《Immunology》：Inducing Antigen-Specific and Functional Immune Responses in Mice Toward Bovine Herpesvirus 1 and Bovine Respiratory Syncytial Virus by Chimeric Peptides Delivered by Bovine Herpesvirus 4-Based Vector
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牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease, BRD）仍是养牛业面临的重大健康与经济挑战，其发病涉及病毒与细菌病原体的相互作用，严重影响动物福利、生产力及抗菌药物管理。在主要病毒病原体中，牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvir
牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease, BRD）仍是养牛业面临的重大健康与经济挑战，其发病涉及病毒与细菌病原体的相互作用，严重影响动物福利、生产力及抗菌药物管理。在主要病毒病原体中，牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus 1, BoHV-1）和牛呼吸道合胞病毒（Bovine respiratory syncytial virus, BRSV）在引发和加剧呼吸道病理过程中起关键作用。本研究构建了两种重组牛疱疹病毒4型（BoHV-4）载体，分别编码基于BoHV-1糖蛋白D（glycoprotein D, gD）和BRSV融合糖蛋白（glycoprotein F, gF）的嵌合抗原，旨在开发一种多价疫苗平台。在小鼠模型中的免疫学评估表明，两种疫苗构建物均能针对两种病原体诱导强烈的体液和细胞介导的免疫应答。疫苗接种诱导了能够抑制BoHV-1和BRSV感染的中和抗体，以及介导针对表达任一抗原的靶细胞产生细胞毒性活性的抗原特异性T细胞应答。这些发现证明了嵌合抗原能有效引发针对BoHV-1和BRSV这两种主要不同病原体的体液和细胞免疫应答，且BoHV-4是递送异源抗原的多功能载体。诱导病毒中和及细胞毒性T细胞活性的能力，支持进一步开发BoHV-4载体双价疫苗以控制BRD，有望改善牲畜健康并减少对抗菌治疗的依赖。此外，本研究强调了基于BoHV-4的载体和嵌合肽作为一种有前景的双价疫苗平台，可能适用于控制人类群体中的类似病毒，如人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, hRSV）和水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus, VZV）。
## 研究背景与问题
牛呼吸道疾病（BRD）是全球养牛业面临的最重大经济损耗原因之一，其发病机制复杂，涉及病毒、细菌、应激及环境因素。其中，牛疱疹病毒1型（BoHV-1）和牛呼吸道合胞病毒（BRSV）是引发BRD的关键原发性病毒病原体。BoHV-1的糖蛋白D（gD）及BRSV的融合糖蛋白（gF）因其在病毒入侵中的关键作用及高免疫原性，成为疫苗设计的理想靶点。尽管现有商业疫苗（如多价灭活或弱毒疫苗）广泛使用，但仍存在免疫原性有限、保护期短及母源抗体干扰等问题。因此，开发能同时诱导强效体液与细胞免疫的新型多价疫苗平台迫在眉睫。
技术路线与方法
本研究采用BoHV-4（一种低致病性γ-疱疹病毒）作为病毒载体平台，构建了两种重组病毒：BoHV-4-A-CMV-gDsp-gF-gD-ΔTK（表达跨膜嵌合抗原）和BoHV-4-A-CMV-gDsp-gF-gDΔTM-ΔTK（表达分泌型嵌合抗原）。研究首先通过生物信息学工具（Phobius、Jcat）预测并优化了gD与gF的嵌合结构（gDsp-gF-gD），利用BAC同源重组技术将表达盒插入病毒TK基因位点，并在HEK 293T及BEK细胞中验证了蛋白表达与分泌。免疫学评估在BALB/c小鼠模型中进行，通过两次免疫（间隔2周）后采集血清及脾脏样本，利用流式细胞术（FACS）、中和试验及细胞毒性T淋巴细胞（CTL）检测，系统评估了疫苗诱导的NK细胞、T细胞亚群及抗体应答。
研究结果与发现
2.1 嵌合肽的拓扑预测与理性设计
研究人员通过拓扑预测确认BRSV gF和BoHV-1 gD均为I型跨膜蛋白。为优化表达，将gF的信号肽替换为gD信号肽，构建了嵌合蛋白gDsp-gF-gD。密码子优化后，该蛋白在哺乳动物细胞中成功表达，并保留了gF介导的合胞体形成活性。进一步删除跨膜区构建的分泌形式gDsp-gF-gDΔTM，仍具备分泌能力和部分融合活性，为后续免疫原性研究提供了工具。
2.2 重组BoHV-4载体的构建与表征
利用BAC重组工程系统，成功将CMV驱动的gDsp-gF-gD及gDsp-gF-gDΔTM表达盒插入BoHV-4-A基因组的TK位点，获得重组病毒。Western blot证实感染细胞中嵌合抗原的正确表达与分泌。尽管重组病毒在体外复制滴度较野生型略有下降（约1.5个对数差异），提示抗原过表达可能带来细胞毒性，但仍能稳定传代。
2.3 疫苗在小鼠模型中诱导有效免疫
BALB/c小鼠免疫结果显示，与对照组相比，两种重组疫苗均显著提升了外周血中NK细胞、CD4+及CD8+T细胞的频率及活化标志物（CD25、CD69）的表达。更重要的是，疫苗诱导了高水平的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性，能够有效杀伤表达gD或gF的靶细胞。血清学分析证实了针对BoHV-1和BRSV的高效中和抗体产生，且分泌型抗原（ΔTM）在诱导某些T细胞记忆亚群（如中央记忆T细胞）方面表现出一定优势。
讨论与结论
本研究证实了基于BoHV-4载体递送gD-gF嵌合抗原的双价疫苗平台，能在小鼠模型中同时激发针对BoHV-1和BRSV的全面免疫应答（包括中和抗体与CTL）。BoHV-4展现了作为兽医疫苗载体的巨大潜力，其低致病性与大基因容量支持多价抗原的稳定递送。该策略不仅为控制BRD、减少抗生素使用提供了新方案，其嵌合设计思路（如信号肽优化、跨膜域修饰）也为开发针对人呼吸道病毒（如hRSV、VZV）的疫苗提供了可借鉴的技术路径。未来研究需在牛这一天然宿主中进一步验证其保护效力及安全性。
