经过设计的融合标签能够提高纳米抗体在大肠杆菌中的可溶性表达

《Magnetic Resonance Letters》：A designed fusion tag improves soluble expression of nanobody in E. coli

　　王星宇|阿里·拉扎|陶志清|王冠|张旭|刘梅莉|何立春
中国科学院武汉国家磁共振中心磁共振光谱与成像国家重点实验室，精密测量科学技术创新研究院，武汉，430071，中国

**摘要**
纳米抗体是从骆驼科动物重链抗体中衍生出的小分子单结构域抗体片段，具有高稳定性、强结合亲和力以及在治疗和诊断应用中的巨大潜力。在大肠杆菌（E. coli）中重组生产易聚集的单结构域抗体（纳米抗体）仍然是一个重要的生物技术挑战，这通常会导致不溶性包涵体的形成和低功能产量。为了解决这个问题，我们设计了将大肠杆菌中的串联周质伴侣蛋白Spheroplast Protein Y（EcSpy）与易聚集的Taq纳米抗体和HER2特异性纳米抗体融合的结构，利用其天然信号肽引导周质输出，并利用其伴侣蛋白特性帮助纳米抗体折叠。这种方法显著提高了纳米抗体的可溶性，这一点通过纯化过程中的SDS-PAGE分析得到了证实。经过多步纯化后，从1升大肠杆菌培养物中成功纯化了约10.0毫克的HER2纳米抗体和4.0毫克的Taq纳米抗体。纯化的纳米抗体表现出正确的折叠结构，通过圆二色性和一维1H NMR光谱得到了验证，并且在目标特异性免疫测定中保持了其功能。这些结果展示了一种在大肠杆菌中高效、可溶且功能性表达具有挑战性的纳米抗体的有前景策略。

**1. 引言**
在过去二十年里，重组抗体工程领域取得了显著进展，这主要归功于基于抗体的疗法在临床上的成功[1]。纳米抗体，也称为仅重链可变结构域抗体（VHHs），是天然存在于骆驼科动物（包括骆驼和羊驼）中的重链抗体的抗原结合部分[2]。它们是小型蛋白质，通常大小为12–15 kDa，能够以高亲和力和特异性结合目标[3]。它们的单结构域结构通常很稳定，在变性后可以重新折叠，并且能够进行基因融合[2, 4]，这支持了在细菌或酵母中的重组生产，并实现了多价、双特异性或酶联格式的应用[5]。因此，纳米抗体被广泛用作治疗、诊断、研究工具和生物传感平台的靶向模块[5]。然而，主要挑战往往不是亲和力，而是获得足够数量的可溶且功能性的纳米抗体，因为在大肠杆菌中的表达常常会导致它们聚集形成包涵体，并且难以形成正确的二硫键以实现正确折叠[6]。

纳米抗体（VHHs）具有保守的免疫球蛋白折叠结构，这种结构由框架区域1（FR1）和框架区域3（FR3）中的半胱氨酸残基（Cys22-Cys92，Kabat编号）之间的典型内域二硫键稳定[7]。这个二硫键连接了免疫球蛋白折叠的两个β-折叠片，对结构完整性至关重要[7]。此外，许多纳米抗体还包含一个非典型的第二二硫键，这种二硫键因物种和序列而异：在骆驼中，它通常位于互补决定区1（CDR1）和互补决定区3（CDR3）之间。这个额外的二硫键限制了扩展的CDR3环的构象，同时增强了热稳定性，而不一定影响抗原结合[7, 8]。

重组蛋白表达是分子生物学中的基础方法，它能够生产用于生化测定、结构研究和生物技术应用的特定蛋白质[9, 10]。革兰氏阴性细菌大肠杆菌是最常用的重组蛋白生产宿主之一，因为它生长迅速、培养成本低且易于进行基因操作[11, 12]。尽管有这些优势，但包括纳米抗体在内的重组蛋白的高水平表达常常会超出细胞的折叠和质量控制能力，导致蛋白质错误折叠、蛋白水解以及聚集形成包涵体[13, 14]。从包涵体中回收活性蛋白通常需要溶解和重新折叠步骤，这会降低产量并增加下游处理的复杂性[14, 15]。此外，许多纳米抗体需要一个或多个二硫键来保持其天然稳定性和功能，但大肠杆菌细胞质的还原环境可能会限制正确的二硫键形成，进一步导致错误折叠和活性丧失[16, 17, 18]。

EcSpy（大肠杆菌中的Spheroplast Protein Y）是一种小型、应激响应的伴侣蛋白，存在于大肠杆菌的周质中，在包膜应激条件下被激活，并且不需要三磷酸腺苷（ATP）即可发挥作用。它可以促进蛋白质的有效折叠，抑制聚集，并结合多种非天然客户蛋白[19, 20]。机制研究表明，EcSpy不仅仅只是隔离未折叠的蛋白质。此外，它还允许客户蛋白在与其结合的情况下探索不同的构象并完成折叠，从而模糊了传统上对保持酶和折叠酶的区分[20, 21]。因此，将EcSpy与纳米抗体融合可能从两个方面帮助其折叠：1. 将EcSpy融合蛋白分泌到大肠杆菌的周质中有助于纳米抗体中正确二硫键的形成；2. EcSpy与未折叠或部分折叠的纳米抗体中的暴露疏水区域结合，防止它们聚集，从而完成正确的折叠[22]。由于EcSpy形成一个反平行二聚体，我们构建了一个串联EcSpy融合载体，以提高两种具有挑战性的纳米抗体的可溶性和正确折叠：一种针对HER2（一种重要的乳腺癌生物标志物），另一种针对Taq DNA聚合酶（一种常用的热启动聚合酶链反应（PCR）试剂[23, 24, 25, 26]。这一策略提高了正确折叠纳米抗体的产量。

圆二色性（CD）、一维1H NMR和酶联免疫吸附测定（ELISA）证实了纳米抗体的正确折叠和功能保持。我们的结果表明，串联EcSpy是一种在大肠杆菌中高效、可溶且功能性生产纳米抗体的有前景的融合策略。

**2. 材料与方法**
**2.1. 质粒构建**
为了建立传统表达策略的基准，首先将Taq或HER2纳米抗体序列克隆到一个经过修改的pET21a载体中，生成了一个带有Small Ubiquitin-like Modifier（SUMO）标签的构建体。该构建体编码一个N端十组氨酸（His10）标签，随后是一个酵母SUMO结构域和感兴趣的纳米抗体。为了克服标准方法中观察到的严重包涵体形成问题，使用pET-28a（+）骨架设计了一个优化的EcSpy基构建体。EcSpy是大肠杆菌中的外源性周质分子伴侣蛋白，携带一个N端信号肽（MRKLTALFVASTLALGAANLAHA），引导其分泌到氧化性的周质区。信号肽之后是一个十组氨酸标签His10亲和标签，一个由柔性肽连接器（GGGGSGGGGS）连接的串联EcSpy模块，以保持两个伴侣单元的空间灵活性和功能独立性，以及一个TEV蛋白酶切割位点（ENLYFQG），位于纳米抗体上游，便于纯化后回收无标签的天然纳米抗体。HER2纳米抗体的氨基酸序列来自蛋白质数据库（PDB ID：5MY6），而Taq纳米抗体序列则来自我们实验室构建的纳米抗体文库。所有基因序列都经过密码子优化，适用于大肠杆菌表达，由GenScript Biotech Corporation商业合成，并克隆到相应的载体中。

**2.2. 蛋白质表达和纯化**
将重组质粒转化到大肠杆菌T7 Express（New England Biolabs, NEB）中进行蛋白质表达。选取一个转化的菌落接种到5毫升LB（Luria-Bertani）培养基（10.0克/升色氨酸，5.0克/升酵母提取物，10.0克/升NaCl）中，添加100微克/毫升卡那霉素。这种预培养物在37°C下摇床培养过夜。将过夜培养物以1:100（v/v）稀释到100毫升TB（Terrific Broth）培养基（11.8克/升色氨酸，23.6克/升酵母提取物，9.4克/升K2HPO4，2.2克/升KH2PO4）中，继续培养至OD600约为0.5–0.6。然后使用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达，最终浓度为0.5 mM。将培养物转移到18°C下摇床培养18小时。诱导后，通过6000 × g离心30分钟在4°C下收获细胞。细胞沉淀物重新悬浮在150毫升碱性裂解缓冲液（50毫克/升NaHCO3，300毫克/升NaCl，pH 11.0）中，加入0.1毫克/毫升苯甲基磺酰氟（PMSF）和0.01毫克/毫升脱氧核糖核酸酶I。使用高压均质器进行细胞裂解。裂解液通过20000 × g离心45分钟在4°C下澄清。可溶性蛋白质部分应用于预先用裂解缓冲液（不含蛋白酶/核酸酶抑制剂）平衡的Ni–nitrilotriacetic acid（Ni-NTA）亲和柱（Qiagen）。柱子用200毫升洗涤缓冲液洗涤，样品分三次以逐渐增加的咪唑浓度（10毫克/升、20毫克/升和30毫克/升）进行洗脱。随后使用50毫升洗脱缓冲液A（50毫克/升NaHCO3，300毫克/升NaCl，500毫克/升咪唑）洗脱His标签的目标蛋白。

**2.3. TEV蛋白酶切割和最终纯化**
在串联EcSpy融合之前，将洗脱的蛋白质在4°C下用Tobacco Etch Virus（TEV）消化缓冲液（25毫克/升Tris-HCl，150毫克/升NaCl，0.1毫克/升Dithiothreitol（DTT），pH 8.0）透析过夜。透析液通过20000 × g离心20分钟在4°C下澄清。将TEV蛋白酶以40:1（目标蛋白：酶）的质量比加入上清液中，然后在4°C下过夜孵育进行切割反应。消化后，将样品透析回缓冲液A（50毫克/升NaHCO3，300毫克/升NaCl，pH 11.0）中以沉淀杂质。通过20000 × g离心20分钟在4°C下去除沉淀物，保留上清液。使用十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析沉淀物和上清液部分，以监测切割效率。对于带有N端His标签的构建体，将切割后的样品应用于预先用缓冲液A平衡的反向Ni-NTA亲和柱。收集含有Taq和HER2纳米抗体的流穿部分。最后使用HiLoad? Superdex? 75预级柱（Cytiva，前身为GE Bioscience）进行尺寸排阻色谱（SEC）纯化，该柱子用SEC缓冲液（20毫克/升磷酸钠，150毫克/升NaCl，pH 7.4）平衡。将尺寸排阻色谱中观察到的主要峰对应的部分合并，使用适当的离心过滤器浓缩，并储存在-20°C以备后续使用。

**2.4. CD光谱**
通过CD光谱分析纯化纳米抗体的二级结构。测量在Chirascan光谱仪（Applied Photophysics Ltd.）上进行。蛋白质样品在10毫克/升磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中稀释至最终浓度74微克/毫升。在室温下使用石英比色皿在190–260纳米的波长范围内记录光谱。每个样品进行三次连续扫描并取平均值以提高信噪比。通过减去在相同条件下记录的仅含缓冲液的光谱来进行基线校正。

**2.5. 1H NMR光谱**
在一台配备低温探头的600 MHz Bruker Avance光谱仪上，298 K下获取了一维1H核磁共振（1H NMR）光谱。样品在NMR缓冲液（20毫克/升磷酸钠，50毫克/升NaCl，10% D2O，pH 7.4）中制备，浓度分别为0.2毫克/毫升（HER2纳米抗体）和0.1毫克/毫升（Taq纳米抗体）。使用zggpw5脉冲序列记录光谱，共512次扫描和4次虚拟扫描。数据使用Topspin 3.7（Bruker Biospin）进行处理。

**2.6. ELISA测定**
**2.6.1. HER2纳米抗体的ELISA**
将纯化的HER2纳米抗体（2.0微克/毫升）包被在96孔微孔板上（100微升/孔），并在4°C下孵育过夜。用含有0.5%（v/v）非脂干奶的PBS（pH 7.4）洗涤孔板五次。用200微升/孔的5%（w/v）非脂干奶在37°C下封闭非特异性结合位点2小时。丢弃封闭溶液并干燥孔板后，用PBS洗涤孔板五次。加入Sangon Biotech公司生产的HER2抗原（D111419-0100）的系列稀释液，在37°C下孵育1小时。用含有2.0毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）的孔板作为阴性对照。洗涤五次后，向每个孔中加入100微升辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗骆驼科VHH抗体（GenScript，A01861-200；稀释1:5000），并在37°C下孵育1小时。最后洗涤后，向每个孔中加入100微升新鲜制备的3,3',5,5'-四甲基苯二胺（TMB）底物溶液（含有9.8毫升柠檬酸，30毫升30% H2O2和200微升TMB储备液130毫克/50毫升），并在37°C下孵育15分钟。反应用2 M H2SO4终止，并在450 nm处测量吸光度。2.6.2. Taq纳米抗体的ELISA重组Taq聚合酶（5.0 μg/mL）被吸附到96孔微孔板上（每孔100 μL），并在4°C下孵育过夜。在相同条件下用BSA（5.0 μg/mL）包被的孔作为阴性对照。将板用PBST洗涤五次，然后用200 μL/well的5%（w/v）脱脂干奶粉在PBST中封闭2小时，温度为37°C。再次用PBST洗涤五次后，加入系列稀释的Taq纳米抗体（每孔100 μL），并在37°C下孵育1小时。经过五次洗涤后，向每个孔中加入100 μL的HRP结合的兔抗骆驼VHH抗体（GenScript，A01861-200；稀释比为1:5000），并在37°C下孵育60分钟。最后洗涤后，向每个孔中加入100 μL的TMB底物溶液，并在37°C下孵育15分钟。反应用2 M H2SO4终止，并在450 nm处读取吸光度。3. 结果单域抗体（VHHs）由一个包含保守的四个FRs和CDRs的可变域组成，这些FRs和CDRs负责抗原结合。典型的VHH纳米抗体的结构组织，包括有助于域稳定性的保守二硫键，在图1中进行了说明。下载：下载高分辨率图像（397KB）下载：下载全尺寸图像图1. VHH纳米抗体的示意图，显示了框架区域、互补决定环和保守的二硫键。在图1中，纳米抗体通常具有两个保守的二硫键：FR1和FR3之间的典型二硫桥（用红色箭头标出），它稳定了特征的免疫球蛋白（Ig）折叠；以及一个额外的二硫键，通常形成在CDR1和CDR3环之间，它限制并维持了抗原结合位点的结构。这些二硫键在氧化的周质空间中的正确形成对于折叠效率和结构完整性至关重要。3.1. 初始融合策略产生不溶性纳米抗体最初尝试使用N端SUMO融合标签在大肠杆菌中表达HER2和Taq纳米抗体，主要产生了不溶性蛋白质。SDS–PAGE分析显示，大部分表达的SUMO–HER2和SUMO–Taq纳米抗体存在于沉淀部分（补充图S1A和S1B）。这种分布与包涵体的形成一致，可能是由于大肠杆菌细胞质的还原环境阻碍了纳米抗体中的二硫键形成。3.2. 串联EcSpy融合显著提高了可溶性表达与串联EcSpy融合后，HER2和Taq纳米抗体从不溶性部分显著转移到可溶性部分（图2B和2C），与基于SUMO的表达相比有了显著改进（补充图S1）。为了进一步提高折叠和可溶性，采用了基于分泌的表达策略。将串联EcSpy与其天然信号肽融合，以将融合蛋白导向周质空间。大肠杆菌的周质环境提供了促进二硫键形成的氧化条件，这对抗体片段的稳定性很重要。为了验证亚细胞定位，使用冷渗透冲击法进行了周质提取。周质提取的详细方案在补充材料方法中提供。SDS–PAGE分析显示，串联EcSpy–VHHs融合蛋白主要存在于周质部分，而在原生质部分信号极弱（补充图S2）。这些结果表明，天然的EcSpy信号肽成功地将融合蛋白导向了周质空间。下载：下载高分辨率图像（369KB）下载：下载全尺寸图像图2. 与N端信号肽和串联EcSpy融合显著提高了纳米抗体的可溶性。（A）通过基因融合两个Spy序列并连接一个GGGGSGGGGS连接器构建了Spy-Spy串联二聚体标签。（B–C）对整个大肠杆菌裂解物中的可溶性（S）和不溶性（P）部分进行SDS-PAGE分析，并随后使用Ni-NTA纯化携带串联EcSpy的纳米抗体（B：HER2纳米抗体；C：Taq纳米抗体）。箭头指示目标Spy标记的蛋白质（约50 kDa）：M，蛋白质标记物；F，流过；W，洗涤；E，洗脱部分。值得注意的是，与串联EcSpy融合的蛋白质在固定金属亲和色谱（IMAC）中也表现出改善的行为，能够高效地结合到Ni–NTA树脂上，并以更尖锐、更集中的峰形式洗脱。基于这些观察结果，信号肽–EcSpy融合策略使得原本难以在大肠杆菌周质中表达的纳米抗体能够高效地实现可溶性表达。3.3. 串联EcSpy切割后纳米抗体保持可溶性在对可溶性串联EcSpy纳米抗体融合物进行亲和纯化后，通过切割缓冲液在4°C下用TEV蛋白酶孵育一夜来切割融合伴侣，以回收天然纳米抗体。通过SDS-PAGE评估，反应几乎完成，消化过程中和之后都没有观察到沉淀（图3B和3C）。然后将透析样品通过Ni-NTA柱，其中His10标记的串联EcSpy部分被保留，而未标记的纳米抗体则收集在流过部分。SDS-PAGE分析确认了纳米抗体的有效分离和回收（图3B和3C）。关键的是，纳米抗体在整个切割和纯化过程中保持可溶性。去除标签后没有观察到沉淀，表明即使伴侣结构域被切割，串联EcSpy融合策略也成功保持了纳米抗体的可溶性。在大约35 kDa处观察到的双峰对应于切割的His-Spy-Spy融合，可能是由于柔性连接器区域的轻微蛋白水解；重要的是，目标纳米抗体保持完整且可溶，适合进行后续的结构和功能研究。这种在串联EcSpy标签上发生的部分连接器降解不会影响纯化效率以及最终纳米抗体的纯度。下载：下载高分辨率图像（347KB）下载：下载全尺寸图像图3. 在EcSpy切割后，目标蛋白质保持可溶性。（A）可切割EcSpy构建的示意图，其中TEV蛋白酶识别位点（ENLYFQG）插入在EcSpy和目标纳米抗体之间。（B–C）TEV蛋白酶消化后Ni-NTA亲和色谱部分的SDS-PAGE分析，分别针对HER2纳米抗体（B）和Taq纳米抗体（C）。泳道：M，蛋白质标记物；A，反向Ni-NTA应用前的消化样品；F，流过；W，洗涤；E，洗脱。最终通过尺寸排阻色谱（SEC）（Superdex 75）进行纯化，得到了均匀的产品。纳米抗体以单一、对称的峰形式洗脱，其表观分子量与单体纳米抗体一致，对该峰部分的SDS-PAGE分析确认了高纯度（图4A和4B）。这表明Spy分泌系统赋予的可溶性和均匀的尺寸分布在使用串联EcSpy伴侣去除后仍然得以保留。下载：下载高分辨率图像（451KB）下载：下载全尺寸图像图4. 通过尺寸排阻色谱（SEC）纯化了纳米抗体。（A）SEC洗脱曲线和相应的HER2纳米抗体的SDS-PAGE分析。（B）SEC洗脱曲线和相应的Taq纳米抗体的SDS-PAGE分析。纯化使用Superdex-75柱（GE Bioscience）进行，柱子用SEC缓冲液A（20 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH 7.4）平衡。纳米抗体在大约90 mL处洗脱。由于中间洗脱部分中的咪唑会干扰标准比色蛋白测定，因此这些步骤中的蛋白质量和回收率是半定量估计的。具体来说，由于在280 nm处有显著干扰，直接的光谱光度定量不适用于含有咪唑的部分；因此，使用SDS-PAGE的相对条带强度作为这些中间步骤中蛋白质量的代理，而绝对产量则基于SEC后纯化纳米抗体的最终A280测量值。使用ImageJ软件对SDS-PAGE凝胶进行密度分析以确定相对条带强度（面积积分）。这些比率结合最终无标签纳米抗体的精确蛋白质浓度（通过SEC后的A280确定），用于计算之前纯化步骤的产量和回收率（表1）。经过包括初始Ni-NTA亲和色谱、通过TEV蛋白酶切割去除融合标签、反向Ni-NTA色谱以及使用Superdex 75尺寸排阻色谱的最终精制步骤的多步骤纯化程序后，1 L的大肠杆菌培养物最终产生了大约10.0 mg的HER2纳米抗体和4.0 mg的Taq纳米抗体。表1. 从1 L大肠杆菌培养物中纯化重组串联EcSpy纳米抗体的总结。纯化步骤（HER2纳米抗体）体积 /(mL)浓度 /(mg/mL)总蛋白质 /(mg)产量 /(mg/L)1. 清晰的细胞裂解液150N/DN/DN/D2. Ni-NTA色谱（串联EcSpy-纳米抗体）1250.675.075.03. TEV切割 & 反向Ni-NTA500.315.015.04. 尺寸排阻色谱200.510.010.0纯化步骤（Taq纳米抗体）体积 /(mL)浓度 /(mg/mL)总蛋白质 /(mg)产量 /(mg/L)1. 清晰的细胞裂解液150N/DN/DN/D2. Ni-NTA色谱（串联EcSpy-纳米抗体）1000.2727.027.03. TEV切割 & 反向Ni-NTA250.328.08.04. 尺寸排阻色谱200.204.04.0(N/D = 未确定)3.4. 结构分析确认纯化纳米抗体的正确折叠构象我们使用结构和功能测定相结合的方法确认了纯化纳米抗体保持了预期的天然构象。纯化纳米抗体的CD光谱在218 nm附近显示特征性的负最小值，在195 nm附近显示正峰，这与免疫球蛋白可变域折叠的典型β-折叠二级结构一致（图5A和5B）。使用BeStSel网络服务器[29]通过光谱反卷积估计了二级结构含量。Taq纳米抗体的光谱分析显示β-链含量约为40%，α-螺旋含量约为11%，与VHH域报告的免疫球蛋白样折叠一致。HER2纳米抗体的光谱分析显示类似的β-折叠特征，β-折叠含量超过30%，进一步确认了两种纯化蛋白质的正确折叠。一维1H NMR光谱用于评估纯化纳米抗体的整体折叠质量。纯化纳米抗体的1H NMR光谱在低场区域（8.5–10.5 ppm）显示出优异的酰胺质子信号分散，有许多清晰、分辨率高的共振峰（图5C和5D）。这种光谱特征表明蛋白质具有稳定的三级结构。与未折叠或严重聚集的蛋白质不同，后者通常表现出有限的化学位移分散和宽泛、分辨率低的信号，纯化纳米抗体产生了在酰胺和脂肪族区域清晰分散的共振峰。1H NMR光谱中的高场信号也表明了蛋白质的折叠行为。这些特征表明没有聚集或错误折叠。这种在串联EcSpy标签上发生的部分连接器降解不会影响纯化效率以及最终纳米抗体的纯度。下载：下载高分辨率图像（347KB）下载：下载全尺寸图像图3. 在EcSpy切割后，目标蛋白质保持可溶性。（A）可切割EcSpy构建的示意图，其中TEV蛋白酶识别位点（ENLYFQG）插入在EcSpy和目标纳米抗体之间。（B–C）TEV蛋白酶消化后Ni-NTA亲和色谱部分的SDS-PAGE分析，分别针对HER2纳米抗体（B）和Taq纳米抗体（C）。泳道：M，蛋白质标记物；A，反向Ni-NTA应用前的消化样品；F，流过；W，洗涤；E，咪唑洗脱。最终通过尺寸排阻色谱（SEC）（Superdex 75）进行纯化，得到了均匀的产品。纳米抗体以单一、对称的峰形式洗脱，其表观分子量与单体纳米抗体一致，对该峰部分的SDS-PAGE分析确认了高纯度（图4A和4B）。这表明Spy分泌系统赋予的可溶性和均匀的尺寸分布在使用串联EcSpy伴侣去除后仍然得以保留。下载：下载高分辨率图像（451KB）下载：下载全尺寸图像图4. 通过尺寸排阻色谱（SEC）纯化了纳米抗体，达到了高纯度。（A）SEC洗脱曲线和相应的HER2纳米抗体的SDS-PAGE分析。（B）SEC洗脱曲线和相应的Taq纳米抗体的SDS-PAGE分析。纯化使用Superdex-75柱（GE Bioscience）进行，柱子用SEC缓冲液A（20 mM磷酸钠，150 mM NaCl，pH 7.4）平衡。纳米抗体在大约90 mL处洗脱。由于中间洗脱部分中的咪唑会干扰标准比色蛋白测定，因此这些步骤中的蛋白质量和回收率是半定量估计的。具体来说，由于在280 nm处有显著干扰，直接的光谱光度定量不适用于含有咪唑的部分；因此，使用SDS-PAGE的相对条带强度作为这些中间步骤中蛋白质量的代理，而绝对产量则基于SEC后纯化纳米抗体的最终A280测量值。使用ImageJ软件对SDS-PAGE凝胶进行密度分析以确定相对条带强度（面积积分）。这些比率结合最终无标签纳米抗体的精确蛋白质浓度（通过SEC后的A280确定），用于计算之前纯化步骤的产量和回收率（表1）。经过包括初始Ni-NTA亲和色谱、通过TEV蛋白酶切割去除融合标签、反向Ni-NTA色谱以及使用Superdex 75尺寸排阻色谱的最终精制步骤的多步骤纯化程序后，1 L大肠杆菌培养物最终产生了大约10.0 mg的HER2纳米抗体和4.0 mg的Taq纳米抗体。表1. 从1 L大肠杆菌培养物中纯化重组串联EcSpy纳米抗体的总结。纯化步骤（HER2纳米抗体）体积 /(mL)浓度 /(mg/mL)总蛋白质 /(mg)产量 /(mg/L)1. 清晰的细胞裂解液150N/DN/DN/D2. Ni-NTA色谱（串联EcSpy-纳米抗体）1250.675.075.03. TEV切割 & 反向Ni-NTA500.315.015.04. 尺寸排阻色谱200.510.010.0纯化步骤（Taq纳米抗体）体积 /(mL)浓度 /(mg/mL)总蛋白质 /(mg)产量 /(mg/L)1. 清晰的细胞裂解液150N/DN/DN/D2. Ni-NTA色谱（串联EcSpy-纳米抗体）1000.2727.027.03. TEV切割 & 反向Ni-NTA250.328.08.04. 尺寸排阻色谱200.204.04.0(N/D = 未确定)3.4. 结构分析确认纯化纳米抗体的正确折叠构象我们使用结构和功能测定相结合的方法确认了纯化纳米抗体保持了预期的天然构象。纯化纳米抗体的CD光谱在218 nm附近显示特征性的负最小值，在195 nm附近显示正峰，这与免疫球蛋白可变域折叠的典型β-折叠二级结构一致（图5A和5B）。使用BeStSel网络服务器[29]通过光谱反卷积估计了二级结构含量。Taq纳米抗体的光谱分析显示β-链含量约为40%，α-螺旋含量约为11%，与VHH域报告的免疫球蛋白样折叠一致。HER2纳米抗体的光谱分析显示类似的β-折叠特征，β-折叠含量超过30%，进一步确认了两种纯化蛋白质的正确折叠。一维1H NMR光谱用于评估纯化纳米抗体的整体折叠质量。纯化纳米抗体的1H NMR光谱在低场区域（8.5–10.5 ppm）显示出优异的酰胺质子信号分散，有许多清晰、分辨率高的共振峰（图5C和5D）。这种光谱特征表明蛋白质具有稳定的三级结构。与未折叠或严重聚集的蛋白质不同，后者通常表现出有限的化学位移分散和宽泛、分辨率低的信号，纯化纳米抗体产生了在酰胺和脂肪族区域清晰分散的共振峰。1H NMR光谱中的高场信号也表明了蛋白质的折叠行为。这些特征表明没有聚集或错误折叠。这种分散模式已在正确折叠的纳米抗体中得到明确记录[30]，证实了我们重组纳米抗体的结构特性。使用（ELISA）[32]验证了纯化纳米抗体的功能完整性。对于抗HER2纳米抗体，采用了夹心ELISA：将纯化的HER2纳米抗体作为捕获试剂固定，随后加入系列稀释的重组HER2抗原，并用HRP结合的抗VHH二级抗体检测结合的抗原。对于抗Taq聚合酶纳米抗体，采用了直接ELISA格式，其中将重组Taq聚合酶直接吸附到板上，然后加入系列稀释的Taq纳米抗体作为检测试剂，随后使用相同的HRP结合的二级抗体。下载：下载高分辨率图像（750KB）下载：下载全尺寸图像图5. 纯化纳米抗体的结构完整性和抗原结合活性。（A, B）HER2纳米抗体（A）和Taq纳米抗体（B）的远紫外圆二色性（CD）光谱（190至260 nm），表明良好的二级结构。（C, D）HER2纳米抗体（C）和Taq纳米抗体（D）的芳香区域（8.5至10.5 ppm上部分）和上场甲基质子区域（下部分）的一维1H NMR光谱，显示与正确折叠的蛋白质一致的清晰分散的共振峰。（E, F）HER2纳米抗体与固定化的HER2（E）和Taq纳米抗体与固定化的Taq（F）的ELISA结合曲线，以OD 450 nm对蛋白质浓度作图；阴性对照显示背景信号。如图5E和5F所示，HER2纳米抗体和Taq纳米抗体都表现出对其相应抗原的强效、剂量依赖的结合，在较高浓度下观察到信号饱和。结合是特异性的，因为在涂有BSA作为阴性对照的孔中没有检测到显著信号。总之，这些数据证实了在我们优化的条件下纯化的纳米抗体保持了其天然的、高亲和力的抗原结合功能。CD、NMR和ELISA数据共同提供了一致的证据，表明我们的基于分泌的表达和纯化策略产生了正确折叠、类似天然的纳米抗体。这些结果表明最终产品不是可溶性聚集体或无序的随机线圈，而是适合进行功能和结构研究的单分散、结构明确的蛋白质。4.在大肠杆菌中高效生产可溶性纳米抗体仍然是重组抗体工程中的一个常见瓶颈。尽管纳米抗体具有相对稳定的免疫球蛋白结构，但在细菌表达过程中，许多VHH结构域仍然会聚集，尤其是在正确的二硫键形成和折叠无法跟上快速蛋白质合成速度时[33]。因此，容易聚集的纳米抗体经常以包涵体的形式积累，限制了其功能性产量[34]。在这项研究中，我们通过设计一种串联EcSpy融合策略来应对这一挑战，该策略结合了周质定位和伴侣蛋白辅助的折叠。在这种串联结构中，一个Spy单体的柔性C末端通过一个短的甘氨酸-丝氨酸连接子与另一个单体的柔性N末端相连。EcSpy的天然信号肽将融合蛋白引导到周质环境中，这种氧化环境有助于二硫键的形成，这对纳米体的结构稳定性至关重要[35, 36]。同时，Spy作为一种不依赖ATP的伴侣蛋白，能够稳定部分折叠的中间体并防止偏离正常路径的聚集[37, 38]。这种双重机制可能促进了纳米体在转运过程中及之后的有效折叠。与这一机制一致，串联EcSpy系统显著提高了两种易聚集的纳米抗体HER2和Taq的可溶性表达。重要的是，在用TEV蛋白酶去除EcSpy标签后，这些纳米抗体仍然保持可溶性，在整个切割和后续纯化步骤中均未观察到沉淀现象。这种行为表明EcSpy促进了目标纳米体的真正有效折叠，而不仅仅是一个物理上的溶解度屏蔽层，用于掩盖易聚集的表面。通过CD和1H NMR光谱的结构表征以及抗原结合测定进一步证实，纯化的纳米体保留了其天然结构和功能。这些结果表明，串联EcSpy融合提供了一种有效的方法，可以改善大肠杆菌中难处理纳米体的可溶性表达，提供了一种简单的方法，可以扩展到其他难处理的纳米抗体目标。

我们的串联EcSpy策略相比现有的表达平台具有显著的优势。虽然传统的N端融合标签（如SUMO）被广泛用于提高重组蛋白的表观溶解度，但它们通常缺乏帮助富含二硫键的目标进行复杂折叠路径的内在能力[39]。因此，使用SUMO标签在大肠杆菌的还原性细胞质中表达像纳米体这样的复杂蛋白质时，往往无法防止错误折叠，最终导致无活性的包涵体积累[40]。相比之下，我们的融合策略通过将活性伴侣蛋白介导的折叠与信号肽引导的转运到氧化性周质环境相结合，从而确保了高溶解度和正确的二硫键形成。此外，由于野生型Spy伴侣蛋白自然形成活性二聚体，我们设计的串联排列可能稳定了这种功能构象，提供了更大的相互作用表面，以有效容纳纳米体的折叠中间体。串联EcSpy策略的通用性应在具有不同生物物理特性的纳米体上进行测试，包括不同的CDR组成、二硫键数量和聚集倾向。

5. 结论

在这项研究中，我们开发了一种串联EcSpy融合策略，以改善大肠杆菌中易聚集纳米体的可溶性表达。通过结合周质定位和Spy的伴侣蛋白活性，该系统促进了有效折叠并抑制了表达过程中的聚集。使用两种难以表达的纳米体（当使用SUMO标签时无法溶解），我们证明了EcSpy标签显著提高了它们的可溶性产量。去除EcSpy标签后，这两种纳米体仍然保持可溶性、正确折叠并且具有功能性。总体而言，这项工作提供了一种简单、有效且有前景的方法，用于在大肠杆菌中生产功能性纳米体，并可能有助于其他易聚集抗体片段的表达。

附录A. 补充数据

本文的补充数据可在线获取。

作者贡献声明

何丽春：写作 - 审稿与编辑、写作 - 原始草稿、可视化、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。

刘梅丽：资源提供、资金获取、概念化。

张旭：资源提供、资金获取、概念化。

王冠：研究。

陶志清：方法学。

阿里·拉扎：写作 - 审稿与编辑、写作 - 原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。

王星宇：写作 - 审稿与编辑、写作 - 原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。

数据可用性

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