COL1A1+ 上皮细胞通过单细胞分析揭示了在子宫内膜炎中 VEGFA-VEGFR 信号通路的作用机制

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：COL1A1+ Epithelial Cells Orchestrate VEGFA-VEGFR Signaling in Endometritis Revealed by Single-Cell Analysis

## 摘要

### 背景
子宫内膜炎与不良生殖结局相关，但在疾病发生和持续过程中上皮细胞的程序机制仍不清楚。我们的目标是通过单细胞分析系统地定义与炎症相关的上皮细胞状态及其调控机制。

### 方法
我们使用Seurat处理来自Gene Expression Omnibus (GEO)的单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 数据。经过质量控制后，数据通过SCTransform进行标准化，并使用Harmony包进行批量校正。根据典型标记物对细胞类型进行注释。通过差异表达分析来识别在子宫内膜炎中发生改变的基因。然后使用Monocle2对上皮细胞进行亚群划分和轨迹推断。利用CellChat推断细胞间通讯，并使用SCENIC和AUCell方法评估转录调控子活性。

### 结果
共有153,877个细胞形成了14个簇，其中子宫内膜炎中的上皮细胞比例较低。上皮细胞包含四个亚群（SPDEF+、MT1H+、有纤毛的细胞和COL1A1+），其中SPDEF+和COL1A1+在疾病过程中有所扩展。上调的上皮细胞基因富集在核糖体、抗原处理/呈递和雌激素相关通路中。伪时间图显示出一个连续的轨迹分裂为两个命运：一个与铁死亡和矿物质吸收相关，另一个与核糖体和抗原呈递相关。子宫内膜炎中的细胞间通讯网络更密集，COL1A1+上皮细胞作为枢纽，VEGFA–VEGFR信号通路增强。

### 结论
这个以上皮细胞为中心的单细胞图谱描绘了子宫内膜炎中的疾病相关状态、命运决定、信号轴和调控程序。数据支持一个模型，即上皮细胞命运重塑与血管生成信号传导和AP-1驱动的转录有关，并提出了可验证的靶点以进行机制验证和潜在的临床应用。

## 缩写词
ANOVA：方差分析
AP-1：激活蛋白-1
AUCell：基于恢复曲线下的调节子活性评分（SCENIC模块）
BH：Benjamini–Hochberg
CD138：用于CE病理学的浆细胞标记物
CellChat：细胞间通讯推断工具包
DDRTree：基于树的判别维度降低（Monocle2方法）
DEGs：差异表达基因
ECM：细胞外基质
EpC：上皮细胞
EVs：细胞外囊泡
FDR：假发现率
GEO：基因表达组
GO：基因本体
IFN-γ：干扰素-γ
JUN/FOS：AP-1家族成员
KEGG：京都基因与基因组百科全书
k-NN：k最近邻
MHC-II：主要组织相容性复合体II类
Monocle2：单细胞轨迹推断工具包
NK/T：自然杀伤/T细胞
PCA：主成分分析
QC：质量控制
RIF：反复植入失败
SCENIC：单细胞调控网络推断和聚类
scRNA-seq：单细胞RNA测序
Seurat：单细胞分析框架
TFs：转录因子
t-SNE：t分布随机邻居嵌入
UMAP：均匀流形近似和投影
UMI：唯一分子标识符
VEGF：血管内皮生长因子
VEGFA：VEGF-A
VEGFR：血管内皮生长因子受体

## 1 引言
子宫内膜炎是一种常见但未被充分认识的妇科炎症性疾病，可能表现为急性或慢性过程[1]；慢性子宫内膜炎（CE）与不孕、反复植入失败（RIF）和反复流产密切相关，并对辅助生殖周期中的胚胎着床和妊娠维持产生不利影响[2]。其潜在机制涉及多因素失调，包括胚胎-母体界面免疫耐受性的受损以及黏膜环境和血管供应的异常重塑[3, 4]。临床上，CE的诊断结合了症状、影像学检查、宫腔镜发现和组织病理学，其中通过CD138免疫组化广泛确认基质浆细胞[5, 6]；然而，不同中心在采样、阈值定义和读数一致性方面存在差异，导致敏感性和特异性不一致[7]。尽管实践中常用抗生素治疗，但由于病原体谱复杂、抗菌药物耐药性和疾病复发，治疗效果仍不确定；最近的临床研究表明，“轻度”CE患者的妊娠结局改善并不均匀，这强调了通过治愈测试重新评估治疗效果的重要性[8, 9]。总体而言，这种临床异质性和诊断-治疗的不确定性凸显了在细胞和分子水平上重建疾病机制的必要性，特别是关注上皮细胞——这种具有屏障、分泌和界面调节功能的细胞——以解释疾病的发生、持续和复发，并为精准分层和靶向干预提供依据[10-12]。在健康的月经周期中，子宫内膜上皮经历了由系统性激素和局部信号严格调控的结构和功能重塑：纤毛细胞和分泌细胞的比例动态变化决定了腔内流动和分泌特征；糖萼和黏液形成第一道防线；离子通道和转运蛋白维持物理化学环境；紧密连接、黏附连接和桥粒与细胞骨架的结合保持了屏障完整性和选择性通透性[13-15]。在炎症或感染条件下，这些机制会在多个节点受到干扰：屏障破坏和通透性增加促进了危险信号和病原体相关信号的传递；上皮细胞受体和分泌特征被重置，改变了对无菌和病原体刺激的反应阈值，并重新连接了与免疫细胞的共刺激/共抑制回路；与基质和细胞外基质的粘附信号耦合的变化可以重新编程上皮细胞的形态和运动性，进而放大或延长炎症[16]。因此，一种以上皮细胞为中心的系统视角，整合了细胞状态、细胞间通讯和上游调控程序，不仅有助于解释症状的持续性和治疗反应的差异性，还指出了可操作的节点和可转化的生物标志物。传统的组织学、免疫染色和批量转录组学提供了重要线索，但未能解析罕见或短暂的上皮细胞状态，也无法系统地量化跨细胞类型的相互作用和上游调控架构[17]。最近对健康或生理子宫内膜的单细胞研究已经绘制了细胞组成和动态图谱，并建立了高分辨率的人类子宫内膜参考图谱和可视化资源[18]；然而，在子宫内膜炎中系统的以上皮细胞为中心的单细胞分析仍较为有限，特别是那些将细胞状态与配体-受体通讯和转录调控整合在一起的研究[19]。为解决这一差距，我们提倡一种统一的分析流程，结合单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 来定义细胞类型和状态，通过轨迹/伪时间建模来描绘状态转换，并推断细胞间通讯，同时重建基因调控网络；同时需要严格的质量控制、批量校正和样本间整合以提高可靠性和重现性[20-22]。基于临床需求和方法学进展，本研究构建了一个子宫内膜炎的单细胞上皮图谱，从多个互补的角度剖析了疾病相关的上皮重塑。该项目设计的四个层次包括：在单细胞分辨率下表征与炎症相关的上皮细胞状态，为后续分析提供基础；表征这些上皮亚群与免疫、血管和基质细胞群的通讯轴，以及这些细胞群如何维持或放大炎症；利用SCENIC等工具发现驱动状态和通讯变化的上游转录调节因子，将描述性的细胞状态转化为潜在的致病因素；以及为社区提供开放的分析工作和数据，以测试和转化生成的假设。这四个层次——状态、信号、调节因子和资源——形成了一个从观察到的结果到干预措施的一致性框架，有助于子宫内膜炎的机制解析和精准治疗。

## 2 材料与方法
### 2.1 数据来源
数据来源于Gene Expression Omnibus (GEO) [23]，访问号GSE223639，包括七个正常子宫内膜和七个子宫内膜炎样本，用于后续分析。

### 2.2 数据预处理
对于GEO访问号GSE223639下的scRNA-seq数据集，我们实施了一套标准的工作流程进行质量控制和分析。如果一个基因在≥3个细胞中被检测到，则保留该基因，并且要求这些细胞表达≥200个基因。在细胞层面，我们保留高质量的数据，其中nCount_RNA ≤ 100,000且percent.mt < 15%。数据经过SCTransform标准化和方差稳定后，使用RunPCA计算主成分。应用Harmony去除样本间的批量效应，其中样本来源被指定为批量变量[24]。Harmony的使用参数为lambda值为0.5，最大迭代次数为50次。我们构建了k-NN图，并使用FindNeighbors/FindClusters进行亚群检测；使用前20个主成分进行UMAP可视化。最后，通过匹配CellMarker 2.0数据库中整理的典型标记物来分配细胞身份。

### 2.3 差异表达分析
使用Seurat包中的FindMarkers对标准化/整合的数据集进行了子宫内膜炎和正常组之间的差异表达分析[25]。除非另有说明，我们应用双侧Wilcoxon秩和检验，并进行Benjamini–Hochberg校正以控制多重检验（调整后的p值报告为p_val_adj）。如果|avg_logFC| > 0.25且p_val_adj < 0.05，则认为基因差异表达。

### 2.4 构建单细胞伪时间轨迹
使用Monocle2 [20]对上皮细胞亚群进行了伪时间分析。从标准化/整合的对象中提取原始UMI计数和相关表型元数据（组：子宫内膜炎 vs. 正常），以初始化CellDataSet（UMI数据使用负二项分布），然后进行estimateSizeFactors和estimateDispersions。为了减少噪声，我们保留了在≥10个细胞中被检测到的基因。组标签存储在phenoData中，并应用differentialGeneTest比较子宫内膜炎和正常组；基于多重检验调整后的q值，显著相关的基因被指定为排序基因。使用reduceDimension（方法="DDRTree"，max_components=2）进行维度降低，然后使用orderCells沿伪时间排列细胞。为了确定轨迹方向，将正常细胞富集的分支指定为根状态，从中计算伪时间。

### 2.5 SCENIC分析
我们应用SCENIC工作流程来推断上皮细胞中的转录调控网络并量化调节子活性[26]。首先从表达矩阵中提取转录因子（TFs）及其共表达基因，然后使用GENIE3推断加权TF-靶标关联。随后使用RcisTarget通过模体富集和基因组邻近性剪枝候选边缘，得到高置信度的调节子。接着，AUCell计算每个细胞的调节子活性评分（基于表达排名的恢复曲线下的面积），并进行标准化以用于可视化和组间比较；适当情况下，使用AUCell得到的阈值将调节子活性二值化为“开启/关闭”状态。

### 2.6 统计分析
所有检验均为双侧检验，并使用Benjamini–Hochberg FDR控制（α = 0.05）。连续数据：使用Shapiro–Wilk检验进行正态性检验，然后使用Welch's t检验或Wilcoxon检验；多组数据：使用单因素ANOVA（必要时使用Welch检验）或Kruskal–Wallis检验，并进行FDR控制的后续检验。分类数据：使用χ2或Fisher's精确检验；相关性：使用Spearman's ρ检验，并进行FDR校正。分析在R中进行，随机种子固定。

## 3 结果
### 3.1 子宫内膜炎的单细胞图谱
我们整合了GSE223639中的七个正常子宫内膜和七个子宫内膜炎样本的scRNA-seq数据。经过严格的质量控制、标准化、维度降低和聚类后，剩余了153,877个高质量细胞，形成了14个簇（图1A）。使用典型标记物面板对簇进行注释，识别出七个主要细胞类型：NK/T细胞、间充质细胞、上皮细胞、髓系细胞、肥大细胞、内皮细胞和红细胞（图1B–C）。每个样本的细胞组成在图1D中总结。比较组成分析显示，与对照组相比，子宫内膜炎中的上皮细胞比例较低，这与炎症条件下的上皮细胞减少/重塑一致（图1D）。

### 3.2 识别子宫内膜炎中差异表达的上皮相关基因（DEGs）
使用Seurat/FindMarkers在标准化/整合的数据集上进行了子宫内膜炎和正常组之间的差异表达分析，显著性定义为p_val_adj < 0.05（Benjamini–Hochberg）和|avg_logFC| > 0.25（图2A–B）。上皮细胞和肥大细胞表现出最多的DEGs，表明这些细胞群中的转录重塑最为显著。上调的上皮基因的功能富集显示核糖体、抗原处理和呈递以及雌激素信号通路等术语的显著过度表达（图2C–D）。总体而言，这些发现突出了子宫内膜炎中的上皮细胞转录重编程，并指出了后续机制研究的可验证通路。

### 3.3 上皮细胞异质性
为了解析上皮细胞层面的变化，我们从子宫内膜炎和正常组中提取上皮细胞进行维度降低和重新聚类（t-SNE；图3A）。使用群特异性标记物特征，我们注释了四个上皮亚群：SPDEF+ EpC、MT1H+ EpC、有纤毛的EpC和COL1A1+ EpC（图3B）。组成比较显示，子宫内膜炎中SPDEF+ EpC和COL1A1+ EpC的比例增加（图3C），表明这些亚群在与疾病相关的分泌/分化相关和基质相关的上皮状态中发生了重新分布和激活。基因本体论—在亚群特异性标记物上的生物过程富集（图3D–G）显示，COL1A1+ EpC标记物显著富集于“细胞外基质组织”、“细胞外结构组织”和“上皮细胞增殖”。这些模式表明在炎症环境中存在上皮ECM重塑和增殖重编程，为子宫内膜炎的组织修复或病理重塑提供了可测试的机制假设。

图3

上皮异质性。（A）标注的上皮亚群的t-SNE。（B）亚群特异性标记基因（SPDEF、MT1H、FOXJ1、COL1A1）的Violin图。（C）子宫内膜炎与正常组织中上皮亚群的比例组成。（D）SPDEF+ EpC标记物的GO–生物过程富集。（E）MT1H+ EpC标记物的GO–生物过程富集。（F）有纤毛的上皮EpC标记物的GO–生物过程富集。（G）COL1A1+ EpC标记物的GO–生物过程富集。

3.4 伪时间分析

为了描绘子宫内膜炎中的动态上皮转变，我们使用Monocle2推断轨迹并进行了伪时间分析。上皮细胞沿着一个连续的轨迹发展，并在终端阶段分为两个显著的分支（图4A–C）。富含正常细胞的分支被指定为根节点，从而能够从假定的健康状态向疾病相关状态进行时间表征。分支和命运分析表明有两个不同的终端结果（图4D）。分支1在Ferroptosis通路中富集，伴随谷胱甘肽代谢和矿物质吸收的激活，这与铁依赖性的脂质过氧化应激和代谢重编程一致。分支2在核糖体和抗原处理及呈递通路中富集，表明蛋白质合成和免疫呈递功能增强。这些结果共同描绘了在炎症条件下的连续到分支的上皮转变，并提出了可测试的机制路径以供后续研究。

图4

上皮伪时间轨迹。（A–C）按组（子宫内膜炎/正常）、伪时间和上皮亚群着色的单细胞轨迹。（D）具有相应KEGG通路富集分析的分支特异性DEGs的热图。

3.5 细胞-细胞通信

为了描绘跨谱系的信号传导，我们使用CellChat比较了子宫内膜炎和正常组织之间的配体-受体网络。在全球层面上，子宫内膜炎中的相互作用数量和整体网络强度更高，表明在炎症条件下细胞间信号传导增强。跨通路的信息流排名显示了群体偏向的信号传导：用红色标记的通路在子宫内膜炎中富集，而用绿色标记的通路在正常组织中富集（图5A）。在细胞类型分辨率上，COL1A1+ EpC表现出扩大的传入/传出通信，并在多个通路中占据枢纽位置（图5B）。配体-受体比较进一步显示了VEGFA–VEGFR1/2和VEGFA–VEGFR2轴在疾病网络中的选择性增强（图5C–D），暗示了血管生成信号在病理微环境重塑中的作用。总之，这些发现表明子宫内膜炎中的通信更加密集且选择性激活，并提出了可测试的路径和潜在的干预点以供后续研究。

图5

细胞-细胞通信。（A）子宫内膜炎与正常组织之间相互作用计数和通路信息流的比较。（B）以COL1A1+ EpC为中心的通信网络。（C）配体-受体点图：COL1A1+ EpC与其他细胞类型之间的相互作用。（D）配体-受体点图：其他细胞类型与COL1A1+ EpC之间的相互作用。

3.6 调节COL1A1+ EpC的转录因子

为了识别COL1A1+上皮细胞（EpC）中的关键调节因子，我们应用SCENIC管道推断调控子并使用AUCell量化每个细胞的活性。分组比较显示子宫内膜炎中的调控子活性高于对照组（箱形图，图6A），表明在疾病条件下广泛的转录上调。然后我们对图6A中突出显示的最具有区分性的调控子的目标进行了通路富集；值得注意的是，JUN-和FOS相关调控子的目标在KEGG通路中显著富集（图6B–C），涵盖炎症信号传导、上皮重塑和相关过程。这些发现共同表明AP-1家族因子（JUN/FOS）可能是COL1A1+ EpC中疾病相关程序的潜在调节因子，从而提出了进行机制验证和治疗探索的候选者。

图6

调控子活性和通路富集。（A）子宫内膜炎与正常组织中COL1A1+ EpC的转录因子AUCell分数的箱形图。（B）JUN相关调控子目标的KEGG富集点图。（C）FOS相关调控子目标的KEGG富集点图。统计显著性如下表示：****p<0.0001。

4 讨论

传统观点认为子宫内膜上皮是一个相对均质的屏障层，然而单细胞分辨率提供了一个重新审视这一假设的机会[10]。子宫内膜增生（CE）与不孕症、复发性流产密切相关，但其发病机制和分子途径的统一模型仍不清楚。在这项研究中，我们利用单细胞技术识别出一个表现出类似上皮-间充质转变特征的COL1A1+上皮亚群。此外，我们观察到在伪时间轨迹的终端处上皮细胞的功能分化。在细胞间通信网络中，COL1A1+上皮细胞占据关键位置，并沿着VEGFA–VEGFR轴增强了信号传导。在转录调控水平上，AP-1相关的程序被激活。这些证据表明“上皮命运-血管通路-调节网络”中的不平衡，为CE的连续机制提供了细胞层面的解释框架[27, 28]。因此，单细胞分辨率并没有推翻现有理论，而是通过一个以前被忽视的细胞状态补充了当前的病理模型，从而改进了我们对炎症条件下组织重塑的理解。伪时间分析显示子宫内膜上皮细胞沿着一个连续轨迹向两个功能终点分化。一个终点富集于Ferroptosis、谷胱甘肽代谢和矿物质吸收通路，表明对铁依赖性的脂质过氧化和氧化应激的敏感性。另一个终点富集于核糖体和抗原处理/呈递通路，表明蛋白质翻译增加和免疫可见性增强。对于第一个终点，多项关于女性生殖疾病的综述和初步研究表明，铁过载、谷胱甘肽耗竭、脂质过氧化和Ferroptosis的级联反应可能会损害上皮屏障的完整性并放大黏膜炎症反应，为“应激偏向”状态提供了合理的机制基础[29, 30]。对于第二个终点，历史和当代证据表明人类子宫内膜上皮具有MHC-II依赖的抗原呈递潜力，这种潜力可以通过IFN-γ上调；更广泛的黏膜免疫学将上皮归类为“非专业抗原呈递细胞”，能够在炎症条件下降低免疫反应的阈值[31]。这些报告与当前数据中抗原呈递和翻译程序的增加一致，表明“呈递偏向”状态可能通过增加上皮-免疫相互作用的频率来维持炎症。尽管轨迹不同，但两个终点都指向降低的子宫内膜感受性和持续的炎症，这与CE中观察到的生殖结果风险信号一致[32]。细胞类型重新分布和重建的通信网络分析表明，COL1A1+上皮细胞的数量和活性增加，细胞外基质组织和上皮增殖程序得到加强。细胞间通信的总体数量和强度增加，传入/传出的信息流集中在COL1A1+上皮区域。在信号轴水平上，观察到VEGFA和VEGFR1/2之间的配体-受体配对的选择性增强，暗示了局部微环境重塑中的血管生成和通透性控制[33]。在机制上，VEGFA通过VEGFR2在内皮细胞上激活下游的聚焦粘附激酶（FAK）信号传导，促进内皮细胞迁移、管状形成和血管通透性[34]。在CE中，子宫内膜VEGFA和VEGFR2的表达增加，这也与植入周围子宫内膜的微血管密度增加和过度血管化相关[27]。虽然这种VEGF驱动的血管生成和通透性变化在其他妇科疾病（如子宫内膜异位症）中已被证实，有助于炎症细胞的浸润和病变的维持，但它们在子宫内膜炎中的具体作用仍有待功能验证[35, 36]。针对VEGF的临床和转化医学经验进一步支持了短期内、低剂量、个性化调节这条途径的可行性，尽管需要仔细考虑生殖安全性和清除间隔[37, 38]。在方法学上，通信推断是概率性的，依赖于配体/受体的差异表达和精心策划的复杂数据库；此类分析是统计推断。CellChat的原则和局限性强调了一种解释策略，优先考虑强通路先验和多证据整合，支持将VEGF轴作为实验验证的优先对象[39]。此外，重建的调节网络表明AP-1（JUN/FOS）的活性增加。跨组织多组学研究将AP-1定位为机械和炎症信号的整合者，能够驱动ECM应激和生长因子程序。基于此，一个正反馈模型——“COL1A1+上皮→AP-1→VEGFA轴→内皮/间质”是合理的，并为渗出、出血和周期性症状波动提供了途径层面的解释[40, 41]。应承认几个限制。首先，这项研究主要依赖于来自公共数据库的单细胞转录组数据，因此无法直接将特定病原体与AP-1激活等分子事件联系起来。未来的前瞻性队列研究应同时收集子宫内膜样本进行单细胞测序和微生物组分析，以建立病原体和宿主反应之间的因果链。其次，伪时间分析、细胞间通信分析和转录调控网络重建都是基于表达数据的计算推断，受到算法参数和知识库完整性的影响。因此，它们的可靠性需要通过空间转录组学和多重免疫荧光染色进一步验证，以澄清COL1A1+上皮细胞与组织中的VEGFA信号和AP1活性的共定位关系。第三，COL1A1+上皮细胞的驱动作用仍有待功能验证。未来的研究应建立子宫内膜类器官或小鼠模型，通过基因编辑和药物干预等方法验证这些细胞和通路在炎症维持中的必要性和治疗潜力。最后，针对COL1A1+–VEGFA–AP-1轴提出的治疗策略在当前临床转化中面临实际挑战。未来的工作将集中在临床转化上，优先探索更可行的干预策略，如针对局部子宫内膜的抗炎药物或针对下游效应分子的小分子化合物。这些方法将在严格的临床生殖安全评估框架内得到验证。

5 结论

这项研究提供了子宫内膜炎中子宫内膜的上皮单细胞图谱，识别了在炎症期间扩增的SPDEF+和COL1A1+亚群。后者显示出细胞外基质重塑的特征，并作为一个信号中心出现，增强的VEGFA-VEGFR通信表明参与了局部微环境的血管生成。伪时间分析表明有两种不同的内皮轨迹：一种与Ferroptosis和代谢应激相关，另一种与抗原处理和呈递相关。SCENIC进一步将AP-1（JUN/FOS）确定为这些疾病相关程序的潜在上游调节因子。这些研究的综合结果提供了一个细胞框架，有助于理解子宫内膜炎期间上皮状态变化的机制。此外，它们强调了包括VEGF信号传导、AP-1活性和Ferroptosis相关机制在内的机制或治疗探索的潜在途径。

作者贡献

Chengzi Tian负责概念化、方法开发、关键调查和原始手稿的起草。Zaiyi Li监督了项目，进行了正式的数据分析，严格修订了手稿，并管理了整个项目。所有作者都审阅并批准了最终手稿。

致谢

作者没有需要报告的内容。

资助

这项工作得到了中央政府地方科技发展指导基金（202407AB110013）的支持。

伦理声明

由于本研究不涉及任何人类实验，因此不需要伦理批准。

同意

由于本研究不涉及任何人类实验，因此不需要获得同意。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究中生成和/或分析的数据集可在(GSE223639)仓库中找到，网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE223639。