的脂质代谢和组成[3, 22]。与我们的结果一致，Leal等人[22]报告在连续补充母体EVs后群体培养的胚胎中脂质含量降低。相比之下，其余的终点仅显示出非显著趋势。EVs补充与单独和群体培养中孵化或已孵化的囊胚比例增加有关，但这些差异未达到统计学显著性。在任何培养条件下，EVs暴露均未显著影响线粒体活性，这与先前的报告一致[22, 37]。总之，我们的研究表明，母体EVs补充增强了囊胚的发育和质量，尤其是在受限的单独培养条件下效果最为明显。这些发现表明，微限制不仅仅是一个物理约束，而是胚胎对母体信号反应性的功能调节器，能够挽救那些容易发生发育延迟或停滞的胚胎。然而，在考虑将其应用于人类辅助生殖时，应谨慎解释这些结果。特别是，在极低培养体积下使用高密度胚胎需要仔细优化，因为胚胎数量与培养基体积之间的不平衡可能导致营养耗尽和潜在有害代谢产物的积累。此外，尽管在我们的实验条件下没有观察到明显的发育损伤，但受限微环境对胚胎表观遗传状态的可能影响仍有待阐明。总体而言，这项工作为下一代单独胚胎培养系统提供了概念和实验基础，旨在更好地体外再现母体生殖道的调控特征。阐明EVs-胚胎相互作用的分子途径并改进基于限制的培养平台将是优化胚胎培养策略的关键步骤。