基于ARMS-qPCR技术的BRAF和TERT启动子突变检测：一种用于乳头状甲状腺癌分子诊断的经济有效策略

《International Journal of Endocrinology》：ARMS-qPCR-Based Detection of BRAF and TERT Promoter Mutations: A Cost-Effective Strategy for Molecular Diagnosis of Papillary Thyroid Carcinoma

摘要

本研究旨在建立一种快速、灵敏的方法，利用扩增抵抗突变系统-定量PCR（ARMS-qPCR）结合TaqMan探针来检测BRAF V600E、TERT C228T和TERT C250T突变。我们在实验室系统评估了该方法的准确性、灵敏度、重复性和特异性，并在临床样本中对其检测性能进行了评估。共分析了40份福尔马林固定、石蜡包埋的样本（34份乳头状甲状腺癌[PTC]组织和6份正常组织），分别使用ARMS-qPCR、商业试剂盒和Sanger测序技术进行检测。在实验室条件下，ARMS-qPCR在准确性、灵敏度、重复性和特异性方面表现优异。在临床样本中，ARMS-qPCR检测出82.35%（28/34）的BRAF V600E突变和5.9%（2/34）的TERT C228T突变，而商业试剂盒的检测结果与之相当；Sanger测序分别检测出50%（17/34）的BRAF V600E突变和2.9%（1/34）的TERT C228T突变。同时，两种方法均未检测到TERT C250T突变。ARMS-qPCR方法显示出比Sanger测序更高的灵敏度，并具有快速周转时间（2-3小时）、成本效益高和适用范围广等优点。这些发现表明ARMS-qPCR是一种可靠、灵敏且高效的方法，适用于检测PTC中的BRAF和TERT启动子突变，为甲状腺癌的临床分子诊断和个性化治疗提供了重要依据。

1. 引言

甲状腺癌已成为中国十大常见癌症之一，对公众健康构成严重威胁，年均增长率高达14.51%[1]。从组织学上讲，甲状腺癌可分为乳头状甲状腺癌（PTC）、滤泡状甲状腺癌（FTC）、未分化甲状腺癌（ATC）和髓样甲状腺癌（MTC）[2–4]，这些类型均起源于滤泡上皮细胞。PTC是最常见的甲状腺癌类型，占所有甲状腺癌病例的90%以上，且发病率增长最为显著。该疾病通常局限于甲状腺，但可能转移到区域淋巴结。其发病机制复杂，与遗传因素、环境因素和激素变化密切相关[5, 6]。在甲状腺癌的发展过程中，涉及两条信号通路：丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和磷脂酰肌醇3-激酶及蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路[1]。这两条通路调控细胞增殖、分化和存活[1]。BRAF基因位于7号染色体上，BRAF V600E突变是在第600位氨基酸处将缬氨酸（V）替换为谷氨酸（E），该突变与高达51%的甲状腺癌发病率相关[5, 7–12]。端粒酶逆转录酶（TERT）位于5号染色体上，包含16个外显子，主要通过维持端粒长度来防止细胞衰老[13–16]。常见的热点突变有C228T和C250T，其中C228T在大多数癌症中更为普遍[17]。PTC中TERT启动子突变的发病率约为10%，FTC中为17%，低分化甲状腺癌（PDTC）/ATC中为40%[18]。最新研究表明，BRAF V600E和TERT启动子突变的共存与PTC的高风险临床和病理特征密切相关[3, 14, 18–21]。目前有多种技术可用于甲状腺癌的临床诊断，包括影像学检查、实验室检测和病理学评估，这些方法通常结合高分辨率超声、细针穿刺活检（FNAB）、放射性同位素扫描和组织病理学检查以及分子诊断[22]。然而，仍有约三分之一的甲状腺结节在细胞学检查中难以明确诊断，给内分泌科医生和病理学家带来挑战。尽管如此，组织病理学检查仍是诊断的金标准，但临床医生在准确评估肿瘤侵袭性和复发风险方面面临困难。分子变化先于组织学改变，因此分子技术在这一领域得到了广泛应用。针对BRAF V600E、TERT C228T和TERT C250T这三个热点突变的精确分子检测显著提高了恶性肿瘤的检出率，尤其是在Bethesda III–IV级结节中，诊断灵敏度从约70%提高到90%以上[23, 24]。此外，这些变异的高等位基因频率与肿瘤的侵袭性密切相关，为术前风险分层提供了关键信息。本研究选择福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织样本进行分析，因为它们能保持核酸完整性，并且在常规病理工作中易于获取；先前的研究也证明FFPE样本的BRAF V600E检出率与新鲜组织相当，从而确保了分子检测的高灵敏度和特异性[23, 24]。此外，该方法也可用于FNAB样本。然而，现有的分子技术（如Sanger测序、数字PCR（ddPCR）和下一代测序（NGS）在检测精度上存在差异[19]。Sanger测序虽然特异性高，但灵敏度较低，适用于已知突变的检测[25]；ddPCR适用于检测低丰度突变，但成本较高[26]；NGS由于基因序列复杂，需要优化实验设计以提高检测准确性[27]。传统的免疫组化（IHC）灵敏度很高，但结果可能受样本处理和抗体特异性的影响[27]。因此，迫切需要更有效的方法来提高突变检测的灵敏度。扩增抵抗突变系统-定量PCR（ARMS-qPCR）是一种高灵敏度和特异性的分子检测技术，能够准确区分突变基因和野生型基因，特别适合检测低丰度突变。与传统PCR相比，ARMS-qPCR更简单、更快、定量分析更准确且成本更低，已广泛应用于癌症和遗传性疾病的精准诊断和监测。本研究提出了结合等位基因特异性引物和TaqMan探针的ARMS-qPCR方法，实现了快速（2小时）、成本效益高和超灵敏的BRAF V600E及TERT C228T/C250T突变检测。此外，本研究还验证了ARMS-qPCR在存档FFPE甲状腺样本中的临床性能，特别是其在解决诊断不确定性和分层高风险PTC病例（同时存在BRAF/TERT突变）方面的潜力。通过克服传统方法的灵敏度限制，这种方法可以增强术前风险评估并指导甲状腺癌的个性化治疗策略。

2. 材料与方法

2.1. 患者与方法

共收集了来自定西市第二人民医院的40份FFPE组织样本，包括34例组织学确诊的PTC病例和6份相邻的正常甲状腺组织。所有受试者在参与研究前均签署了知情同意书。本研究遵循赫尔辛基宣言进行，方案获得了定西市第二人民医院伦理委员会的批准。基因组DNA使用TIANGEN Biotech公司的DP331石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取。PCR扩增使用MolTaq DNA聚合酶（Novozyme，P402）和ABI 7500及QuantStudio 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）进行。突变检测使用针对BRAF V600E、TERT C228T和C250T的等位基因特异性引物和TaqMan探针（Sangon Biotech）。参考标准包括BRAF V600E、TERT C228T和C250T突变gDNA（Kebai Biotechnology）。结果通过商业试剂盒（AmoyDx Diagnostics BRAF V600E Kit；Genetron Health TERT Promoter Kit）和Sanger测序进行验证。特异性对照包括合成质粒（V600R、TERT 228M和TERT 250M；Sangon Biotech）。整体工作流程详见图1。

2.2. ARMS-qPCR检测方法设计

设计引物和探针（表1）时使用了锁定核酸（LNA）修饰的引物以提高特异性。优化了三个独立的25 μL反应体系：BRAF V600E（1 μL MolTaq DNA聚合酶，2.5 μL 10×PCR缓冲液，1 μL dNTP混合液，1 μL BRAF V600E突变F/R引物（10 μM），1 μL探针（2 μM），0.5 μL内部参考F/R引物（10 μM），1 μL（2 μM），2 μL Mg2+，1 μL DNA）；TERT C228T/C250T（5 μL 5×PCR增强剂，1 μL MolTaq DNA聚合酶，2.5 μL 10×PCR缓冲液，1 μL dNTP混合液，2 μL TERT C228T/C250T突变F/R引物（10 μM），2 μL探针（2 μM），0.5 μL内部参考F/R引物（10 μM），1 μL（2 μM），2 μL Mg2+，2 μL DNA）。热循环条件为95°C 15分钟；15个循环（95°C/15秒，60°C/30秒）；30个循环（95°C/15秒，56°C/30秒，荧光采集）。

2.3. ARMS-qPCR检测方法

使用三个独立批次的试剂在认证的质量管理体系下严格评估了ARMS-qPCR的分析性能，系统评估了其分析准确性、灵敏度、重复性和特异性。准确性评估使用野生型gDNA（10 ng/μL）进行阴性一致性测试；阳性一致性使用掺入BRAF V600E、TERT C228T或C250T突变gDNA（等位基因频率分别为20%、12%和2%）的野生型gDNA进行测试。灵敏度通过两种方法检测：（1）在固定DNA浓度（10 ng/μL）下检测不同比例的突变等位基因（5%–0.5%）；（2）确定最低可检测DNA浓度（5–30 ng/μL），突变等位基因频率分别为1%（BRAF V600E/C250T）或0.5%（TERT C228T）。重复性通过分析三个独立批次试剂生产的混合样本（BRAF V600E：5%和2%在5 ng/μL野生型gDNA；TERT C228T：5%和1%在10 ng/μL野生型gDNA；TERT C250T：5%和2%在5 ng/μL野生型gDNA）的批内和批间精度来评估，变异系数（CV）基于20天的连续测试计算得出。特异性通过野生型gDNA（30 ng/μL）进行验证，交叉反应性使用编码BRAF V600R、TERT 228M和TERT 250M突变的质粒在野生型基因组DNA背景下进行评估。

2.4. 商业试剂盒检测

BRAF V600E突变使用AmoyDx Diagnostics BRAF V600E Kit检测和分析，TERT启动子变异C228T和C250T使用Genetron Health TERT Promoter Kit检测。所有程序和结果解释严格遵循相应产品手册。

2.5. Sanger测序

从FFPE组织中提取的DNA使用特异性引物（BRAF V600E：5′-CAG GAG TGC CAA GAG AAT ATC TGG-3′；TERT启动子区域：5′-CGT CCG GCA TTC GTG GTG-3′；5′-CCA CCA GCG CGC GGA AAG-3′）进行PCR扩增。扩增产物纯化后，使用Sangon Biotech（上海）的双向Sanger测序进行突变分析，引物为BRAF-F和TERT228/250-F。测序结果使用BioEdit Sequence Alignment Editor进行分析，并与参考序列（BRAF：NG_007873.3；TERT：NG_055467.1）比对，通过MEGA 7.0.26确认BRAF V600E和TERT启动子突变（C228T和C250T）。

3. 结果

3.1. 人口统计学和临床特征

本研究包括来自中国甘肃的40例患者，其中34例为PTC病例，6例为正常组织（表2）。PTC患者的平均年龄±标准差为52.6±10.1岁，年龄范围为25至76岁。大多数患者为女性（24例，占70.59%）。22例（64.71%）通过免疫组化确认诊断，特征性标志物（如CK19和半乳糖凝集素-3）与组织病理学结果一致。表2显示了研究受试者的人口统计学和临床特征。患者信息

性别：
年龄：
病理诊断：
免疫组化结果：

1. 女性，56岁，右侧甲状腺乳头状癌（PTC）；CK19阳性，HBME-1阴性，半乳糖凝集素-3阳性，Ki-67为5%，P53发生无义突变。
2. 女性，56岁，左侧PTC，直径1.0厘米。
3. 男性，50岁，左侧PTC，直径分别为1.0厘米和1.2厘米。
4. 男性，56岁，右侧PTC，直径3.5厘米。
5. 女性，50岁，左侧PTC，直径1.0厘米。
6. 女性，30岁，右侧PTC，直径2.2厘米；CK19阳性，TTF-1阳性，Tg阳性，Ki-67为5%。
7. 女性，68岁，左侧PTC直径1厘米和0.3厘米；右侧PTC直径1.2厘米；CK19阳性，半乳糖凝集素-3阳性，TTF-1阳性，Tg阳性，TPO阴性，CD56部分阳性，BRAF阳性（±），Ki-67为5%。
8. 女性，63岁，右侧PTC直径小于1厘米；Tg阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CK19阳性，半乳糖凝集素-3阳性，CD56阳性，BRAF阳性，Ki-67低于5%。
9. 男性，59岁，左侧PTC直径1.4厘米；Tg阳性，TPO阴性，TTF-1阳性，CK19阳性，半乳糖凝集素-3阳性，CD5阴性，CK7阳性，BRAF阴性，Ki-67低于5%。
10. 女性，66岁，左侧PTC大小为2×1.7×1.2厘米；CK19阳性，TTP-1阳性，CEA阴性，CeA阴性，CKP阳性，Ki-67阴性。
11. 男性，25岁，左侧PTC直径0.7厘米；TTF-1阳性，CK19阳性，Ki-67阴性，Tg阳性，CK7阳性，CK20阴性。
12. 女性，54岁，右侧PTC；Tg部分阳性，TPO阳性，TTP-1阳性，CK19阳性，半乳糖凝集素-3阳性，CD56阴性，CK7阳性，Ki-67低于10%。
13. 女性，40岁，甲状腺叶、峡部和中央淋巴结PTC，直径1厘米；CK19阳性，Tg阳性，TTF-1阳性，CgA阴性，CKL阳性，Ki-67阴性，半乳糖凝集素-3阳性，CD56阴性，CEA阴性。
14. 女性，48岁；左侧PTC直径0.5厘米；右侧PTC直径0.8厘米；左侧CK19阳性，Tg阳性，TTF-1阳性，TPO阴性，半乳糖凝集素-3阳性，BRAF阳性，CK7阳性，CK20阴性，Ki-67低于2%。
15. 女性，51岁，经典型PTC；CK19阳性，半乳糖凝集素-3阳性，HBME-1阳性，CD56阴性，P53阴性，BRAF阴性；V600E阳性，TROP2阳性（3+，90%），Ki-67为10%以上。
16. 女性，54岁，经典型PTC；CK19阳性，半乳糖凝集素-3阳性，HBME-1阳性，CD56阴性，p53阴性，Ki-67为5%以上。
17. 男性，49岁，经典型PTC；CK19阳性，半乳糖凝集素-3阳性，HBME-1阳性，CD56阴性，p53阴性，Ki-67为5%以上。
18. 男性，54岁，经典型PTC。
19. 女性，53岁，经典型PTC；CK19阳性，HBME阳性，CD56阴性，TTF-1阳性。
20. 女性，76岁，经典型PTC。
21. 女性，经典型PTC。
22. 女性，49岁，经典型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CD56阴性，CgA阳性，Syn阳性，Ki-67为10%以上。
23. 女性，50岁，经典型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CD56阴性，CgA阳性，Syn阳性，Ki-67为5%以上。
24. 女性，59岁，经典型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CD56阴性，CgA阳性，Syn阳性，Ki-67为5%以上。
25. 女性，52岁，经典型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CD56阴性，CgA阴性，Syn阳性，Ki-67为10%以上。
26. 男性，56岁，经典型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CD56阴性，CgA阴性，Syn阴性，Ki-67为5%以上。
27. 女性，58岁，经典型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CD56阴性，CgA阳性，Syn阳性，Ki-67为5%以上。
28. 女性，41岁，经典型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，CD56阴性，CgA阴性，Syn阴性，Ki-67为5%以上。
29. 女性，57岁，乳头状甲状腺微癌。
30. 男性，57岁，经典型PTC。
31. 女性，46岁，经典型PTC。
32. 女性，37岁，经典型PTC。
33. 男性，60岁，经典型PTC。
34. 女性，56岁，滤泡型PTC；Tg阳性，CK20阴性，CK19阳性，TPO阳性，TTF-1阳性，BRAF阳性，Ki-67为5%以上。

3.2. 分析准确性验证
使用阴性样本和三种突变等位基因频率的阳性样本，对ARMS-qPCR检测方法的分析准确性进行了验证。结果显示，在BRAF V600E、TERT C228T和C250T检测系统中，野生型gDNA（10 ng/μL）的阴性一致性为100%（0/20个阴性样本）。对于所有三个目标，当突变等位基因频率分别为20%、12%和2%时，阳性一致性也为100%（20/20个阳性样本）。阴性和阳性检测均显示出良好的准确性。

3.3. 分析灵敏度验证
BRAF V600E检测方法能够可靠地检测稀释DNA中的低频突变等位基因。将野生型基因组DNA（10 ng/μL）与BRAF V600E突变DNA以5%、2%和0.5%的比例混合，每种混合物在20个独立重复样本中进行检测，检测率均≥95%，证实即使在总DNA量为10 ng的情况下也能可靠检测到突变。保持突变比例为1%不变，将总DNA输入量分别调整为30 ng、20 ng和5 ng/μL，所有四个输入水平下的检测率均≥95%，表明即使只有5 ng的DNA也能一致识别出1%的BRAF V600E突变等位基因。TERT C228T检测方法的表现也相当：在10 ng/μL的野生型DNA中，5%、2%和0.5%的突变等位基因比例在20个重复样本中的检测率均≥95%，确定了10 ng输入量的检测限为0.5%。将突变比例固定为0.5%，并将DNA输入量调整为30 ng、20 ng和5 ng/μL时，检测率同样达到≥95%，证实了在最低输入量（10 ng）下的稳定检测能力。

3.4. 分析重复性验证
为了评估多重检测系统的稳健性，在20天期间使用三个独立的试剂批次严格评估了检测间的和检测内的精度。分析包括了临床相关范围内的突变等位基因频率：高浓度（5%）和低浓度（1%–2%）的合成样本，针对BRAF V600E、TERT C228T和TERT C250T突变。所有突变在所有测试条件下的重复样本中均显示出100%的一致性。值得注意的是，BRAF V600E和TERT C250T在5%和2%的等位基因频率下均显示出100%的检测率。此外，还量化了循环阈值（Ct）的变异性，其中BRAF V600E的Ct≤30，TERT C228T的ΔCt≤13，TERT C250T的ΔCt≤14。对于批次间的精度，两个平台均显示出可接受的精度（BRAF V600E的CV≤15.0%，TERT C228T和TERT C250T的ΔCt CV≤15.0%）。在ABI 7500平台上，BRAF V600E检测方法的平均值为20.17（操作员1）和20.33（操作员2），CV分别为3.14%和3.49%；对于TERT启动子突变，C228T检测方法的平均ΔCt值为6.82（操作员1）和6.80（操作员2），相应的ΔCt CV分别为8.96%和9.19%。同样，C250T检测方法的平均ΔCt值为7.70和7.62，ΔCt CV分别为10.40%和10.78%。相比之下，Q5平台在TERT检测方法中显示出略高的变异性。BRAF V600E检测方法保持了相当的精度，平均值为19.82（操作员1）和19.90（操作员2），CV低于2.72%；然而，TERT C228T检测方法的ΔCt CV在5.68（操作员1）和5.82（操作员2）时有所增加。TERT C250T检测方法在30 ng、20 ng和5 ng/μL的输入量下也显示出≥95%的检测率，即使在5 ng的DNA输入量下也能可靠地检测到1%的突变频率。总之，这些验证表明这些检测方法是识别低丰度样本中临床可操作突变的强大工具。

3.4. 分析重复性验证
为了评估多重检测系统的稳健性，使用三个独立的试剂批次在20天期间严格评估了检测间的和检测内的精度。分析包括了临床相关范围内的突变等位基因频率：高浓度（5%）和低浓度（1%–2%）的合成样本，针对BRAF V600E、TERT C228T和TERT C250T突变。所有突变在所有测试条件下的重复样本中均显示出100%的一致性。值得注意的是，BRAF V600E和TERT C250T在5%和2%的等位基因频率下均显示出100%的检测率。TERT C228T启动子突变在5%和1%的等位基因频率下也显示出100%的敏感性。此外，还量化了高浓度样本的循环阈值（Ct）变异性（CV），其中BRAF V600E的Ct≤30，TERT C228T的ΔCt≤13，TERT C250T的ΔCt≤14。对于批次间的精度，两个平台均显示出可接受的精度（BRAF V600E的CV≤15.0%，TERT C228T和TERT C250T的ΔCt CV≤15.0%）。在ABI 7500平台上，BRAF V600E检测方法的平均值为20.17（操作员1）和20.33（操作员2），CV分别为3.14%和3.49%；对于TERT启动子突变，C228T检测方法的平均ΔCt值为6.82（操作员1）和6.80（操作员2），相应的ΔCt CV分别为8.96%和9.19%。同样，C250T检测方法的平均ΔCt值为7.70和7.62，ΔCt CV分别为10.40%和10.78%。相比之下，Q5平台在TERT检测方法中显示出稍高的变异性。BRAF V600E检测方法保持了相当的精度，平均值为19.82（操作员1）和19.90（操作员2），CV低于2.72%；然而，TERT C228T检测方法的ΔCt CV在5.68（操作员1）和5.82（操作员2）时有所增加。TERT C250T检测方法的平均ΔCt值为6.41–6.50，ΔCt CV在12.46%至13.28%之间。同时，三个连续批次的检测内精度在表4中进行了总结。在ABI 7500平台上，BRAF V600E的CV范围为2.95%至3.67%，而TERT检测方法的CV范围为4.32%至10.92%；批次间的一致性得到保持，所有CV均低于15%。Q5平台在BRAF V600E方面实现了稳健的重复性（CV：1.88%–3.31%），而TERT检测方法的变异性适中升高。C228T和C250T检测方法的ΔCt CV在6.76%–13.76%之间，操作员间没有显著差异。因此，两个平台均满足了预定义的精度标准（CV≤15%），并显示出相当的稳健性，适合常规临床使用。

3.5. 分析特异性验证
在野生型gDNA（30 ng/μL）中未观察到交叉反应性，所有目标均显示阴性信号（0/20个阴性样本）。为了进一步验证检测方法的特异性，同时分析了同源突变变体（例如BRAF V600R、TERT 228M和TERT 250M）。这些变体在其各自的检测通道中均未产生可检测的扩增信号。这些发现共同证实了在测试条件下不存在交叉反应性或非特异性扩增。

3.6. 临床样本中的检测
我们建立的ARMS-qPCR检测方法在40份FFPE处理的甲状腺样本（34例PTC和6份正常组织）中显示出对低丰度突变的优异敏感性。在PTC中，82.35%（28/34）检测到BRAF V600E突变；在TERT C228T变体中，5.9%（2/34）的样本中检测到这些变体。值得注意的是，没有任何样本中检测到TERT C250T突变，所有正常组织对这三个目标的检测结果均为阴性（0/6）。该检测方法与国家药品监督管理局（NMPA）批准的诊断试剂盒（AmoyDx/Genetron Health）的结果一致。此外，Sanger测序的检测能力明显较低，在34例突变阳性PTC中仅检测到50%（17/34）的BRAF V600E突变，在2.9%（1/34）的样本中检测到TERT C228T突变，未能检测到任何TERT C250T突变（0/34），尽管在正常对照中保持了100%的特异性。这种性能差异在TERT启动子突变中尤为明显，其中突变等位基因频率（VAFs）始终低于Sanger经验验证的15%–20%的检测阈值。图2展示了ARMS-qPCR、Sanger测序、商业试剂盒和PTC的H&E染色结果，H&E染色的显微切片显示了明确的肿瘤特征，包括核异型性（增大的嗜色核和不规则的核轮廓）以及结构紊乱，这些都是癌变的典型特征。所有结果强调了ARMS-qPCR在甲状腺恶性肿瘤分子分层中的增强诊断效用，特别是在FFPE衍生的DNA中，因为片段化和肿瘤纯度低常常会损害传统的测序方法。

4. 讨论
近年来，分子生物学技术的进步显著推动了甲状腺癌分子研究的发展。特别是BRAF V600E和TERT启动子突变与甲状腺癌的复发、死亡率和预后密切相关，使其成为甲状腺癌研究的热点[10]。BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌（PTC）中非常普遍（突变率超过80%），并且与不良预后密切相关，因此成为甲状腺癌研究的重要焦点[28–30]。TERT启动子突变在PTC中的发生率较低（1.1%–4.7%），但这些突变与甲状腺癌的侵袭性和复发风险显著相关，尤其是在晚期和高度侵袭性的病例中[30]。此外，BRAF V600E和TERT启动子突变的共存通常预示着更差的预后[31–33]。对这些分子标志物的研究不仅为甲状腺癌的诊断提供了新的视角，也为优化临床管理和治疗策略提供了重要参考[34]。本研究的创新之处在于开发了一种高度特异且低输入量的ARMS-qPCR检测方法，用于检测BRAF V600E、TERT C228T和C250T三种突变。使用仅5 ng的基因组DNA，该方法对BRAF V600E和TERT C250T的检测灵敏度达到≥95%，检测限（LOD）为1%。对于TERT C228T，10 ng的DNA即可达到0.5%的LOD（约15-20个突变拷贝）。与之前报道的ARMS-qPCR方法相比，后者通常需要5–10 ng的DNA才能达到0.5%–1%的LOD[35, 36]，并且大多数ARMS-qPCR方法由于启动子区域富含GC而报告的检测阈值为-10%[37]，我们的方法在所需样本量上显著减少的同时提供了相当或更高的灵敏度。在临床验证中，我们测试了来自甘肃的40份FFPE甲状腺标本（34份PTC和6份正常），与两种NMPA批准的商用试剂盒——AmoyDx Thyroid Panel（LOD = 1% VAF，≥10 ng DNA）和Genetron Health ThyroSeq（LOD = 1% VAF，≥10 ng DNA）的结果一致率为100%。在同一组样本中，BRAF V600E的检出率为82.35%（28/34），明显高于Sanger测序的50%（17/34），而TERT C228T的检出率可低至0.5%的VAF，解决了低质量样本中低频突变检测的问题。这是首次对甘肃FFPE甲状腺组织进行的三目标ARMS-qPCR系统评估，证明了该方法在成本、灵敏度和操作简便性方面的优势，其性能可与商用试剂盒媲美，并优于传统的Sanger测序，同时也为地区医院提供了一种可行的分子诊断解决方案。与目前主流的突变检测方法相比，我们建立的ARMS-qPCR在灵敏度、周转时间、成本和操作简便性方面具有明显优势。对于BRAF V600E和TERT C250T，当VAF为1%时，该方法的表现优于传统Sanger测序；对于TERT C228T，其检出率可低至0.5%。与NGS（LOD 0.1%–1%）相比，后者需要大量的文库制备和测序时间[39]，而ddPCR（LOD低于0.1%）虽然检测限较低，但仪器和试剂成本较高[26, 40]，我们的方法在样本需求上大幅减少。在周转时间方面，ARMS-qPCR可在几小时内完成整个流程；Sanger测序通常需要2-3天，NGS需要5–10个工作日，尽管ddPCR也可以在3–5小时内完成，但其预分析步骤更为繁琐。从成本角度来看，ARMS-qPCR的试剂费用适中，每样本成本较低，适合中等通量的常规实验室；Sanger测序的成本仅适用于小批量样本，并且随着多基因检测板的增加而迅速上升，而NGS和ddPCR由于昂贵的设备和消耗品导致总体成本较高。综合考虑这些因素，ARMS-qPCR成为检测这些特定突变的首选方法，能够快速且经济地提供可靠的结果，从而显著提升地区和基层医疗机构的分子诊断能力。本研究使用了FFPE手术切除标本，因为FFPE能够保留完整的肿瘤结构并产生足够的高质量DNA/RNA，这对于检测低频突变至关重要；此外，FFPE被认为是基于组织的病理学的金标准，能够真实反映肿瘤的体内生物学状态，并为将分子改变与侵袭性和长期预后相关联提供可靠的基础[41, 42]。相比之下，FNAB标本主要用于术前诊断，具有操作简便、侵入性小、成本低以及可在局部麻醉下快速获取细胞材料的优势，广泛应用于区分良性与恶性甲状腺、乳腺及其他可疑病变[43, 44]。然而，FNA的细胞产量有限可能导致样本不足或假阴性结果。因此，我们首先对FFPE切除标本进行了方法学验证，以确保该方法符合临床应用所需的严格性能标准。未来可以将该方法扩展到FNAB样本的研究中。通过分析甲状腺癌患者和正常组织石蜡包埋样本中的BRAF V600E、TERT C228T和TERT C250T突变，并将结果与Sanger测序进行比较，我们发现ARMS-qPCR的检出率显著高于Sanger测序，分别为82.35% vs 50%和5.9% vs 0%。2013年，Huang等人建立了一种ARMS-qPCR方法，在33名PTC患者中的67%和12名具有高细胞变异的PTC患者中的75%检测到了V600E突变；而Sanger测序仅检测到了ARMS-qPCR发现的30个突变中的27个[25]。2022年，Lu等人使用ddPCR和Sanger测序分析了119名PTC患者的BRAF V600E突变，检出率分别为67.23%和26.05%。与ddPCR和Sanger测序相比，本研究建立的ARMS-qPCR方法在BRAF V600E突变的检出率上更高，增强了其在临床应用中的广泛适用性。此外，在34名PTC患者中，ARMS-qPCR检测到了28个BRAF V600E突变和2个TERT C228T突变，而Sanger测序未能检测到17个BRAF V600E突变和1个TERT C228T突变。此外，检测结果表明，当ARMS-qPCR检测到BRAF V600E突变时，较低的Ct值（约Ct 17）对应较高的突变DNA含量，使得Sanger测序能够成功检测到该突变；相反，当ARMS-qPCR检测到较高的Ct值（对于BRAF V600E）或ΔCt值（对于TERT C228T和C250T突变）时，低突变DNA含量低于测序的检测限，导致Sanger测序无法检测到这些突变。因此，当DNA的质量和数量较低时，ARMS-qPCR能够最大化可分析样本的数量，提高检测的灵敏度和速度[35]。然而，该方法也存在一些局限性。临床应用涉及的样本量相对较小，仅包括PTC患者和正常组织的石蜡包埋样本。未来的研究应扩大样本量，包括更多不同类型甲状腺癌和其他相关疾病的患者，并考虑种族和地理等因素，以全面评估ARMS-qPCR在各种临床场景中的性能[45]。未来，我们还计划进行一项大规模、前瞻性的多中心验证研究，招募≥200例患者，以全面评估ARMS-qPCR在不同人群和临床环境中的性能。此外，尽管该技术表现出高灵敏度，但其特异性尚未得到充分研究。需要进一步验证以确认其在复杂临床样本中的检测准确性，排除潜在的假阳性或假阴性结果，并特别关注不同人群背景下的检测特异性。总体而言，BRAF V600E和TERT启动子突变在PTC中的协同效应不仅与肿瘤的侵袭性和复发率密切相关，还可能影响患者的治疗反应[46]。因此，在临床实践中，检测和分析这两种突变对于PTC患者的预后和治疗决策具有重要意义[47]。此外，阐明BRAF V600E突变和TERT启动子突变如何促进癌变，以及如何利用这些改变进行诊断和治疗，对研究人员和临床医生都非常重要。

5. 结论
总之，ARMS-qPCR方法是一种灵敏、特异且可重复的工具，适用于检测FFPE样本中的BRAF和TERT启动子突变，在需要检测低丰度突变的临床场景中优于Sanger测序。将其整合到常规诊断中可以改善甲状腺癌及其他疾病的靶向治疗患者的分层。作者贡献
Jia Yuanyuan和Gao Min构思并设计了实验。Sun Dandan、Yang Jiabao和Zhou Mengshi进行了实验并分析了数据。Sun Dandan和Jia Yuanyuan撰写了原始手稿。Zhang Yajun提供了临床样本。Gao Min和Li Rui审阅并编辑了手稿。Jia Yuanyuan和Zhang Yajun提供了技术指导。Gao Min和Li Rui进行了监督。致谢
作者感谢所有参与本研究的人员。资助
本研究由西安科技计划项目“重点产业链关键技术研究项目”（2023JH-ZCGJ-0071）资助。利益冲突
作者声明没有利益冲突。数据可用性声明
数据可向作者索取。