基于Serdemetan的新型Kir4.1抑制剂的发现：具有治疗胶质母细胞瘤伴抑郁并发症的潜力

《Pharmaceutical Science Advances》：Discovery of Novel Kir4.1 Inhibitors Based on Serdemetan with Potential Therapy for Glioblastoma-Depression Comorbidity

　　郝古|王思思|李梦丹|郭云鹏|李晓康|高兆兵|李健|刘汉芳|周晓宇|徐一翔
上海生物反应器工程国家重点实验室，细胞代谢光遗传技术上海前沿科学中心，物质生物学与动态化学上海前沿科学中心，新药设计上海国家重点实验室，华东理工大学药学院，上海200237，中国

**摘要**
原发性胶质瘤常伴随抑郁症状，这会加重病情和预后。目前的联合疗法由于患者依从性差、不良反应重叠以及抗抑郁药物起效延迟而效果有限。为了解决这一问题，我们旨在开发一种同时具有抗胶质瘤和抗抑郁作用的双功能药物。针对外侧缰核中的星形胶质细胞Kir4.1（Kir4.1钾通道）已成为治疗抑郁的潜在策略，其优势在于能够快速见效。通过高通量筛选，发现Serdemetan（Serd）这种目前处于I期临床试验中的广谱抗肿瘤药物具有显著的抗胶质瘤活性，并且表现出中等的Kir4.1抑制活性。基于此，Serd被选为双功能先导化合物。通过一系列结构修饰，增强了其对Kir4.1的抑制活性，同时保持了其抗胶质瘤效果，最终得到了21种新型衍生物。其中，化合物19在保持强抗胶质瘤活性的同时，表现出更好的Kir4.1抑制活性。此外，化合物19还显示出潜在的血液-脑屏障（BBB）通透性。与Serd相比，化合物19对Kir4.1的抑制选择性更高。最后，相关电生理实验表明化合物19能够调节星形胶质细胞中的天然Kir4.1通道。这些发现支持将其进一步开发为治疗胶质瘤和抑郁的双功能药物。

**缩写列表**
- **Kir4.1**：Kir4.1钾通道
- **Serd**：Serdemetan
- **CNS**：中枢神经系统（Central Nervous System）
- **RMPs**：静息膜电位（Resting Membrane Potentials）
- **LHb**：外侧缰核（Lateral Habenula）
- **TRD**：难治性抑郁（Treatment-Resistant Depression）
- **SAR**：结构-活性关系（Structure-Activity Relationship）
- **BBB**：血液-脑屏障（Blood-Brain Barrier）
- **DAT**：多巴胺转运体（Dopamine Transporter）
- **5-HTT**：5-羟色胺转运体（5-Hydroxytryptamine Transporter）
- **TLC**：薄层色谱（Thin-Layer Chromatography）
- **NMR**：核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance）
- **HRMS**：高分辨率质谱（High-Resolution Mass Spectrometry）
- **ESI**：电喷雾离子化（Electrospray Ionization）
- **HPLC**：高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography）
- **DAD**：二极管阵列检测器（Diode Array Detector）
- **CHO-K1**：中国仓鼠卵巢-K1细胞系（Chinese Hamster Ovary-K1）
- **PDLP**：聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）
- **PBS**：磷酸盐缓冲盐水（Phosphate-Buffered Saline）
- **HEK**：人胚肾细胞系（Human Embryonic Kidney）
- **HBSS**：Hanks平衡盐溶液（Hanks’ Balanced Salt Solution）
- **CCK-8**：细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8）
- **PAMPA**：平行人工膜通透性测定（Parallel Artificial Membrane Permeability Assay）
- **PC**：磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine）
- **PE**：磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine）
- **PS**：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine）
- **PI**：磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol）
- **PAP**：磷酸脂酸（Phosphatidic Acid）
- **CNS+**：高BBB通透性预测（High BBB Permeation Predicted）
- **CNS?**：低BBB通透性预测（Low BBB Permeation Predicted）
- **CNS±**：BBB通透性不确定（CNS±BBB Permeation Uncertain）
- **Pd/CP**：碳载钯（Palladium on Carbon）
- **DIPEA**：N-二异丙基胺（N-Diisopropylethylamine）
- **DMSO**：二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide）
- **MeOH**：甲醇（Methanol）
- **U87MG**：U87胶质母细胞瘤细胞系（U87 Glioblastoma Cell Line）
- **U118**：U118胶质母细胞瘤细胞系（U118 Glioblastoma Cell Line）
- **TI**：治疗指数（Therapeutic Index）
- **Cmax**：最大血浆浓度（Cmax）
- **Tmax**：达到最大浓度的时间（Tmax）
- **T1/2**：终末消除半衰期（T1/2）
- **AUC(0–t)**：血浆浓度-时间曲线下面积（Area Under the Plasma Concentration-Time Curve）
- **MRT(0–t)**：平均驻留时间（Mean Residence Time）

**1. 引言**
胶质瘤是中枢神经系统中最常见且最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，其特征是预后不良和5年生存率低[1]。胶质瘤常伴有进行性神经系统并发症[2]，其中抑郁是最常见的共病。研究表明，20%的胶质瘤患者在诊断后8个月内会出现抑郁症状，而有抑郁病史的患者在胶质瘤发作后发生抑郁发作的风险显著增加[3]。胶质瘤中抑郁的高共病率被认为是由多种因素复杂相互作用引起的，主要包括：(1) 胶质瘤破坏了神经内分泌系统[4]，从而导致抑郁的发生；(2) 胶质瘤的治疗干预（包括手术、放疗和化疗）可能损伤参与认知和情绪调节的脑区，从而增加抑郁的风险[5][6][7]；(3) 胶质瘤患者由于反复治疗和肿瘤复发而常常经历巨大的心理压力，这可能诱发或加剧抑郁症状[8]。胶质瘤可以诱发抑郁的发生，而抑郁则会对胶质瘤的起始和发展产生负面影响。研究表明，胶质瘤患者较高的抑郁和焦虑水平与胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力增强有关[9][10]。此外，与抑郁相关的认知障碍可能导致患者治疗依从性降低[11][12][13]，从而间接影响胶质瘤的治疗效果。这些发现表明，抑郁是影响胶质瘤发展和治疗结果的关键因素。

目前，治疗伴有抑郁的胶质瘤主要采用联合药物治疗[14]。在这种方法中，患者需要同时服用抗抑郁药和针对胶质瘤的药物。增加的药物负担往往降低患者的依从性，并导致叠加的不良反应。此外，大多数现有的抗抑郁药基于传统的单胺靶点，这些靶点与胃肠道出血[15]、谵妄[16]、癫痫发作[17]和低钠血症[18]等不良反应相关。而且，传统抗抑郁药的作用起效缓慢，通常需要2-4周才能发挥治疗效果[19]，这使得患者长时间暴露在上述叠加不良反应的风险中。基于上述药物联合使用的潜在风险，本研究旨在探索和选择更安全、更有效的抗抑郁靶点，以期进一步开发出同时具有抗胶质瘤和抗抑郁作用的双功能药物。

最近，内向整流钾通道4.1（Kir4.1，由Kcnj10编码）作为治疗抑郁的新靶点受到了广泛关注[20][21]。Kir4.1主要表达在中枢神经系统的肾脏和胶质细胞中[22][23]，对于维持星形胶质细胞的钾传导和静息膜电位（RMPs）至关重要[24]。其功能紊乱与多种神经系统疾病有关[25]。最新证据表明，外侧缰核（LHb）中Kir4.1表达的增加可能与抑郁有关。相反，敲低Kir4.1或在LHb中表达显性负性通道可以缓解类似抑郁的症状[21]，揭示了Kir4.1在抑郁治疗中的潜在价值[26][27][28]。此前，我们已经证明Kir4.1是快速起效抗抑郁作用的潜在靶点。Kir4.1抑制剂可以在小鼠抑郁模型中产生快速的抗抑郁效果，而不会产生(S)-氯胺酮（(S)-Ketamine）相关的致幻副作用。氯胺酮是首个获得FDA批准用于治疗难治性抑郁（TRD）的快速作用抗抑郁药，但其精神错乱效应和滥用潜力限制了其临床应用[29][30]。因此，Kir4.1是开发快速起效且安全的抗抑郁药物的理想靶点。

在我们之前的研究中，通过对内部化合物库的高通量筛选，发现Serdemetan（Serd）是一种潜在的Kir4.1抑制剂（IC50 = 1.32 ± 0.07 μM）。Serd最初由强生公司合成，目前正在开展I期临床试验。它作为一种P53-MdM2抑制剂，已显示出对胶质母细胞瘤细胞的显著抗增殖活性[31][32]。因此，我们选择Serd作为先导化合物，并进行了药物再利用和二次开发，旨在增强其对Kir4.1的抑制活性并提高其抗胶质瘤效果。在本报告中，我们介绍了基于Serd的21种衍生物的化学合成、生物学评估和结构-活性关系（SAR）。我们的发现表明，化合物19在抑制Kir4.1方面表现出显著改善，同时保持了在胶质母细胞瘤细胞系中的抗增殖效果。化合物19还显示出潜在的血液-脑屏障（BBB）穿透性和对Kir4.1相比多巴胺转运体（DAT）和5-羟色胺转运体（5-HTT）的更好选择性。随后对化合物19进行的电生理实验确认了其对天然Kir4.1通道的特异性调节作用。总之，我们的发现表明化合物19是一种有前景的双功能化合物，可用于治疗胶质瘤及其相关的抑郁症状。

**2. 实验部分**
**2.1. 材料与方法**
所有试剂和溶剂均从商业供应商处购买，直接使用无需进一步纯化。薄层色谱（TLC）在HSGF 254板（厚度：150–200 μm；烟台汇友有限公司）上进行，斑点在紫外光下可视化并用碘染色。闪蒸柱色谱使用HSGF 254硅胶（烟台汇友有限公司）进行。核磁共振（NMR）光谱在Bruker AMX-400光谱仪和Ascend 600 MHz光谱仪上记录，以四甲基硅烷（TMS）作为内标。化学位移以百万分之一（ppm，δ）表示，相对于TMS的下行信号。质子耦合模式分别用单峰（s）、双峰（d）、三峰（t）、四峰（q）、多重峰（m）和宽单峰（brs）表示。高分辨率质谱（HRMS）数据通过电喷雾离子化（ESI）使用Waters GCT Premier和Waters LCT仪器获得。最终化合物的高效液相色谱（HPLC）分析在配备四元泵和二极管阵列检测器（DAD）的Agilent 1100色谱仪上进行。最终化合物的HPLC峰纯度通过紫外光谱验证，所有化合物的纯度均超过95%。

**2.2. 1–21的通用合成方法和表征**
本文中使用的1–21的通用合成和表征细节在支持信息（SI）中描述。

**2.3. 电生理记录**
携带野生型人Kir4.1钾通道的质粒来自北京基因组学研究所。所有定点突变均使用QuickChange II定点突变试剂盒（Stratagene）生成，并通过DNA测序确认。中国仓鼠卵巢-K1（CHO-K1）细胞在添加了10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。携带目标基因（3600 ng）的质粒与增强型绿色荧光蛋白（400 ng）一起使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染到细胞中，遵循制造商的协议。在电生理记录前1小时，将细胞接种在聚-D-赖氨酸（PDL）包被的玻璃盖玻片上。所有细胞在37°C、5% CO2湿润环境中培养。全细胞膜片钳记录在室温下进行，使用Axopatch-700B放大器（Axon Instruments）和标准膜片钳方法。信号在2 kHz下过滤，并通过Digidata 1440A接口（Axon Instruments）以20 kHz采样。填充有内溶液的硼硅酸盐玻璃移液管的电阻通常为2–4 MΩ。使用BPS灌注系统（ALA Scientific Instruments）进行药物输送。在电压钳条件下记录由异源表达的钾通道介导的宏观电流。对于Kir4.1电流测量，移液管溶液包含（以mM计）：140 KCl、5 NaCl、1 MgCl2、1 CaCl2、10 HEPES和10 EGTA，用KOH调节至pH 7.2；浴液包含（以mM计）：5 KCl、140 NaCl、1 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和10葡萄糖，用NaOH调节至pH 7.5。对于其他钾电流和星形胶质细胞记录，标准内溶液相同，外部浴液包含（以mM计）：140 NaCl、5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、10葡萄糖和10 HEPES，用NaOH调节至pH 7.4。对于需要增强内向电流的实验，使用高钾浴液（以mM计）：30 KCl、115 NaCl、1 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和10葡萄糖（pH 7.4用NaOH调节）。电流通过从-80 mV的保持电位开始，以-120 mV的超极化步骤激发，然后以+50 mV的斜坡去极化。在建立全细胞配置后，使用标准内溶液和外溶液在电流钳条件下记录星形胶质细胞的静息膜电位（I = 0 pA）。

**2.4. Cell Counting Kit-8**
细胞接种：将处于对数生长阶段且状态良好的相关胶质母细胞瘤细胞和正常细胞接种到96孔板中，每孔保持8000个细胞。向每个孔添加90 μL培养基。为每组设置3个重复孔。在96孔板最外圈的每个孔中添加200 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后放入培养箱中培养。
药物添加：在培养箱中培养过夜后，第二天取出96孔板，加入10 μL测试衍生物。进行三倍系列稀释，得到最终浓度100 μM、30 μM、10 μM、3.3 μM、1 μM、0.33 μM、0.1 μM和0.033 μM，最终体积为100 μL。然后将其放回培养箱中培养48小时。
CCK-8试剂添加用于检测：培养48小时后，取出96孔板，向每个孔添加100 μL制备好的CCK-8试剂。在37°C下孵育45分钟，然后在微孔读数仪中测量450 nM处的吸光度。

**2.5. 5-HTT/DAT：功能测定**
在本研究中，使用了Elsevier Science & Technology Co., Ltd.（北京）开发的荧光检测系统。操作程序如下：首先，使用Molecular Devices公司的α-神经递质转运体摄取测定试剂盒（目录号R8174）进行荧光检测。表达DAT和5-HTT受体的人胚肾（HEK）细胞系（由北京Ascentage Pharma Co., Ltd.构建，表达人类SLC6A3和SLC6A4基因）接种到PDL包被的384孔板中。过夜孵育后，去除培养基，向每个孔添加16 μL稀释后的化合物和检测缓冲液，然后在37°C下处理0.5小时。实验中，西替利嗪和0.1%地塞米松分别作为阳性和阴性对照。随后，向每个孔中加入16 μL用1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）制备的染料混合物，并在37°C下孵育1小时。最后，使用荧光微孔板读取器收集数据，激发波长为450 nm，发射波长为528 nm。

2.6. 并行人工膜通透性测定（PAMPA）应用以下方案来测量通过人工膜的Peff，以预测血脑屏障（BBB）的通透性。使用从猪极化脑脂质提取物中得到的磷脂混合物来测量BBB的有效通透性，该混合物包含磷脂酰胆碱（PC）12.6%、磷脂酰乙醇胺（PE）33.1%、磷脂酰丝氨酸（PS）18.5%、磷脂酰肌醇（PI）4.1%、磷脂酸（PA）0.8%以及30.9%的其他化合物（购自Avantis Polar Lipids-Alabaster）。将4 μL的2% PBL浸入供体滤板的每个孔中。然后，将装有药物的供体板放入预先装有相同缓冲液（300 μL）的受体板中。盖上板盖后，将组装好的供体-受体板在室温下孵育12小时。随后，通过96孔微孔板分光光度计在10个不同波长下同时进行紫外测量，确定受体和供体溶液中的药物浓度。表观通透系数（Pe）根据以下公式计算：其中Vd是供体体积，Va是受体体积，A是膜面积，t是孵育时间，[drug]acceptor是受体浓度，[drug]equilibrium是平衡浓度。根据文献中建立的BBB通透性预测模式，根据范围对化合物进行分类有助于向药物发现领域的合作者传达数据。以下是我们在实验室中使用过的范围[33]：
(a)“CNS+”（预测具有高BBB通透性）；Pe (10?6 cm?s?1) > 3.08；
(b)“CNS?”（预测具有低BBB通透性）；Pe (10?6 cm?s?1) < 1.13；
(c)“CNS±”（BBB通透性不确定）；Pe (10?6 cm?s?1) 在1.13到3.08之间。

2.7. 血浆药代动力学
给雄性C57小鼠（n = 3）单次腹腔注射指定溶剂中的化合物（10 mg/kg）。在以下时间点从下颌下静脉采集血液样本：给药后0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时。使用EDTA-K2作为抗凝剂，每个样本大约采集0.03 mL血液。样本立即置于冰上，并在1小时内通过离心分离血浆（离心条件：6800 g，6分钟，2–8°C）。血浆样本在-80°C下保存直至分析。使用HPLC分析血浆样本。

2.8. 统计分析
数据以平均值±标准误差（SEM）或平均值±标准差（SD）表示，指定的样本量（n）表示生物学重复次数。对于两组比较，使用学生t检验。***p < 0.001，****p < 0.0001。使用GraphPad Prism（版本8.0）进行所有分析。

3. 结果与讨论
3.1. 设计与合成
如图1所示，我们最初进行了Serd的抗胶质瘤活性SAR研究。相关文献和专利的研究表明，连接左侧吲哚基团、中央苯环和右侧吡啶环的两个连接区域是维持Serd抗胶质瘤活性的关键结构基序。包括碳链长度的改变、亚胺基团的重新定位或亚胺官能团的化学修饰在内的修改导致抗胶质瘤活性显著降低或完全丧失[34]、[35]、[36]。这一发现表明，应保留这两个连接区域以确保保留原始的抗胶质瘤活性。接下来，我们总结了Serd的三个芳香区域[34]、[35]、[36]对抗胶质瘤活性的影响：(1) 中央苯核内的修饰对抗胶质瘤活性的影响最小，这表明可以通过支架跳跃来增强Kir4.1抑制活性并获得新的化学实体。(2) 左侧吲哚片段的SAR概况在专利中并未详细说明，表明有可能通过结构修饰来提高Kir4.1活性和抗胶质瘤效果。(3) 右侧吡啶区域可以替换为单环或双环融合环系统，但进一步扩展到双环结构之外会导致抗胶质瘤活性完全丧失。这表明结构修饰的最佳范围限于双环系统。

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图1. Serd的抗胶质瘤活性结构-活性关系以及基于Serd开发双功能化合物的结构设计策略。
为了保持抗胶质瘤活性并增强Kir4.1抑制活性，根据之前的SAR分析，我们保留了两个连接区域，并将Serd的结构分为三个结构区域：(a) A区域，苯环核心；(b) B区域，左侧吲哚基团；(c) C区域，右侧吡啶环。最初，在A区域，考虑到对该区域的修饰对抗胶质瘤活性的影响最小，我们探索了各种修饰方法，包括在苯环上引入取代基（化合物1）、用杂环替换它（2）以及将其扩展为双环系统（3-5），以开发具有增强Kir4.1抑制活性的新化学实体。在B区域，由于抗胶质瘤活性的SAR不明确，采用了两种平行策略来优化Kir4.1抑制：支架跳跃，涉及用其他双环替换吲哚基团（6-10）；以及精细调节，涉及对吲哚支架的取代基修饰（11-13）。最后，在C区域，我们进行了结构修饰，包括用替代的双环（14-17）或单环（18-21）替换，旨在同时提高抗抑郁和抗胶质瘤活性。
衍生物的制备过程如方案1、方案2、方案3所示。化合物1-5的合成过程如方案1中详细说明。首先，将市售的氟取代硝基化合物与色胺进行亲核取代反应，得到中间体1a-5a。随后，中间体1a-5a在氢气存在下用钯碳（Pd/C）进行氢化，得到中间体1b-5b。最后，通过中间体1b-5b与4-溴吡啶盐酸盐之间的Buchwald-Hartwig交叉偶联反应得到目标化合物1-5。
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方案1. 化合物1-5的合成路线
试剂和条件：(a) 色胺，DIPEA，DMSO，85°C，6小时；(b) Pd/C，H2，MeOH，室温，12小时；(c) 4-溴吡啶，BrettPhos，BrettPhosPalladacycle，K2CO3，叔丁醇，95°C，12小时。
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方案2. 化合物6-13的合成路线
试剂和条件：(a) 色胺，DIPEA，DMSO，85°C，6小时；(b) Pd/C，H2，MeOH，室温，12小时；(c) 4-溴吡啶，BrettPhos，BrettPhosPalladacycle，K2CO3，叔丁醇，95°C，12小时。
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方案3. 化合物14-21的合成路线
试剂和条件：(a) BrettPhos，BrettPhosPalladacycle，K2CO3，叔丁醇，95°C，12小时。
化合物6-13的合成过程如方案2中详细说明。首先，将市售的取代乙胺化合物与中间体4a进行亲核取代反应，得到中间体6a-13a。随后，中间体6a-13a在氢气存在下用Pd/C进行氢化，得到中间体6b-13b。最后，通过中间体6b-13b与4-溴吡啶盐酸盐之间的Buchwald-Hartwig交叉偶联反应得到目标化合物6-13。
化合物14-21的合成过程如方案3中详细说明。目标化合物14-21是通过中间体4b与市售氨基化合物之间的Buchwald-Hartwig交叉偶联反应得到的。所有化合物均通过NMR和HRMS等互补方法进行了表征。纯度大于95%的化合物按照下文描述的方法进行了生物活性测试。

3.2. 化合物1-21对Kir4.1的抑制活性
使用全细胞膜片钳记录在室温条件下对瞬时转染的CHO-K1细胞评估化合物1-21对Kir4.1的抑制活性。实验结果见表1、表2、表3，数据以10 μM浓度下的抑制百分比表示。对于表现出显著抑制活性的衍生物（> 70%），在更低浓度（1 μM）下进行了进一步活性测试。
表1. 化合物1-5对Kir4.1的抑制活性
化合物 Kir4.1抑制 ± SEM (%) 在10 μM
Serd 92 ± 2 a
96 ± 2 2
22 ± 3 2
196 ± 1 9
6 ± 4 8 2
22 ± 2 1
10 ± 1 -- b
-- 3
90 ± 3 9
6 ± 3 2 3
494 ± 2 9
7 ± 3 8 1
98 ± 1 9
9 ± 0 1 3
19 ± 7 1 9
a
结果表示至少三次实验的平均值±标准误差（SEM）。
b 无测试。
表2. 化合物6-13对Kir4.1的抑制活性
化合物 Kir4.1抑制 ± SEM (%) 在10 μM
Serd 94 ± 2 a
97 ± 0 8 1
387 ± 3 6
21 ± 7 2
6 ± 8 -- b
-- 7
95 ± 1 9
5 ± 2 8 1
13 ± 2 8 1
95 ± 1 9
4 ± 2 5 7
97 ± 2 9
6 ± 3 6 4
6 ± 10 8 5
108 4 9
4 ± 1 3 6
10 ± 3 11 9
194 ± 1 9
5 ± 1 12 5
12 ± 3 11 3
13 ± 3 9 3
93 ± 3 2 8
2 ± 4 a
结果表示至少三次实验的平均值±标准误差（SEM）。
b 无测试。
表3. 化合物14-21对Kir4.1的抑制活性
化合物 Kir4.1抑制 ± SEM (%) 在10 μM
Serd 94 ± 2 a
97 ± 0 8 1
387 ± 3 1
42 ± 4 1 3
-- b
-- 15 5 1
---- 16 16 3
---- 17 12 3
---- 18 9
8 ± 6 6
0 8 1
99 6 2
96 ± 2 9
292 ± 4 7
0 2 8 1
100 ± 3 9
3 4 2
14 ± 3 2
11 5 13 3
---- a
结果表示至少三次实验的平均值±标准误差（SEM）。
b 无测试。
表4. 化合物4、13和19的PAMPA-BBB
化合物 Pe ± SD (10?6 cm·s?1)
Serd 5.80 ± 0.19 a
6.31 ± 0.74 b
6.48 ± 0.23 c
6.60 ± 0.46 d
分类 CNS+
CNS+ 5.80 ± 0.19 a
CNS+ 6.31 ± 0.74 a
CNS+ 6.48 ± 0.23 a
CNS+ 6.60 ± 0.46 a
我们在实验室中使用的范围[33]：“CNS+”（预测具有高BBB通透性），Pe (10?6 cm·s?1) > 3.08；“CNS?”（预测具有低BBB通透性），Pe (10?6 cm·s?1) < 1.13；“CNS±”（BBB通透性不确定），Pe (10?6 cm·s?1) 在1.13到3.08之间。详细计算见实验部分。
结果表示至少三次实验的平均值±标准误差（SD）。
如表1所示，我们首先在苯环上引入了一个三氟甲基基团，得到化合物1。其在10 μM和1 μM下的活性与Serd相当。接下来，我们用吡啶环替换苯环（2），导致活性显著降低。为了进一步探索这一区域，我们将芳香核心扩展为双环融合环系统，通过在苯骨架上引入五元环酮（3）、六元环酮（4）和吡啶环（5）。值得注意的是，化合物4在1 μM下的活性几乎是母体的四倍。基于这些结果，我们选择1-四酮（4）作为下一轮结构优化的核心结构。
如表2所示，对吲哚基团的初步修饰包括用其他双环替换它，包括吡啶（6）、1,3-苯并二氧杂环（7）、萘（8）和3-氮杂吲哚（9）。所有得到的类似物在1 μM下的活性完全丧失，表明这一区域的剧烈结构变化不利于Kir4.1的抑制。然后，我们采用了生物等效替换策略，用氧原子替换吲哚环的氮原子（10）。这种修饰导致活性比化合物4降低了50%，表明吲哚骨架在维持生物活性中起着关键作用。基于这一观察，我们在修改连接位点（11）的同时保留了吲哚核心，并引入了取代基，如氯原子（12）和甲基（13）。结果显示化合物12在1 μM下无活性，而13保留了活性。由于B区域的任何修饰都没有提高抑制效力，因此选择未修饰的吲哚结构进行后续的设计迭代。
如表3所示，最初用三氟甲基取代的苯环（14）、氟取代的苯环（15）和未取代的苯环（16）替换吡啶环，导致在1 μM下Kir4.1抑制活性完全丧失，表明吡啶骨架在该区域维持活性至关重要。进一步的结构修饰包括用双环系统替换吡啶环，生成萘（17）、喹啉（18）、四氢喹啉（19）和环戊[b]吡啶（20），以及在吡啶环的左侧引入一个羰基（21）。在这些类似物中，18、19和20在10 μM浓度下表现出活性，而只有19在1 μM浓度下仍保持活性。这些结果共同表明，吡啶环在区域C中是一个对活性敏感的药效团，且双环通常比单环具有更好的活性。不幸的是，在这一轮优化中未发现效力得到提升的衍生物。以下是化合物1-21对Kir4.1抑制活性的构效关系（SAR）概述：(a) 在区域A中，在苯环上引入吸电子基团可以保持活性。相比之下，引入杂原子（如用吡啶替换苯环（2）会显著降低活性。增加苯环的体积和疏水性相互作用有助于保持或增强活性。例如，与环酮融合（3, 4）可以提高活性，其中环己酮衍生物（4）显示出最高的效力；与吡啶融合（5）可以保持活性；(b) 在区域B中，对吲哚环的任何修饰，无论是用其他单环或双环系统替换（6-8）、在骨架中引入氮原子（9），还是改变连接位点（11），都会导致不同程度的活性丧失。关于取代基，吸电子基团（12）会降低活性，而供电子基团（13）则能保持活性。这些结果表明，吲哚环是Kir4.1抑制活性的关键药效团，大多数结构修饰都会导致效力降低；(c) 在区域C中，用取代或未取代的苯环替换吡啶环（14-16）会导致活性显著下降。此外，增加吡啶环的体积和疏水性有利于保持活性（17-20）。最后，用酰胺基团替换C-N键也被证明会导致活性丧失（21）。总之，上述化合物提供了直观且易于理解的构效关系。总结来说，基于上述三轮优化，我们获得了三种在1 μM浓度下具有优异Kir4.1抑制活性的衍生物，并随后测试了它们的IC50值。与Serd（IC50 = 1.32 ± 0.07 μM）相比，化合物4（IC50 = 0.80 ± 0.02 μM）、13（IC50 = 0.80 ± 0.03 μM）和19（IC50 = 0.77 ± 0.03 μM）（图2）表现出更好的活性。鉴于它们的效力相当，这些优化后的衍生物将在后续研究中并行进行进一步的生物学评估。

3.3. 化合物4、13和19的体外抗胶质瘤活性和细胞毒性
为了评估Serd结构修饰对其抗胶质瘤活性的影响，我们使用了U87胶质母细胞瘤细胞系（U87MG）和U118胶质母细胞瘤细胞系（U118）来评估Serd以及化合物4、13和19的活性。如图3所示，对于U87MG细胞，化合物4（IC50 = 2.70 ± 0.67 μM）、13（IC50 = 2.99 ± 0.37 μM）和19（IC50 = 2.17 ± 0.22 μM）显示出比Serd（IC50 = 4.17 ± 0.37 μM）略强的抑制活性；对于U118细胞，化合物4（IC50 = 4.25 ± 1.45 μM）、13（IC50 = 5.08 ± 0.54 μM）和19（IC50 = 4.85 ± 0.37 μM）与Serd（IC50 = 3.91 ± 0.88 μM）相比保持了相当的抑制水平。总体而言，这些结果表明结构修饰策略并未影响其抗胶质瘤活性。化合物4、13和19在两种细胞系中均保持了良好的抗胶质瘤活性。此外，我们还评估了Serd、化合物4、13和19对人类胚胎肾细胞系293T的细胞毒性，并计算了治疗指数（TI），即细胞毒性的IC50与Kir4.1和胶质母细胞瘤抑制的IC50的比值，以评估结构修饰带来的安全性改进。根据表S1中的数据（见补充信息），与Serd相比，化合物4、13和19在Kir4.1抑制方面的TI值有所提高，而它们对胶质母细胞瘤细胞的TI值保持相当。总之，与Serd相比，化合物4、13和19在保持抗胶质瘤活性的同时，安全性略有提高。

3.4. 化合物4、13和19的有效渗透系数
血脑屏障（BBB）渗透性是针对中枢神经系统疾病药物候选物的关键药代动力学因素。我们采用了先前报道的一种平行人工膜渗透性测定法（PAMPA）来评估化合物的脑部穿透潜力，其中使用溶解在正十二烷中的猪脑组织提取物作为人工膜[26]。通过确定这些化合物在人工膜上的有效渗透系数来评估Serd及其衍生物4、13和19的脑部穿透能力。值得注意的是，这种方法仅限于预测脑部穿透能力。如表5所示，Serd（Pe = 5.80, CNS+）、化合物4（Pe = 6.31, CNS+）、13（Pe = 6.48, CNS+）和19（Pe = 5.60, CNS+）均显示出潜在的BBB渗透性。

3.5. 化合物4、13和19对经典抗抑郁靶点的选择性
大多数现有的抗抑郁药基于传统的单胺靶点，这些靶点与许多不良反应相关[15]、[16]、[17]、[18]。为了研究化合物4、13和19是否对Kir4.1具有选择性，我们评估了它们对两种经典抗抑郁靶点5-HTT和DAT的抑制活性。如表5所示，Serd对5-HTT（IC50 = 0.70 ± 0.05 μM）和DAT受体（IC50 = 0.38 ± 0.01 μM）均表现出强抑制活性。相比之下，化合物4、13和19完全消除了5-HTT的抑制活性（IC50 > 100 μM）。同时，化合物4（IC50 = 2.70 ± 0.04 μM）和13（IC50 = 16.18 ± 0.08 μM）显著降低了DAT的抑制活性；化合物19（IC50 = 23.00 ± 0.07 μM）对DAT的抑制作用最弱。这些结果表明，修饰策略提高了衍生物对Kir4.1钾通道的抑制选择性，从而可能降低不良反应的风险。

3.6. 化合物19作为星形胶质细胞Kir4.1通道抑制剂的电生理分析
基于上述综合评估，化合物19被选为进一步研究的最终优选衍生物。先前的研究表明，Kir4.1通道在星形胶质细胞中高度表达，在调节K+传导和调节静息膜电位（RMPs）中起关键作用[40]、[41]。为了评估化合物19对星形胶质细胞膜特性的影响，我们在原代培养的星形胶质细胞中进行了全细胞膜片钳记录，分别在对照组和19处理组条件下进行。我们发现，应用19显著降低了星形胶质细胞的钾电流（图4A），显著降低了宏观斜率传导（图4B），并显著去极化了RMPs（图4C）。这些结果表明19作为一种小分子抑制剂，能够调节星形胶质细胞的膜特性。

3.7. 化合物19的药代动力学研究
在C57BL/6J小鼠中评估了19的血浆药代动力学特征，结果总结在表6中。腹腔注射19，剂量为10 mg/kg后，血浆浓度达峰时间（Tmax）为0.25小时，峰值浓度（Cmax）为1047.92 ng/mL，总系统暴露量（AUC(0–t)）为1408.71 h·ng/mL。这些结果表明19吸收迅速，在给药后短时间内达到最大血浆水平。消除半衰期（T1/2）为1.02小时，平均停留时间（MRT(0–t)）为1.19小时，表明药物在体内的清除速度快，持续时间短。总体而言，这种快速吸收特性符合快速发挥治疗效果的药效学需求。然而，药物从体内迅速清除，需要频繁给药以维持治疗浓度。

4. 讨论
抑郁症是原发性胶质瘤患者最常见的并发症之一，严重影响了患者的生活质量和治疗效果[1]。目前的临床管理主要依赖于抗抑郁药和抗癌药物的联合使用[14]。然而，这种方法常常受到重叠不良反应和抗抑郁药疗效延迟的局限[15]、[24]、[25]。为了解决这些挑战，开发同时针对胶质瘤和缓解抑郁症的双功能药物是一个有吸引力的治疗策略。作为治疗抑郁症的有希望的目标，Kir4.1抑制具有快速起效和低毒性的特点，使其成为开发此类双作用药物的理想选择。在这项研究中，我们筛选并选择了Serd（IC50 = 1.32 ± 0.07 μM）作为双功能先导化合物。设计并合成了一系列衍生物（化合物1-21），并系统评估了它们对Kir4.1钾通道的抑制活性。其中，化合物4（IC50 = 0.80 ± 0.02 μM）、13（IC50 = 0.80 ± 0.03 μM）和19（IC50 = 0.77 ± 0.03 μM）在体外表现出比Serd更好的Kir4.1抑制活性。随后使用U87MG和U118胶质母细胞瘤细胞系评估了化合物4、13和19的体外抗胶质瘤活性。结果表明这些化合物保持了强大的抗胶质瘤活性。这一结果符合我们增强Kir4.1抑制活性同时保留抗胶质瘤活性的修改目标。BBB渗透性是针对中枢神经系统药物的关键药代动力学因素，因此我们评估了Serd及其优化衍生物的BBB渗透性。所有三种化合物都被归类为“CNS+”，表明具有良好的脑部穿透特性。我们进一步评估了这些化合物对Kir4.1相对于DAT和5-HTT的抗抑郁靶点选择性。相关数据显示，与Serd（IC50 = 0.70 ± 0.05 μM对5-HTT，0.38 ± 0.01 μM对DAT）相比，所有三种优化衍生物对Kir4.1的选择性显著提高，其中化合物19（IC50 > 100 μM对5-HTT，23.00 ± 0.07 μM对DAT）显示出最有利的选择性。因此，化合物19被选为最终优选衍生物。随后的膜片钳记录显示，作为小分子Kir4.1阻断剂的化合物19显著降低了电流幅度、传导性和RMPs，表明它直接调节了星形胶质细胞的膜特性。最后，化合物19在小鼠中的药代动力学分析表明，其快速吸收特性符合快速发挥治疗效果的药效学要求。总之，上述结果表明19具有良好的药物形成特性，可以进一步作为双功能化合物进行研究。**研究的局限性**
本研究存在一些局限性：
(1) Kir4.1作为抗抑郁靶点的快速起效机制仅在临床前动物模型中得到验证，其在临床环境中的快速治疗效果仍有待进一步研究；
(2) 对优化化合物的选择性评估目前仅限于其对Kir4.1与DAT（多巴胺转运体）和5-HTT（5-羟色胺转运体）的选择性。鉴于其他Kir通道亚家族成员（尤其是Kir2.x和Kir6.x）在心脏功能和代谢稳态中的重要作用[37][38][39]，仍需开展针对这些亚型之间选择性的研究；
(3) 本研究仅限于体外验证，未来需要在抑郁症与胶质母细胞瘤共病模型中进行进一步的体内药效学评估。

**结论**
通过对Serd进行结构修饰，我们发现了一种具有潜力的化合物19。化合物19在体外表现出强烈的Kir4.1抑制活性，并同时显示出显著的抗胶质瘤效果。这一结果为开发双功能治疗药物提供了合理的依据和有价值的化学模板。

**作者贡献声明**
郭云鹏：方法学、数据分析
李梦丹：方法学、数据分析
高兆兵：资源获取、概念构思
李晓康：方法学
刘汉芳：撰写初稿、方法学、数据分析
李健：资源获取、项目管理、概念构思
周晓宇：撰写审查与编辑、资源获取、数据分析、概念构思
顾浩：撰写初稿、方法学、数据分析
徐一翔：撰写审查与编辑、数据分析、概念构思
王思思：撰写审查与编辑、方法学、数据分析

**数据可用性**
本研究中的数据可应相应作者的要求提供。

**伦理审批**
不适用。

**科学写作中关于生成式AI的声明**
本手稿的整个撰写过程中未使用任何生成式AI工具。

**资助信息**
本研究得到了以下机构的支持：
- 国家自然科学基金（U25C2050，资助对象：J.L.）
- 中国科学院战略性先导科技专项（XDB0830403，资助对象：Z.G.）
- 国家杰出青年科学基金（82404594，资助对象：X.Z.）
- 中国国家创新人才博士后计划（BX20240397，资助对象：X.Z.）
- 中国博士后科学基金（2024M753376，资助对象：X.Z.）
- 上海光遗传学细胞代谢技术前沿科学中心（2021 Sci & Tech 03-28，资助对象：J.L.）
- 上海高水平地方大学创新研究团队（SHSMU-ZDCX20212702，资助对象：J.L.）
- 中国生物反应器工程国家重点实验室专项基金（2060204，资助对象：J.L.）