ACSS2通过蛋白质棕榈酰化驱动肝细胞癌的乐伐替尼耐药性

《Pharmacological Research》：ACSS2 drives Lenvatinib resistance in hepatocellular carcinoma through palmitoylation

乐伐替尼（Lenvatinib）是一种用于治疗晚期肝细胞癌（HCC）的一线酪氨酸激酶抑制剂，其临床疗效因获得性耐药而面临挑战。虽然代谢重编程与治疗耐药有关，但其精确的机制联系仍不清楚。本研究确定了ACSS2（乙酰辅酶A合成酶2）介导的代谢-表观遗传交互作用是驱动乐伐替尼耐药的关键因素。转录组学和代谢组学分析发现，耐药HCC细胞中丙酮酸代谢增强，其中ACSS2的表达与乐伐替尼耐药性显示出最强的关联性。遗传操作实验表明，ACSS2决定了治疗敏感性，敲低该基因可恢复药物反应，而过表达则赋予耐药性。在机制上，ACSS2驱动的棕榈酸盐生物合成促进了表皮生长因子受体（EGFR）的棕榈酰化，从而保护该受体免受泛素依赖的降解。这种稳定化作用维持了致癌性EGFR信号传导，最终介导了治疗逃逸。至关重要的是，在皮下和水动力转染HCC模型中，ACSS2的药理抑制与乐伐替尼联用能够协同克服耐药性。这些发现不仅将ACSS2/EGFR轴描述为耐药HCC中的一个代谢脆弱性，还提出ACSS2靶向治疗是逆转乐伐替尼耐药的一个有前景的策略，为晚期HCC管理提供了一种新的治疗方法。

论文解读：ACSS2通过代谢重编程与EGFR棕榈酰化介导肝细胞癌乐伐替尼耐药

一、研究背景与科学问题

肝细胞癌（HCC）是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤。随着分子靶向治疗和免疫检查点抑制剂的出现，晚期HCC的治疗范式已发生转变。其中，多激酶抑制剂乐伐替尼（Lenvatinib）通过同时靶向促血管生成（VEGFR1-3， FGFR1-4）和致癌（PDGFRα， KIT， RET）信号通路，已成为一线疗法。然而，尽管其总生存期不劣于索拉非尼且无进展生存期更优，其临床效用仍受到固有性和获得性耐药机制的严重限制，超过60%的患者最终面临治疗失败。这一持续存在的挑战，凸显了揭示耐药分子驱动因素和开发基于机制的联合治疗策略的迫切性。

近年来，代谢可塑性已被认为是包括HCC在内的多种癌症产生治疗耐药的一个标志。肿瘤细胞通过动态重编程其代谢网络来规避药物诱导的压力，机制包括糖酵解通量扩增以补偿能量、谷氨酰胺分解激活以维持氧化还原稳态，以及脂质代谢重编程以支持膜生物合成。在乐伐替尼耐药的背景下，有证据表明代谢适应，特别是葡萄糖利用增强和脂肪生成激活，发挥了关键作用。然而，这些代谢改变如何精确地转化为耐药表型，其具体的分子执行者仍不明确。

乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）处于营养感知和转录调控的枢纽位置。除了在营养匮乏时催化乙酸转化为乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）的经典功能外，ACSS2还被证实参与通过从头脂肪生成维持脂质稳态、在肿瘤进展过程中调控组蛋白乙酰化模式，以及通过代谢竞争影响抗肿瘤免疫。尽管如此，ACSS2在HCC，特别是乐伐替尼耐药发展中的作用仍未被探索。同时，先前的研究已将乐伐替尼耐药与表皮生长因子受体（EGFR）信号轴的激活联系起来，但其上游调控机制，特别是与代谢重编程的关联，尚未得到充分阐明。因此，本研究旨在探究代谢异常，特别是ACSS2的作用，在驱动肝细胞癌获得性乐伐替尼耐药中的具体机制。

二、研究设计与方法学概述

为探究乐伐替尼耐药机制，研究人员开展了一项整合了细胞模型、动物实验和临床样本分析的系统性研究。研究构建并验证了乐伐替尼耐药的HCC细胞系模型（Huh7 LR和PLC/PRF/5 LR）。在人体样本方面，研究纳入了接受乐伐替尼辅助治疗的22名患者队列进行分析，并利用了34名术前接受¹¹C-乙酸和¹⁸F-FDG PET/CT（正电子发射断层扫描/计算机断层扫描）的HCC患者数据，以分析乙酸和葡萄糖摄取与ACSS2、EGFR表达的相关性。所有患者均签署了知情同意书，研究获得复旦大学附属华山医院伦理委员会批准。

研究采用了多种关键技术方法来揭示机制：

1. 1.
   多组学分析：通过对同基因对的亲本和耐药细胞进行批量RNA测序（RNA-seq）和稳态代谢组学分析，并结合稳定同位素¹³C-葡萄糖示踪技术，系统描绘了耐药细胞的转录组和代谢流变化特征。
2. 2.
   功能获得与缺失实验：利用短发夹RNA（shRNA）介导的基因敲低和过表达载体，在多种HCC细胞系中构建ACSS2和EGFR的稳定调控模型，通过细胞活力（CCK-8）、克隆形成和细胞凋亡（Annexin V染色）等实验，验证基因功能。
3. 3.
   分子机制探究：通过蛋白质印迹法（Western Blotting）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation， Co-IP）、酰基-生物素交换（Acyl-biotin exchange， ABE）实验、环己酰亚胺（Cycloheximide， CHX）追踪实验以及泛素化分析，深入研究了ACSS2如何通过调控EGFR的翻译后修饰（棕榈酰化和泛素化）来影响其蛋白稳定性。
4. 4.
   体内药效验证：在Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型和C57BL/6J小鼠水动力转染（Hydrodynamic Transfection）诱导的HCC模型中，评估了乐伐替尼单药、ACSS2抑制剂（ACSS2i）单药及两者联合治疗的抗肿瘤效果。

三、主要研究结果与发现

3.1. 丙酮酸代谢在乐伐替尼耐药的HCC中被激活

研究人员首先证实了耐药细胞在药物压力下存活能力增强。RNA-seq分析显示，耐药细胞发生了深刻的代谢适应，碳水化合物代谢通路，特别是糖酵解/糖异生和丙酮酸代谢被显著激活。差异表达分析发现关键酶发生变化，如丙酮酸激酶PKLR上调。稳定¹³C-葡萄糖示踪进一步揭示，耐药细胞表现出糖酵解通量加速（GAP， DHAP和丙酮酸的¹³C富集度更高），而三羧酸循环（TCA cycle）活性和氨基酸合成减弱（柠檬酸、α-酮戊二酸等富集度降低）。这些结果表明，在获得耐药性过程中，丙酮酸代谢而非氨基酸生物合成是主要的功能通路。

3.2. ACSS2是HCC对乐伐替尼耐药的关键驱动因子

对RNA-seq数据的基因本体（GO）富集分析进一步锁定了丙酮酸代谢过程。在7个丙酮酸代谢相关基因中，只有ACSS2的mRNA和蛋白水平与细胞对乐伐替尼的半抑制浓度（IC₅₀）值显著相关。尽管TCA循环不活跃，耐药HCC细胞比亲本细胞拥有更高的乙酰辅酶A水平，提示ACSS2可能维持了胞质乙酰辅酶A池。临床样本分析证实了ACSS2的临床相关性，无应答者中ACSS2蛋白表达更高，耐药肿瘤的免疫组化（IHC）评分也更高。这些多层次的验证确立了ACSS2是跨实验和临床环境的乐伐替尼耐药标志物。

3.3. ACSS2通过翻译后修饰稳定EGFR

鉴于EGFR激活与乐伐替尼耐药已知的关联，研究人员探究了ACSS2-EGFR的调控关系。虽然ACSS2的调控不改变EGFR的mRNA水平，但蛋白质定量显示，ACSS2敲低导致EGFR减少，而过表达则增加EGFR。药理学抑制（ACSS2i）可剂量依赖性地耗竭EGFR蛋白而不改变转录本水平。CHX追踪实验表明，ACSS2i加速了EGFR在耐药细胞系中的降解，而补充乙酸盐则延长了EGFR蛋白的半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132可挽救耐药细胞中的EGFR水平，而溶酶体抑制剂氯喹无效，揭示了ACSS2对EGFR降解的调控依赖于蛋白酶体。泛素化实验证明EGFR被多聚泛素化，ACSS2i处理增强了EGFR的泛素化水平。这些发现表明ACSS2通过泛素-蛋白酶体途径调控EGFR的蛋白质稳态。

3.4. ACSS2通过促进棕榈酰化来稳定EGFR

ACSS2是负责生成乙酰辅酶A的关键代谢酶，定位于细胞质和细胞核。在耐药细胞中观察到ACSS2在细胞质中积累，而组蛋白H3乙酰化水平无明显变化，这排除了主要的核内表观遗传机制。RNA-seq分析显示，ACSS2敲低后，耐药细胞中的胆固醇和脂质代谢通路强烈下调。¹³C-葡萄糖示踪代谢流分析表明，耐药细胞株有更高的¹³C并入脂肪酸、甘油三酯等脂质分子。油红O染色也显示耐药细胞株脂质含量更高。这些表明增加的胞质ACSS2驱动了脂肪生成表型。

研究人员进一步探究了ACSS2调控的脂质合成如何介导耐药。外源性脂质补充实验显示，含有棕榈酸盐和油酸盐的游离脂肪酸混合物（FFAs）可恢复ACSS2i诱导的EGFR降解，但胆固醇无此能力。同样，FFAs而非胆固醇可抵消ACSS2i诱导的EGFR泛素化。剂量依赖的棕榈酸盐，而非油酸盐，可逆转EGFR降解。酰基-生物素交换实验证实EGFR蛋白存在基础水平的棕榈酰化，且ACSS2i处理降低了EGFR的棕榈酰化，而过表达ACSS2则增强了EGFR的棕榈酰化，该作用可被蛋白质棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸盐逆转。泛素化动态分析显示，ACSS2i增加了EGFR的泛素化水平；棕榈酸盐共处理可降低泛素化至基础水平；而2-BP则消除了棕榈酸盐介导的保护作用。这一代谢检查点确立了ACSS2作为棕榈酰化的调节器，通过从头脂肪生成的乙酰辅酶A通量产生棕榈酸盐，从而保护EGFR免于蛋白酶体降解。

3.5. ACSS2是克服乐伐替尼耐药的治疗靶点

在皮下移植瘤模型和水动力转染诱导的HCC小鼠模型中，乐伐替尼与ACSS2抑制剂的联合治疗均显示出比任一单药治疗更显著的肿瘤生长抑制效果。免疫组化染色显示，ACSS2i下调了EGFR表达，联合治疗显著增加了细胞凋亡指数。这些数据表明，ACSS2抑制剂能有效克服HCC模型中的乐伐替尼耐药。

3.6. ACSS2表达和¹¹C-乙酸PET/CT可作为预测HCC对乐伐替尼反应的潜在方法

对74例HCC组织的免疫组化分析显示，ACSS2与EGFR表达呈显著正相关。由于¹¹C-乙酸摄取与HCC中ACSS2表达密切相关，研究人员发现耐药细胞对外源性¹⁴C-乙酸的摄取显著高于亲本细胞。对19例术前接受¹¹C-乙酸和¹⁸F-FDG PET/CT的HCC患者组织的qRT-PCR分析显示，在乙酸代谢相关的7个基因中，只有ACSS2水平与¹¹C-乙酸PET/CT的最大标准化摄取值显著相关。此外，在34例HCC组织中，ACSS2和EGFR的IHC评分与¹¹C-乙酸SUV_max呈正相关，但与¹⁸F-FDG摄取无显著相关性。这些发现提示，¹¹C-乙酸PET/CT可能作为一种潜在工具，用于识别更可能对乐伐替尼治疗有反应的HCC患者。

四、讨论与结论

讨论总结：

代谢重编程不仅是肿瘤进展的能量和物质基础，也驱动肿瘤可塑性，使其适应外部环境并介导耐药。本研究证实，在乐伐替尼耐药发展过程中，丙酮酸代谢被激活，ACSS2表达增加。ACSS2驱动的胞质乙酰辅酶A水平升高促进了脂质合成，从而增强了EGFR的棕榈酰化。这一过程拮抗了泛素化介导的降解，维持了EGFR蛋白稳定性。值得注意的是，乐伐替尼与ACSS2抑制相结合可有效抑制耐药肿瘤